JPH0133480B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、治療に有利なペプチドに関する。 該ペプチドは以下のアミノ酸配列により表わさ
れる。 Ｙ−Gly−Leu−Ala−Ｘ−（Gly）ｎ （ここで、Ｘはアミジノ置換α−アミノ酸である
Arg又はCanであり； Ｙは Leu； His−Leu； Ser−His−Leu； Ala−Ser−His−Leu； CH₃CO−Ala−Ser−His−Leu； Arg−Gln−His−Ala−Arg −Ala−Ser−His−Leu； Ala−Ala−Ala−Leu； Ala−Ala−Leu； Ala−Leu； Asn−Lys−Pro−Leu； CH₃CO−Leu； CH₃CO−His−Leu； CH₃CO−Ala−Leu； 及び CH₃CO−Ala−Ala−Ala−Leu； から成る群から選択されるものの１つであり；ｎ
は０又は１である。） 本発明の化合物は平滑筋収縮作用、マスト細胞
からのヒスタミン放出作用、血管壁透過性増大作
用を有するうえ、有用な治療剤である。また後に
説明する如く本発明化合物の一部はこれと逆の作
用を有するゆえ、有用な治療剤である。すなわち
本発明化合物の一部は促進剤または助長剤であり
他は拮抗剤または抑制剤である。これら化合物の
一部は心臓不整脈の治療に有用である。 該ペプチドのカルボキシル端はアミジノ置換さ
れたα−アミノ酸たとえばアルギニンまたはカナ
ヴアニンである。 アルギニン又はカナバニンに直接結合されるア
ミノ酸としては、グリシン又はアラニンが好まし
い。 ペプチド中の第三のアミノ酸はそのカルボキシ
ル基により第二のアミノ酸のアミノ基に接続され
る。第三のアミノ酸は疎水性アミノ酸であるロイ
シンである。このアミノ酸はＬ型及びＤ型の両者
で入手可能であり、且つペプチドの活性に満足す
る寄与するため好ましい。 第四のアミノ酸の種類は重要ではないが、有用
な活性を得るためには第四のアミノ酸の存在が必
要である。通常の20種のアミノ酸の大部分が使用
可能であると考えられるが、グリシンである場合
に最高度の活性が得られる。 第五の疎水性アミノ酸はロイシンである。この
ロイシンの存在によりペプチドの活性は著しく増
加する。 ペプチド鎖がアミノ酸13個迄長くなるにつれ活
性が増加することが認められた。しかしアミノ酸
構成部分が更に多いペプチドの合成のコストはこ
の結果得られる軽度の性能改善に対して引合わな
いと考えられる。； 第一アミノ酸がアルギニン又はカナバニンであ
る本発明化合物は促進剤である。もしこのアルギ
ニン又はカナバニンがそのカルボキシル基により
低級脂肪族アミノ酸であるグリシンのアミノ基に
結合している場合は、得られる本発明の化合物は
抑制剤である。かかる化合物は低投与量レベルに
おいて平滑筋収縮、ヒスタミン放出及び血管透過
性を抑制する。アルギニン又はカナバニンに結合
されるアミノ酸を抑制アミノ酸と呼ぶ。本発明の
化合物における抑制アミノ酸はグリシンである。
グリシンは入手が容易であり、しかも新しい非対
称中心を加えることなく分子内に導入しうる。 尚、本発明のペプチドはその構成成分Ｌ−アミ
ノ酸をＤ−アミノ酸に代えた場合、例えば、Ｌ−
アルギニンの代りにＤ−アルギニンを使用した幾
つかの化合物はカルボキシペプチダーゼＢの加水
分解作用に抵抗性があり、従つて、長時間作用調
剤の調製に使用しうる。 本発明化合物はその両性性質のため金属塩また
は酸付加塩等の薬学的に受容し得る形で使用しう
る。これら塩は水溶性である利点を有し、非経口
投与に特に有用である。金属塩特にアルカリ金属
塩は比較的安定であり酸付加塩より好ましいこと
が多い。ナトリウム塩は製造が容易なるため特に
好ましい。 本発明の化合物の酸付加塩の調製に使用される
酸は非毒性のアニオンを含む酸であり、たとえば
塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、乳酸、クエン酸、酒
石酸、シユウ酸、コハク酸、マレイン酸、グルコ
ン酸、糖酸等を含む。全体として本発明のポリペ
プチドの広範囲の非毒性誘導体が有用に利用しう
る。例えばこれら化合物、特にグリシンのカルボ
キシル基端末を有する化合物は塩化チオニルと反
応して酸クロリドを形成し、またこれはアンモニ
アと反応してアミドを形成する。またアミン類は
無論Ｎ置換アミドを形成する。 本発明の化合物は遊離アミノ基がCH₃CO−で
あるアルカノイル基でアシル化されたペプチドを
包含する。 本発明の化合物は現在単純なおよび複雑なポリ
ペプチドならびに比較的低分子量のプロテインの
合成に利用しうる広範囲の技術により合成しう
る。一般にこれら技術は段階的に合成を行なつて
アミノ酸を順次付加し次第により大きい分子を得
るものである。各アミノ酸は一者のカルボキシル
基と他者のアミノ基とを縮合させペプチド結合を
形成することにより相互に結合される。この反応
を制御するためには一方のアミノ酸のアミノ基と
他方のアミノ酸のカルボキシル基を封止すること
が必要である。封止基は形成されたペプチド結合
の加水分解またはラセミ化によりポリペプチドに
悪影響を与えることなく容易に除去しうるよう選
択されねばならない。ある種のアミノ酸たとえば
セリンは水酸基の如き付加的な官能基を有する。
かかる官能基を容易に除去しうる封止剤で封止し
ペプチド結合形成縮合反応に干渉しないようにす
ることが通常必要である。 従来技術においてポリペプチド合成のため多数
の方法が考案され多数の封止剤が案出されてい
る。これら方法の大部分は本発明に属するポリペ
プチドにも応用しうる。これら方法すべての応用
を説明することは無用であろう。適当な方法は実
施例中に記載されている。 本発明の化合物の合成に好ましい方法はメリフ
イード法である。この方法においてはアミノ酸は
エステル結合として樹脂粒子に固定され、ペプチ
ドは保護されたアミノ酸を生長鎖に順次付加する
ことにより形成される。この方法は公知であり多
数の公知文献に記載され、たとえばニユーヨー
ク・アカデミツク・プレス発行、ニユーラスおよ
びヒル著の「ザ・プロテインズ」（1976）中のビ
ー・ダブリユー・エリクソンおよびアール・ビ
ー・メリフイールドの固体ペプチド合成P.255〜
527中に記載されている。 本発明の説明の便宜上、各種アミノ酸に対する
通常の略記法を使用する。この略記法は専問家に
は公知のものであるが、確認のため本発明に関係
する主要アミノ酸を下記に示す： アルギニン Arg アラニン Ala ロイシン Leu グリシン Gly ヒスチジン His セリン Ser グルタミン Gln 上記のごとく、本発明の化合物は促進剤として
平滑筋の収縮を強め、ヒスタミン放出を助け、血
管透過性を増大させる。従つて、かかる化合物は
抗炎症作用を欠く哺乳動物にかかる反応を誘起さ
せることができ、治療的に有用である。従つて、
該化合物は体内において病源菌等の侵入に対する
防禦機構の形成を促進するのに使用しうる。ま
た、本願発明の化合物は抑制剤として局処的また
は組織的な偶発性または外因性の平滑筋収縮、ヒ
スタミン放出または血管透過性昂進に対し臨床的
に有効である。これは、例えば、ぜんそくまたは
気管支アレルギーの発作に対する鼻用エアロゾル
として使用しうる。これはまたデング熱に伴なう
シヨツク等の症状の予防に使用しうる。 本発明の化合物は、哺乳動物に対し有用な治療
剤であり、非常に少量で促進および抑制作用を発
揮する。特定用途に対する最適投与量は内科医ま
たは獣医により決定されよう。投与量は対象例ご
とに異なり、患者の体重、被処置症状および専問
家が評価しうるその他の因子により定まる。該化
合物は多量、たとえば１日当り２グラムまたはそ
れ以上に投与してもよい。通常は、有効成分約
250mg以下の投与単位で投与される。１日当り投
与される単位数は、被処置症例の条件により異な
る。 該化合物は単独で使用してもよいが、通常は薬
学的に許容しうる非毒性担体とともに投与され、
その割合は特定の担体の許容性および化学的性
質、選択される投与経路、および標準的な薬学上
の慣習により決定される。静脈内または筋肉内投
与においては、該化合物は他の溶質たとえば等張
性を与えるための塩類またはグリコースを含む滅
菌溶液として使用しうる。局処投与の場合には、
該化合物は適当な担体たとえばワセリンまたは他
の不活性半粘稠物質とともに使用しうる。また、
腸内投与用に被覆された投与単位もデン粉、乳
糖、クレー等の賦形剤を含む錠剤またはカプセル
として使用しうる。 第１アミノ酸としては、アミノジ置換α−アミ
ノ酸であるアルギニン又はカナバニンが使用され
るが、これらのうち、アルギニンが好ましい。こ
れらはオメガ・アミジノ基〔−Ｃ（＝NH）−
NH₂〕の存在のため、すべてアルギニン類似体
を考えることができる。 以下、例示の目的で本発明の実施例を説明す
る。 例 １ Ｌ−アラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−ヒスチジル−
Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−アルギニンの合成 Nα−第三級ブチロキシカルボニル−N^g−（４
−トルエンスホニル）−Ｌ−アルギニル・オキシ
メチル−（スチレン−共重合１％ジビニルベンゼ
ン）（）の調製。N〓−第三級ブチロキシカルボ
ニル−N^g−（４−トルエンスルホニル）−Ｌ−ア
ルギニン（1.3ｇ）をエタノール（15ml）および
水（1.35ml）中に溶解した溶液に重炭酸セシウム
（0.43ｇ）を水（1.35ml）に溶解した溶液を添加
し、PHを7.1に調整する。得られる溶液を減圧下
40℃において蒸発乾涸する。ベンゼン（25ml）を
加え、混合物を同一条件下に蒸発乾涸する。この
方法をさらに四回反復する。得られる固形物を圧
力１トルで2.5時間乾燥してBoc−Arg（Tos）
（）のセシウム塩を白色固形物（1.7ｇ）として
得る。クロロメチル−（スチレン−共重合１％ジ
ビニルベンゼン）（3.5ｇ；ポリスチレン１ｇ当り
Cl0.23ミリモル）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド（DMF；15ml）中で膨潤させ、塩（1.7ｇ）
をDMF10ml中に溶解させた溶液と混合する。こ
の混合物を機械的に撹拌しつつ50℃に75時間維持
する。塩（3.7ｇ）をDMF（25ml）に溶解させ
た溶液を添加し、混合物を撹拌しつつ50℃に95時
間維持する。樹脂を焼結ガラス漏斗上に回収し、
DMF（25ml、３回）、無水エタノール（25ml、３
回）およびジクロロメタン（25ml、３回）で順次
洗滌する。圧力１トルで２時間乾燥ののち、樹脂
（3.3ｇ）はポリスチレン１ｇ当りアルギニン
0.17ミリモルを含有する。これは10mgの試料を10
％量のアニソールとともに液状HFで０℃におい
て30分間処理し、酸溶性物質を6NHClを用いて
110℃において24時間加水分解させ、加水分解物
のアミノ酸分析の結果確認されたものである。 N〓−第三級ブチロキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニル−O〓−ベンジル−Ｌ−セリル−N^im（４−ト
リエンスルホニル）−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−ロイ
シル−グリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アラニル−
N^g−（４−トリエンスルホニル）−Ｌ−アルギニ
ルオキシメチル（スチレン共重合１％ジビニルベ
ンゼン）（）の調製。前記BOc−Arg（Toc）樹
脂（2.0ｇ；アルギニル0.34ミリモル）を焼結
ガラス円板を有する75mlガラス反応容器中におい
てジクロロメタン（40ml）中で膨潤させる。該容
器に空気または窒素の圧力を加え、かつ（また
は）該ガラス円板下方の出口を減圧にして溶液の
下部分が除去されるまで樹脂の過を行なう。 Ａ 保護除去ステツプはトリフルオロ酢酸とジク
ロロメタンの１：１（Ｖ／Ｖ）溶液（40ml）を
容器に添加し、混合物を１分間撹拌し、前と同
様に過することにより行なわれる。ついでト
リフルオロ酢酸とジクロロメタンの１：１
（Ｖ／Ｖ）溶液を再び添加し、混合物を３０分
間撹拌し過を行なう。 Ｂ 洗出ステツプは同様に樹脂をジクロロメタン
（40ml×５、各１分間）、２−プロパノール（40
ml×２、各１分間）およびジクロロメタン（40
ml×５、各１分間）で順次洗滌することにより
行なわれる。 Ｃ 中和ステツプは樹脂をエチルジイソプロピル
アミンとジクロロメタンの１：19（Ｖ／Ｖ）混
合物（40ml×３、各２分間）で洗滌することに
より行なわれる。 Ｄ 洗出ステツプＢを反復する。 Ｅ カプリングステツプは樹脂に希望のBocアミ
ノ酸（最初のアルギニン１ミリモルに対し３ミ
リモル）のジクロロメタン溶液（10ml）を添加
し、２分間撹拌し、この混合物をＮ，N¹−ジ
シクロヘキシルカルボジイミド（最初のアルギ
ニン１ミリモルに対し３ミリモル）のジクロロ
メタン溶液（10ml）に加え、30分間混合し、
過することにより行なわれる。 Ｆ 洗出ステツプＢを反復する。 Ｇ 中和ステツプＣを反復する。 Ｈ 洗出ステツプＢを反復する。 Ｉ カプリングステツプＥを反復する。 Ｊ 洗出ステツプＢを反復する。 ステツプＡないしＪの実施により合成の１サイ
クルが実施され、これにより保護されたアミノ酸
残基がペプチドに結合される。このサイクルは初
めBoc−Ｌ−アラニンを用いて行ない、ついで
Boc−Ｌ−ロイシン、Boc−グリシン、Boc−Ｌ
−ロイシン、Boc−L^im−（４−トルエンスチルホ
ニル）−Ｌ−ヒスチジン、Boc−O〓−ベンジル−
Ｌ−セリンおよびBoc−Ｌ−アラニンを順次用い
て実施する。但しBocとはN〓−第三級ブチロキ
シカルボニルを意味する。 Ｌ−アラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−ヒスチジル−
Ｌ−ロイシル−グリシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ア
ラニル−Ｌ−アルギニン（）の保護除去および
精製。保護されたオクタペプチド樹脂（0.26
ｇ）を10％量のアニソールと共に液状HF（６ml）
中で０℃において１時間処理する。HFをアスピ
レータ次いで真空ポンプにより蒸発させたのち樹
脂をエーテル（２ml×３）で洗つてアニソールを
除去し、次いでトリフロロ酢酸（２ml×５）で洗
いペプチドを除去する。トリフロロ酢酸を蒸発
させたのち、残渣を５％酢酸水溶液に溶解し、凍
結真空乾燥してペプチドを得、これを１％酢酸水
溶液（２ml）に溶解し、バイオゲルＰ−２（100〜
200メツシユ、バイオラツド社）の2.5×100cmカ
ラムに吸着させ、１％酢酸を毎時23mlの速度で送
入する。ニンヒドリン陽性主ピーク（175〜300
ml）を集め真空凍結乾燥する。残渣の一部（19
ml）を0.01MNaCl、0.01MNaHPO₄（PH4.5；1.5
ml）に溶解し、カルボキシメチルセルロース（セ
レツクスCM、バイオラツド社）の１×50cmカラ
ムに吸着させ、NaCl濃度を0.01から0.20Mまでに
直線的に変化させつつ毎時30mlの速度で送液を行
なう（両溶液100ml、０，01MNaH₂PO₄；PH
4.5）。206nｍの紫外吸収により検出される主ペプ
チドピーク（130〜170ml）を集め凍結真空乾燥す
る。塩およびロイシンの残渣を１％酢酸（２ml）
に溶解し、バイオゲルＰ−２の1.5×85cmカラム
上において１％酢酸を毎時15ml送液して脱塩す
る。206nｍの吸収により検出される主ペプチド
ピーク（50〜75ml）を集め凍結真空乾燥すると純
粋なオクタペプチド（10ml）が得られる。この
物質は予想通りのアミノ酸分析結果（第１表）を
与え、また自動エドマン分解法によりアミノ酸連
鎖も予想通りであることが認められた。該物質は
トブタノール：水：ピリジン；酢酸（容積比15：
12：10：３）で展開したクロマトグラフイにおい
て１個のニンヒドリン陽性スポツトを示し（ヴア
リンRf値0.64に対しRf値0.73）、また高圧電気泳
動において１個のポーリー陽性スポツトを示した
（PH5.0においてR_Arg0.76、またPH6.4においてR_Arg
0.58、但しR_Argはペプチドとブアリンのスポツ
ト中心間の距離をアルギニンとヴアリンのスポツ
ト中心間の距離で割つた値）。 第１、２表記載の他のペプチドはそれぞれ実質
上同一の方法で調製された。 （第１表中、No.１のペプチド（Gly−Leu−Ala
−Arg）については参考例する。）

【表】

【表】 平滑筋収縮活性について、ペプチドAla−Ser
−His−Leu−Gly−Leu−Ala−Arg−Glyは、
50μｇまでは、その促進活性を示さなかつた。こ
れは、アルギニンに結合したグリシンを有さない
対応するペプチド（促進剤）に比較して、その促
進活性が100倍劣ることを意味する。 平滑筋試験において、グリシンを有する上記ペ
プチド（抑制剤）を、グリシンを有さない対応す
る促進剤ペプチドの添加に先立つて加えた。結果
は、10μｇの抑制剤は、50％以上促進活性を阻害
した。さらに、50μｇの抑制剤（5.7×10^-6M）
は、完全に促進活性を阻害した。すなわち、促進
剤ペプチドのアルギニンのカリボキシル基をグリ
シンでブロツクすることにより、抑制活性を示す
よるになることが、上記試験により明らかとなつ
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 以下のアミノ酸配列により表わされるペプチ
   ド。 Ｙ−Gly−Leu−Ala−Ｘ−（Gly）ｎ （ここで、Ｘはアミジノ置換α−アミノ酸である
   Arg又はCanであり； Ｙは Leu； His−Leu； Ser−His−Leu； Ala−Ser−His−Leu； CH₃CO−Ala−Ser−His−Leu； Arg−Gln−His−Ala−Arg −Ala−Ser−His−Leu； Ala−Ala−Ala−Leu； Ala−Ala−Leu； Ala−Leu； Asn−Lys−Pro−Leu； CH₃CO−Leu； CH₃CO−His−Leu； CH₃CO−Ala−Leu； 及び CH₃CO−Ala−Ala−Ala−Leu； から成る群から選択されるものの１つであり；ｎ
   は０又は１である。）