JPH0135638B2 - - Google Patents
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Description
本発明はプラスミドDNAの遺伝子産物の製法
を提供するもので、該製法において有用な細菌類
ならびにプラスミド類、該製法において有用な組
み換えDNAプラスミド類の組立てに利用し得る
クローニング・ベクター類、およびそのような細
菌類、プラスミド類ならびにクローニング・ベク
ター類の製法に関する。 所望のポリペプチドや蛋白質を暗号する遺伝子
をもつプラスミドを保持する細菌類の培養によつ
て、有用なポリペプチドおよび蛋白質、たとえば
酵素、ホルモンならびに（たとえばワクチン製造
用の）毒素および他の抗原を製造することが知ら
れている。また、所望の遺伝子を含有するプラス
ミド類を、いわゆるDNA組み換え技術によつて
組立て、そのような組み換えDNAプラスミド類
を有する細菌の培養物から、宿主細胞として用い
られた細菌以外の生物体に固有の遺伝子産物を得
ることが可能となることも知られている。組み換
えDNAの調製に際し、いわゆるクローニング・
ベクターすなわち宿主細菌中において増殖し得る
プラスミドが所望の単一もしくは複数の産物を暗
号する単一もしくは複数の遺伝子を含むDNAフ
ラグメントと結合される。 DNA組み換え技術はそのもつとも有用な態様
においては下記の原理に基ずいている。 DNAは制限エンドヌクレアーゼ（restriction
endonuclease）により非常に特殊な方法で細分
割できる。これらの分割片は次いでDNAリガー
ゼ（ligase）によつて互いに結合できる。DNA
クローニングには単一のもしくは数個の制限エン
ドヌクレアーゼに対し一作用部位のみを含む環状
DNA分子であるプラスミド・ベクターが利用さ
れる。制限酵素によるそのようなベクターの処理
により、鎖状分子の１種が生成する。もし、この
分子が同一エンドヌクレアーゼで処理された
DNA試料と混合されると、異種DNAフラグメン
トが融合されているベクターによつて構成された
分子を連結（ligation）によつて得ることが可能
となる。これらのプラスミド分子は組み換え
DNAと呼ばれている。異種DNAをもつベクター
は宿主細菌細胞中に形質転換できるが、このこと
は宿主細菌によつてそれが取り込まれ、その中に
複製されていることを意味する。ベクターが複製
可能であるから異種DNAもまた複製可能である。 異種DNAが宿主細菌中に転写されさらに翻訳
されれば異種DNAの遺伝子産物が宿主細菌中に
生成する。この生成は一般的には細胞当りの組み
換えDNAプラスミド分子のコピー数に比例する
遺伝子濃度に比例している。これは所望のプラス
ミドの遺伝子産物を大量に得るためには、細菌細
胞当りのプラスミドコピーの高いことを目ざさね
ばならないことを意味している。数種のクローニ
ング・ベクター類は、本態的に細菌細胞当りほぼ
100に達する程の高いコピー数（copy number）
で複製することが知られている。しかしながら、
もしそのようなクローニング・ベクターと結合す
る異種DNAによつて生成した遺伝子産物が宿主
細菌によつて充分耐性化されていないものであれ
ば、遺伝子産物によつて及ぼされる阻害のため、
所望の量産サイズの培養物まで細菌性クローンを
増殖させるのは困難であろう。一方、約20〜100
のオーダーのコピー数であつても、培養生産物中
の所望の遺伝子産物収量を必らずしも充分に上げ
得るとは限らない。プラスミドコピーの数が蛋白
合成の阻害たとえばクロラムフエニコールの添加
による増幅により一層増加しうることが知られて
いるが、蛋白合成がクローン化DNAの遺伝子産
物の調製に必要なごとく、増幅されたDNAはも
し蛋白合成阻害成分の再除去が可能ならば（それ
は必らずしも常に可能ではなく、また往々にして
複雑な操作を要するが）、それらの遺伝子産物の
形成に役立つだけであろう。 本発明はDNAプラスミド、就中、該プラスミ
ドが効果的なプラスミド増幅と大量のプラスミド
遺伝子産物取得を可能とするものであるような
DNAプラスミドの遺伝子産物（gene product）
の製法を提供するものである。本発明は、温度依
存性（dependent）のプラスミドコピー数パター
ンを有するプラスミド類、殊にそのプラスミドを
保持する宿主細菌がある一の温度において培養さ
れる場合にはコントロールされた一定のプラスミ
ドコピー数を示すが、プラスミドを保持する宿主
細菌が別の温度において培養される場合にはより
多数のもしくは全くコントロールされていないコ
ピー数を与える改変されたプラスミドコピー数パ
ターンを示すようなプラスミドを利用するもので
ある。従つて、そのようなプラスミドのコピー数
はある一つの温度では低く、このことはクローン
化プラスミドもしくはその遺伝子産物が宿主細菌
の成育を阻害するリスクを減少するのでひとつの
利点である。しかしながら、プラスミド量は簡易
な温度シフトによつて急速に増加でき、かくして
クローン化プラスミドとその遺伝子産物とが同時
に形成され、プラスミドの遺伝子産物の生成を急
速に促進することができる。 このように、本発明はプラスミドDNAの遺伝
子産物の製法を提供するものであり、該製法は、
宿主細菌をある一つの温度で培養する際にコント
ロールされた一定のプラスミド数を示し、かつそ
のプラスミドを保持する宿主細菌をある別の温度
で培養する際により多数かまたは全体にコントロ
ールされていないコピー数を与える改変したプラ
スミドコピー数コントロールを示すプラスミドを
有する細菌を、該プラスミドがより多数かまたは
全くコントロールされないコピー数を与える改変
したコピー数コントロールを示す温度下またはそ
れに近い（approaching）温度下での培養期間を
少なくとも含む条件下で、培養し、次いでその細
菌培養物からプラスミドの遺伝子産物を収得する
ことからなるものである。 本発明の要点は、温度調節されたプラスミドコ
ピー数パターンを有する特殊なタイプのプラスミ
ドの利用と、このタイプのプラスミドがある一の
温度において極めて多数複製された場合に、その
遺伝子産物の大量生産をもたらすという認識とに
ある。培養それ自体は問題の細菌種に適するもの
として知られている普通の栄養培地を含む通常の
技術を用いて適宜に行われ、また遺伝子産物の取
得も調製された個々の遺伝子産物の相同性
（identity）や固有性質（propeties）、宿主細菌の
性質等に適合する周知の方法に従つて行われる。
本発明の方法に特有かつ重要なことは、プラスミ
ドがより多数のもしくは全くコントロールされて
いないコピー数を与える改変されたコピー数パタ
ーンを示すような温度またはそれに近い温度での
培養の期間を少なくとも含む、云いかえればその
期間にプラスミドが多数のコピー数で複製され、
かつ始めて見出されたことであるが、その期間に
プラスミドの遺伝子産物が対応して大量形成され
る培養の期間を含んでの温度規制にある。 温度依存性プラスミドのコピー数パターンを有
するプラスミドは、温度依存性のコピー数パター
ンを示すクローニング・ベクターを用いる組み換
えDNA技術により調製されたものであり得るし、
また該プラスミドは所望の生産性のための遺伝子
を有する既存プラスミドの変異
（mutagenization）によつて得られるものであつ
てもよい。 上記の温度依存性プラスミドコピー数パターン
を示すプラスミドは、それらを詳述せるものはこ
れ迄のところ見当らないが、クローニング・ベク
ター類として有用なプラスミド類を含むいくつか
のこの種プラスミド類の調製を記述する下記実施
例から明らかとなろう。 ある一の温度では細胞当りコントロールされた
一定のコピー数をもち、かつ他の温度において
は、より多数のもしくは全くコントロールされて
いないコピー数〔以下においてはしばしば“爆発
的増殖”（runaway−replication）と称する〕を
もつ上記温度依存性のプラスミドコピー数パター
ンを示すプラスミドは、問題の宿主細菌中で自律
的増殖をすることが知られている既存のプラスミ
ドの変異誘起によつて調製することができる。既
知の諸原理に従い、変異処理は生体内もしくは試
験管内において行うことができ、実施例では従来
用いられている変異剤が出てくるけれども変異処
理の種類は限界的なものではないと推測される。
変異処理（及びもし変異処理が試験管内で行われ
た場合には変異処理されたマテリアルの宿主細菌
中への形質転換）の後、該細菌がある一の温度で
培養された場合にはプラスミドコピー数がコント
ロールされており別の温度で培養された場合には
プラスミドコピー数がより高いかもしくは全くコ
ントロールされていない細菌クローンが単離され
る。この単離操作は、プラスミドコピー数コント
ロールパターンのシフトがその間に求められてい
る２つの温度におけるスクリーニングをベースと
してできる。そのようなスクリーニングに有用な
一つの指針は、問題の宿主細菌に限定されないこ
とが知られている基質上においては、殊に特定温
度における成育阻害が多数のプラスミドのコピー
の生成および／または大量のそれらの遺伝子産物
の生成によるものであると思われる事実である。 爆発的増殖パターンを示すプラスミド変異体を
単離するより適切な方法は、しばしばプラスミド
がある一の温度では、一つのプラスミドコピー数
コントロールパターンを示すが、別の温度ではよ
り多数のコピー数を可能とするような異なるプラ
スミドコピー数コントロールパターンを示すプラ
スミドを保持する細菌性クローンが単離される第
１段階と、第１段階で得た変異株からプラスミド
が第２段階の（異なる）温度においてはより多数
のもしくは全くコントロールされていないコピー
数を示すようなプラスミド保持細菌性クローンを
取得する第２段階、とよりなる２段階変異処理法
を用いることであることが判明した。この操作
は、適切な選別技術、たとえば抗生物質の二重選
択などの適宜利用を可能とする： あるタイプのプラスミドコピー変異体は以下の
ような諸性質を有する：すなわち、低温度（たと
えば30℃）ではコピー数は親プラスミドのそれに
近いが高温度（たとえば40℃）ではコピー数は約
４倍大となる。そのような変異体を単離するのに
用いる適切な単離操作には、アンピシリンおよび
クロラムフエニコールに対する耐性が対応する耐
性酵素を暗号した遺伝子の濃度に比例するという
事実（Uhlin et Nordstrom、プラスミド第１
巻、1977）、およびアンピシリンは成育期にある
細菌のみを殺すという事実が利用される。 プラスミドR1drd−19を含む菌株（本株につい
ては以下に詳述する）は、アンピシリン約100μ
ｇ／ml及びクロラムフエニコール100μｇ／mlの
LAプレート上で単一の細胞耐性を示すことが判
明した。液体培地中でのこれら２種の抗生物質に
対する耐性はLAプレート上でのそれとほぼ同一
である。アンピシリンおよびクロラムフエニコー
ルに対する耐性は遺伝子濃度に比例する（Uhlin
et Nordstrom、プラスミド第１巻、1977）。こ
の効果はプラスミドR1drd−19のコピー数増加変
異株、いわゆるコピー変異株の単離に利用され
た。しかしながら静菌剤と殺菌剤との組合せは、
この選択方法が親プラスミドと非制限的（non−
conditional）コピー変異株との双方の簡易な相
互選別を可能とするので、異なる温度では異なる
コピー数をもつコピー変異株を単離するのにも使
用できる。以下の操作がもつとも適切なのである
ことが見出された。すなわち、コピー変異株は低
温度（30℃）では低コピー数のものとして存在
し、高温度（40℃）では高コピー数のものとして
存在することが推測される。（しかしながらその
操作はこのタイプのコピー変異株に限定されず、
他の存在し得るタイプの温度依存性コピー変異株
を単離するのにも用いることができる。） プラスミド含有細胞の培養物は30℃において培
養されそしてクロラムフエニコールが正常コピー
数のプラスミドを含有する細胞の成育が阻害され
る濃度（300μｇ／ml）まで添加される。30℃に
おいて高コピー数のプラスミドを含有する細胞は
アンピシリン（4000μｇ／ml）により殺滅され
る。生き残つた細胞は集められて温度を40℃まで
上げられる。40℃で高コピー数を有するプラスミ
ドを含有する細胞はアンピシリンプレート（500
〜2000μｇ／ml）上で選別される。生存細胞中い
くつかは温度依存性プラスミドのコピー変異株を
含有する。 上記方法で選別された細胞は、次いで再変異処
理にかけることができ、そしてこのようにして変
異させた細胞の中から第２の温度で爆発的
（runaway）挙動を呈する変異株を選別するため
の適切な方法が、低温度ではコントロールされた
一定のしかし増大したコピー数を示すがその複製
コントロール機構が再び変異に付されたことを示
す細胞を最初に選別することからなることが見出
された。 実施例中で例示した特定のプラスミド中に生じ
た特殊なタイプの変異は確実に未知であるが、し
かしこの変異の効果は、プラスミドによつて伝達
され、プラスミドコピー数コントロールに関与し
た蛋白質が変異により、高温度では不安定な形態
に修飾されるに到ることであると信ぜられる。本
発明のプラスミドのもつとも実際的な態様は、ク
ローニング・ベクターとして用いられる場合に、
実施例で記述せるクローニング・ベクターと同様
に、それ自身の中に温度依存性のコピー数挙動に
必要な全ての要素を含むものであることが明白で
あるが、変異が宿主細菌中において対応する温度
依存性のナンセンスサプレツサーと結合されたナ
ンセンスタイプのものである場合、たとえばプラ
スミドがアンバー変異株であり、宿主細菌が温度
依存性のアンバー抑制効果を示すものである場合
に、本発明の原理やそれによつてもたらされる利
益もまたおのずから明らかとなる。 プラスミドが爆発的挙動を示す温度は、プラス
ミドがコントロールされた一定のコピー数を示す
温度より高い温度であるとは限らないし、この逆
の状況もまたあり得る。もしコントロールされた
一定のコピー数を与える温度より低い温度で爆発
的増殖を示す変異株の調製が望まれる場合、選別
もしくはスクリーニング基準が相応して適用され
る。しかしながら、プラスミド含有細菌を培養す
ることによつて調製されるべき遺伝子産物がより
高温度で劣化されないものである場合は、プラス
ミドが爆発的増殖を示す温度はコントロールされ
た一定のプラスミドコピー数を与える温度より高
いものであることが望ましい。これが適用される
ときはプラスミドの増幅は、相対的にもつとも高
い細胞成育速度となるような同一条件下に進行す
る。各実施例に示したプラスミド類は、エシエリ
ヒア・コリによつて例示された中温性
（mesophilic）細菌中において、30℃で一定のコ
ントロールされたプラスミドコピー数ならびに40
℃における爆発的増殖を示すようにデザインされ
ている。これらのプラスミド類のデータから分か
るように、これらのプラスミドについて一定のコ
ントロールされたプラスミドコピー数が保持され
るのは32℃までであり、プラスミドが爆発的挙動
を示す温度は約36℃以上である。 本発明のもつとも興味深いプラスミド類は、あ
る温度においては適度に大であるが一定のコピー
数を示しまた別の温度では少なくとも20倍大のコ
ピー数を示すプラスミド類である。細胞死をきた
す全く爆発的な挙動が得られるか否かは、ある程
度は宿主細菌、および宿主細菌のプラスミドや高
濃度の遺伝子産物に対する耐性に左右される。 従つて、本発明は一方では、これまで得られな
かつた細胞毎に数千のオーダーに達するプラスミ
ドコピー数の取得、ならびにはじめて見出された
ことであるが、相当量の遺伝子産物の生産を保証
する高コピー数で培養する充分な成育世代数（通
常４〜６）間に付随するプラスミドの遺伝子産物
の高率生産を可能とする。他方、本発明は宿主細
菌や所望の遺伝子産物などのそれぞれについて固
有の諸条件に従い、各種の方法で利用可能なもつ
とも簡易なコピー数コントロールを提供する。す
なわち多くの場合、量産サイズの培養まで固体
（individuum）またはクローンからの細菌の増殖
は、増加するプラスミドや遺伝子産物濃度による
細菌の成育阻害を避けるため、プラスミドがコン
トロールされた一定のコピー数を示すような温度
もしくはその付近の温度で達成されることが望ま
しい。それ故、その温度は、プラスミドがより多
数のもしくは全くコントロールされていないコピ
ー数が可能となる改変されたコピー数コントロー
ルを示す温度へシフトすることができ、また適当
な生産期間経過後しばしば細菌の成育がプラスミ
ドおよび／またはそれらの遺伝子産物の生産によ
つて阻害されるまで、遺伝子産物の収穫が行われ
る。個々の条件によつて、量産培養は、遺伝子産
物を好収量で与える確実に安定した培養物が得ら
れるよう（それは次いで連続的もしくは間けつ的
にそれ自体公知の方法による培養物から収穫され
る）にプラスミドが改変されたコピー数コントロ
ールを示すがしかし宿主細胞は生存しかつなお増
殖しうる温度に近い温度で行われることが望まし
い。 本発明により得られるユニークなコントロール
可能性の１例は、所望の遺伝子産物としての温度
感受性蛋白質の製造である。その場合、細菌はプ
ラスミドコピー数がコントロールされかつ一定と
なる温度で量産サイズの培養物になるまで増殖さ
れ、さらにその後爆発（runaway）温度への温
度シフトによりプラスミドが増幅される。このプ
ラスミド増幅にひき続き、また細胞がなお成育し
かつ増幅可能である間に、再び温度を一定のコピ
ー数を与える低温度側へシフトし、そして生成し
た細胞あたりより多数のプラスミドを保持してい
る細菌が、この低温度において、問題の温度感受
性蛋白質の生産に用いられる。約30℃以上の温度
では生育可能でない生物は多数存在し、それらの
蛋白質は、そのためより高温度においては変性さ
れることが知られている。従つて、この温度規制
の実施態様は、該生物に固有の遺伝子産物が組み
変えDNA／クローニング技術によつて調製され
る場合に特に重要なことが分る。 以上に示した如く、爆発的増殖を含む特徴的な
温度依存性のコピー数挙動を示すプラスミドは、
所望の生産性に関する遺伝子を有するが特徴的な
爆発的行動はもたない親プラスミドからの変異処
理によつて誘導しうる。しかしながら、多くの実
際的目的のため量産培養で用いるプラスミドはク
ローニング・ベクターとして、特徴的な温度依存
性の爆発的増殖を示す適当なプラスミドを用いる
組み変えDNA技術によつて調製されたものであ
ろう。これは、在来の組み変えDNA技術の利点
と、温度規制及び細胞あたり極めて高いプラスミ
ドコピー数が得られるという利点とが組合わさ
れ、その結果、異種DNAフラグメントにより伝
達されたポリペプチドもしくは蛋白質の生産が増
幅されるものである。本発明のクローニング・ベ
クターを用いて得られる極めて大きなプラスミド
コピー数は、発生学的には問題の宿主細菌から比
較的に遠隔であるため、これ迄は全く生産され得
なかつたかもしくはいかなる程度においても充分
量は生産され得なかつた蛋白質の大量生産や任意
な適当量の生産をクローニング技術によつて可能
とすることを期待させる。従つて本発明のクロー
ニング・ベクターに関する部分は非常に重要な部
分である。 クローニング・ベクターとして有用であるため
には、プラスミドは少なくとも１種の制限エンド
ヌクレアーゼに対して、一つおよび一つだけのエ
ンドヌクレアーゼに感受性部位（site）を示さね
ばならず、該部位はこの部位に異種DNAのフラ
グメントを挿入したのち、生成した組み変え
DNAが自動的に増殖することを可能とし、本発
明の利点をあげるため温度依存性のコピー数パタ
ーンを示す能力を保有するものであるべきであ
る。 組み換えDNA技術に用いるのにもつとも適し
た制限エンドヌクレアーゼ類は、クローニング・
ベクターおよびDNAフラグメントの両者上にい
わゆる“付着端”（cohesive ends）、云いかえれ
ば塩基対（base pairing）を同一配列になし得る
相補的塩基配列をもつ分子末端において一重鎖領
域（single stranded regions）を与えるもので
ある。 実施例にみられる如く、制限エンドヌクレアー
ゼに対して１部位を有するクローニング・ベクタ
ー類が調製され、また一つの制限エンドヌクレア
ーゼに対する１部位と他の制限エンドヌクレアー
ゼに対するもうひとつの部位とを有するベクター
類も調製された。上記諸条件をみたすクローニン
グ・ベクター類を組立てる有利な方法としては、
温度依存性の爆発的増殖を示すより大きいプラス
ミドから、有用な制限エンドヌクレアーゼに感受
性の１部位のみを示す充分小サイズであつて、し
かもなお特定の温度依存性の増殖挙動に不可欠な
遺伝子を含有するに充分なサイズをもつた“ミニ
プラスミド”（miniplasmid）を調製する場合が
多い。そのようなミニプラスミド類は、より大き
なプラスミドから、自然突然変異によつて生成す
るかもしくは生体外で調製された（次いで形質転
換される）、親プラスミドのミニプラスミド誘導
体を保持する細菌性クローンを単離することによ
つて調製できる。所望のミニプラスミド類（もし
くはそれらを含有する細菌類）の単離は適切なよ
く知られたスクリーニング法および／または選別
方法によつて達成される。 原則として、理想的なクローニング・ベクター
は、望ましくない蛋白質の生産をコードした遺伝
子はできるだけ僅かしか含有していないものであ
る。しかしながら多くの目的のためには、プラス
ミドを保持する細胞の同定および／または選別に
有用ないわゆるマーカーを伝達する遺伝子を含有
するクローニング・ベクターが望ましい。もつと
も有用なマーカーは抗生物質耐性、たとえばアン
ピシリン耐性であり、これは宿主細菌中への組み
換えDNAの形質転換のための処理後、組み換え
プラスミドを受取つていない細菌の簡易な相互選
別を可能とするためである。しかしながら、マー
カーをもたないクローニング・ベクターもたとえ
ば、組み換えによつて挿入されるべき遺伝子が自
身内にマーカーを保持している場合等においては
有用なクローニング・ベクターたり得る。 クローニング・ベクターとして用いられる本発
明のプラスミドにマーカー、たとえば抗生物質耐
性の導入が望まれる場合、それ自体公知のDNA
フラグメントの転座（transposition）法によつ
て行われる。そのような転座の１例は、実施例５
に例示されている。マーカー機能を伝達する異種
DNAフラグメントを導入する他の方法は、組み
換えDNA技術によるものであろうが、これはク
ローニング・ベクター上の制限部位（restriction
site）を使い尽すので、クローニング・ベクター
が組み換えDNA技術に有用な少なくとも２つの
制限部位を有する場合においてのみ利用し得る。 本発明のクローニング・ベクター調製の他の実
施態様は、変異により、所望の生物内で充分作動
することが知られている既存のクローニング・ベ
クター中に、たとえばE.coli中で充分確立された
クローニング・ベクターであるプラスミド
PSC101中に上述の温度依存性の爆発的増殖を変
異によつて導入することである。 実施例でも用いられた方法 数種のエシエリヒア・コリＫ−12株（第１表）
およびプラスミド（第２表）が用いられた。 用いた実験法は、微生物遺伝学（J.ミラー、メ
ソツズ イン モレキユラー バイオロジイ、コ
ールドスプリング、ハーバー研究所）および遺伝
子工学（T.田中およびB.バイスブルム、J.バクテ
リオロジイ、第212巻（1975）354〜362）に用い
られた標準法であつた。
を提供するもので、該製法において有用な細菌類
ならびにプラスミド類、該製法において有用な組
み換えDNAプラスミド類の組立てに利用し得る
クローニング・ベクター類、およびそのような細
菌類、プラスミド類ならびにクローニング・ベク
ター類の製法に関する。 所望のポリペプチドや蛋白質を暗号する遺伝子
をもつプラスミドを保持する細菌類の培養によつ
て、有用なポリペプチドおよび蛋白質、たとえば
酵素、ホルモンならびに（たとえばワクチン製造
用の）毒素および他の抗原を製造することが知ら
れている。また、所望の遺伝子を含有するプラス
ミド類を、いわゆるDNA組み換え技術によつて
組立て、そのような組み換えDNAプラスミド類
を有する細菌の培養物から、宿主細胞として用い
られた細菌以外の生物体に固有の遺伝子産物を得
ることが可能となることも知られている。組み換
えDNAの調製に際し、いわゆるクローニング・
ベクターすなわち宿主細菌中において増殖し得る
プラスミドが所望の単一もしくは複数の産物を暗
号する単一もしくは複数の遺伝子を含むDNAフ
ラグメントと結合される。 DNA組み換え技術はそのもつとも有用な態様
においては下記の原理に基ずいている。 DNAは制限エンドヌクレアーゼ（restriction
endonuclease）により非常に特殊な方法で細分
割できる。これらの分割片は次いでDNAリガー
ゼ（ligase）によつて互いに結合できる。DNA
クローニングには単一のもしくは数個の制限エン
ドヌクレアーゼに対し一作用部位のみを含む環状
DNA分子であるプラスミド・ベクターが利用さ
れる。制限酵素によるそのようなベクターの処理
により、鎖状分子の１種が生成する。もし、この
分子が同一エンドヌクレアーゼで処理された
DNA試料と混合されると、異種DNAフラグメン
トが融合されているベクターによつて構成された
分子を連結（ligation）によつて得ることが可能
となる。これらのプラスミド分子は組み換え
DNAと呼ばれている。異種DNAをもつベクター
は宿主細菌細胞中に形質転換できるが、このこと
は宿主細菌によつてそれが取り込まれ、その中に
複製されていることを意味する。ベクターが複製
可能であるから異種DNAもまた複製可能である。 異種DNAが宿主細菌中に転写されさらに翻訳
されれば異種DNAの遺伝子産物が宿主細菌中に
生成する。この生成は一般的には細胞当りの組み
換えDNAプラスミド分子のコピー数に比例する
遺伝子濃度に比例している。これは所望のプラス
ミドの遺伝子産物を大量に得るためには、細菌細
胞当りのプラスミドコピーの高いことを目ざさね
ばならないことを意味している。数種のクローニ
ング・ベクター類は、本態的に細菌細胞当りほぼ
100に達する程の高いコピー数（copy number）
で複製することが知られている。しかしながら、
もしそのようなクローニング・ベクターと結合す
る異種DNAによつて生成した遺伝子産物が宿主
細菌によつて充分耐性化されていないものであれ
ば、遺伝子産物によつて及ぼされる阻害のため、
所望の量産サイズの培養物まで細菌性クローンを
増殖させるのは困難であろう。一方、約20〜100
のオーダーのコピー数であつても、培養生産物中
の所望の遺伝子産物収量を必らずしも充分に上げ
得るとは限らない。プラスミドコピーの数が蛋白
合成の阻害たとえばクロラムフエニコールの添加
による増幅により一層増加しうることが知られて
いるが、蛋白合成がクローン化DNAの遺伝子産
物の調製に必要なごとく、増幅されたDNAはも
し蛋白合成阻害成分の再除去が可能ならば（それ
は必らずしも常に可能ではなく、また往々にして
複雑な操作を要するが）、それらの遺伝子産物の
形成に役立つだけであろう。 本発明はDNAプラスミド、就中、該プラスミ
ドが効果的なプラスミド増幅と大量のプラスミド
遺伝子産物取得を可能とするものであるような
DNAプラスミドの遺伝子産物（gene product）
の製法を提供するものである。本発明は、温度依
存性（dependent）のプラスミドコピー数パター
ンを有するプラスミド類、殊にそのプラスミドを
保持する宿主細菌がある一の温度において培養さ
れる場合にはコントロールされた一定のプラスミ
ドコピー数を示すが、プラスミドを保持する宿主
細菌が別の温度において培養される場合にはより
多数のもしくは全くコントロールされていないコ
ピー数を与える改変されたプラスミドコピー数パ
ターンを示すようなプラスミドを利用するもので
ある。従つて、そのようなプラスミドのコピー数
はある一つの温度では低く、このことはクローン
化プラスミドもしくはその遺伝子産物が宿主細菌
の成育を阻害するリスクを減少するのでひとつの
利点である。しかしながら、プラスミド量は簡易
な温度シフトによつて急速に増加でき、かくして
クローン化プラスミドとその遺伝子産物とが同時
に形成され、プラスミドの遺伝子産物の生成を急
速に促進することができる。 このように、本発明はプラスミドDNAの遺伝
子産物の製法を提供するものであり、該製法は、
宿主細菌をある一つの温度で培養する際にコント
ロールされた一定のプラスミド数を示し、かつそ
のプラスミドを保持する宿主細菌をある別の温度
で培養する際により多数かまたは全体にコントロ
ールされていないコピー数を与える改変したプラ
スミドコピー数コントロールを示すプラスミドを
有する細菌を、該プラスミドがより多数かまたは
全くコントロールされないコピー数を与える改変
したコピー数コントロールを示す温度下またはそ
れに近い（approaching）温度下での培養期間を
少なくとも含む条件下で、培養し、次いでその細
菌培養物からプラスミドの遺伝子産物を収得する
ことからなるものである。 本発明の要点は、温度調節されたプラスミドコ
ピー数パターンを有する特殊なタイプのプラスミ
ドの利用と、このタイプのプラスミドがある一の
温度において極めて多数複製された場合に、その
遺伝子産物の大量生産をもたらすという認識とに
ある。培養それ自体は問題の細菌種に適するもの
として知られている普通の栄養培地を含む通常の
技術を用いて適宜に行われ、また遺伝子産物の取
得も調製された個々の遺伝子産物の相同性
（identity）や固有性質（propeties）、宿主細菌の
性質等に適合する周知の方法に従つて行われる。
本発明の方法に特有かつ重要なことは、プラスミ
ドがより多数のもしくは全くコントロールされて
いないコピー数を与える改変されたコピー数パタ
ーンを示すような温度またはそれに近い温度での
培養の期間を少なくとも含む、云いかえればその
期間にプラスミドが多数のコピー数で複製され、
かつ始めて見出されたことであるが、その期間に
プラスミドの遺伝子産物が対応して大量形成され
る培養の期間を含んでの温度規制にある。 温度依存性プラスミドのコピー数パターンを有
するプラスミドは、温度依存性のコピー数パター
ンを示すクローニング・ベクターを用いる組み換
えDNA技術により調製されたものであり得るし、
また該プラスミドは所望の生産性のための遺伝子
を有する既存プラスミドの変異
（mutagenization）によつて得られるものであつ
てもよい。 上記の温度依存性プラスミドコピー数パターン
を示すプラスミドは、それらを詳述せるものはこ
れ迄のところ見当らないが、クローニング・ベク
ター類として有用なプラスミド類を含むいくつか
のこの種プラスミド類の調製を記述する下記実施
例から明らかとなろう。 ある一の温度では細胞当りコントロールされた
一定のコピー数をもち、かつ他の温度において
は、より多数のもしくは全くコントロールされて
いないコピー数〔以下においてはしばしば“爆発
的増殖”（runaway−replication）と称する〕を
もつ上記温度依存性のプラスミドコピー数パター
ンを示すプラスミドは、問題の宿主細菌中で自律
的増殖をすることが知られている既存のプラスミ
ドの変異誘起によつて調製することができる。既
知の諸原理に従い、変異処理は生体内もしくは試
験管内において行うことができ、実施例では従来
用いられている変異剤が出てくるけれども変異処
理の種類は限界的なものではないと推測される。
変異処理（及びもし変異処理が試験管内で行われ
た場合には変異処理されたマテリアルの宿主細菌
中への形質転換）の後、該細菌がある一の温度で
培養された場合にはプラスミドコピー数がコント
ロールされており別の温度で培養された場合には
プラスミドコピー数がより高いかもしくは全くコ
ントロールされていない細菌クローンが単離され
る。この単離操作は、プラスミドコピー数コント
ロールパターンのシフトがその間に求められてい
る２つの温度におけるスクリーニングをベースと
してできる。そのようなスクリーニングに有用な
一つの指針は、問題の宿主細菌に限定されないこ
とが知られている基質上においては、殊に特定温
度における成育阻害が多数のプラスミドのコピー
の生成および／または大量のそれらの遺伝子産物
の生成によるものであると思われる事実である。 爆発的増殖パターンを示すプラスミド変異体を
単離するより適切な方法は、しばしばプラスミド
がある一の温度では、一つのプラスミドコピー数
コントロールパターンを示すが、別の温度ではよ
り多数のコピー数を可能とするような異なるプラ
スミドコピー数コントロールパターンを示すプラ
スミドを保持する細菌性クローンが単離される第
１段階と、第１段階で得た変異株からプラスミド
が第２段階の（異なる）温度においてはより多数
のもしくは全くコントロールされていないコピー
数を示すようなプラスミド保持細菌性クローンを
取得する第２段階、とよりなる２段階変異処理法
を用いることであることが判明した。この操作
は、適切な選別技術、たとえば抗生物質の二重選
択などの適宜利用を可能とする： あるタイプのプラスミドコピー変異体は以下の
ような諸性質を有する：すなわち、低温度（たと
えば30℃）ではコピー数は親プラスミドのそれに
近いが高温度（たとえば40℃）ではコピー数は約
４倍大となる。そのような変異体を単離するのに
用いる適切な単離操作には、アンピシリンおよび
クロラムフエニコールに対する耐性が対応する耐
性酵素を暗号した遺伝子の濃度に比例するという
事実（Uhlin et Nordstrom、プラスミド第１
巻、1977）、およびアンピシリンは成育期にある
細菌のみを殺すという事実が利用される。 プラスミドR1drd−19を含む菌株（本株につい
ては以下に詳述する）は、アンピシリン約100μ
ｇ／ml及びクロラムフエニコール100μｇ／mlの
LAプレート上で単一の細胞耐性を示すことが判
明した。液体培地中でのこれら２種の抗生物質に
対する耐性はLAプレート上でのそれとほぼ同一
である。アンピシリンおよびクロラムフエニコー
ルに対する耐性は遺伝子濃度に比例する（Uhlin
et Nordstrom、プラスミド第１巻、1977）。こ
の効果はプラスミドR1drd−19のコピー数増加変
異株、いわゆるコピー変異株の単離に利用され
た。しかしながら静菌剤と殺菌剤との組合せは、
この選択方法が親プラスミドと非制限的（non−
conditional）コピー変異株との双方の簡易な相
互選別を可能とするので、異なる温度では異なる
コピー数をもつコピー変異株を単離するのにも使
用できる。以下の操作がもつとも適切なのである
ことが見出された。すなわち、コピー変異株は低
温度（30℃）では低コピー数のものとして存在
し、高温度（40℃）では高コピー数のものとして
存在することが推測される。（しかしながらその
操作はこのタイプのコピー変異株に限定されず、
他の存在し得るタイプの温度依存性コピー変異株
を単離するのにも用いることができる。） プラスミド含有細胞の培養物は30℃において培
養されそしてクロラムフエニコールが正常コピー
数のプラスミドを含有する細胞の成育が阻害され
る濃度（300μｇ／ml）まで添加される。30℃に
おいて高コピー数のプラスミドを含有する細胞は
アンピシリン（4000μｇ／ml）により殺滅され
る。生き残つた細胞は集められて温度を40℃まで
上げられる。40℃で高コピー数を有するプラスミ
ドを含有する細胞はアンピシリンプレート（500
〜2000μｇ／ml）上で選別される。生存細胞中い
くつかは温度依存性プラスミドのコピー変異株を
含有する。 上記方法で選別された細胞は、次いで再変異処
理にかけることができ、そしてこのようにして変
異させた細胞の中から第２の温度で爆発的
（runaway）挙動を呈する変異株を選別するため
の適切な方法が、低温度ではコントロールされた
一定のしかし増大したコピー数を示すがその複製
コントロール機構が再び変異に付されたことを示
す細胞を最初に選別することからなることが見出
された。 実施例中で例示した特定のプラスミド中に生じ
た特殊なタイプの変異は確実に未知であるが、し
かしこの変異の効果は、プラスミドによつて伝達
され、プラスミドコピー数コントロールに関与し
た蛋白質が変異により、高温度では不安定な形態
に修飾されるに到ることであると信ぜられる。本
発明のプラスミドのもつとも実際的な態様は、ク
ローニング・ベクターとして用いられる場合に、
実施例で記述せるクローニング・ベクターと同様
に、それ自身の中に温度依存性のコピー数挙動に
必要な全ての要素を含むものであることが明白で
あるが、変異が宿主細菌中において対応する温度
依存性のナンセンスサプレツサーと結合されたナ
ンセンスタイプのものである場合、たとえばプラ
スミドがアンバー変異株であり、宿主細菌が温度
依存性のアンバー抑制効果を示すものである場合
に、本発明の原理やそれによつてもたらされる利
益もまたおのずから明らかとなる。 プラスミドが爆発的挙動を示す温度は、プラス
ミドがコントロールされた一定のコピー数を示す
温度より高い温度であるとは限らないし、この逆
の状況もまたあり得る。もしコントロールされた
一定のコピー数を与える温度より低い温度で爆発
的増殖を示す変異株の調製が望まれる場合、選別
もしくはスクリーニング基準が相応して適用され
る。しかしながら、プラスミド含有細菌を培養す
ることによつて調製されるべき遺伝子産物がより
高温度で劣化されないものである場合は、プラス
ミドが爆発的増殖を示す温度はコントロールされ
た一定のプラスミドコピー数を与える温度より高
いものであることが望ましい。これが適用される
ときはプラスミドの増幅は、相対的にもつとも高
い細胞成育速度となるような同一条件下に進行す
る。各実施例に示したプラスミド類は、エシエリ
ヒア・コリによつて例示された中温性
（mesophilic）細菌中において、30℃で一定のコ
ントロールされたプラスミドコピー数ならびに40
℃における爆発的増殖を示すようにデザインされ
ている。これらのプラスミド類のデータから分か
るように、これらのプラスミドについて一定のコ
ントロールされたプラスミドコピー数が保持され
るのは32℃までであり、プラスミドが爆発的挙動
を示す温度は約36℃以上である。 本発明のもつとも興味深いプラスミド類は、あ
る温度においては適度に大であるが一定のコピー
数を示しまた別の温度では少なくとも20倍大のコ
ピー数を示すプラスミド類である。細胞死をきた
す全く爆発的な挙動が得られるか否かは、ある程
度は宿主細菌、および宿主細菌のプラスミドや高
濃度の遺伝子産物に対する耐性に左右される。 従つて、本発明は一方では、これまで得られな
かつた細胞毎に数千のオーダーに達するプラスミ
ドコピー数の取得、ならびにはじめて見出された
ことであるが、相当量の遺伝子産物の生産を保証
する高コピー数で培養する充分な成育世代数（通
常４〜６）間に付随するプラスミドの遺伝子産物
の高率生産を可能とする。他方、本発明は宿主細
菌や所望の遺伝子産物などのそれぞれについて固
有の諸条件に従い、各種の方法で利用可能なもつ
とも簡易なコピー数コントロールを提供する。す
なわち多くの場合、量産サイズの培養まで固体
（individuum）またはクローンからの細菌の増殖
は、増加するプラスミドや遺伝子産物濃度による
細菌の成育阻害を避けるため、プラスミドがコン
トロールされた一定のコピー数を示すような温度
もしくはその付近の温度で達成されることが望ま
しい。それ故、その温度は、プラスミドがより多
数のもしくは全くコントロールされていないコピ
ー数が可能となる改変されたコピー数コントロー
ルを示す温度へシフトすることができ、また適当
な生産期間経過後しばしば細菌の成育がプラスミ
ドおよび／またはそれらの遺伝子産物の生産によ
つて阻害されるまで、遺伝子産物の収穫が行われ
る。個々の条件によつて、量産培養は、遺伝子産
物を好収量で与える確実に安定した培養物が得ら
れるよう（それは次いで連続的もしくは間けつ的
にそれ自体公知の方法による培養物から収穫され
る）にプラスミドが改変されたコピー数コントロ
ールを示すがしかし宿主細胞は生存しかつなお増
殖しうる温度に近い温度で行われることが望まし
い。 本発明により得られるユニークなコントロール
可能性の１例は、所望の遺伝子産物としての温度
感受性蛋白質の製造である。その場合、細菌はプ
ラスミドコピー数がコントロールされかつ一定と
なる温度で量産サイズの培養物になるまで増殖さ
れ、さらにその後爆発（runaway）温度への温
度シフトによりプラスミドが増幅される。このプ
ラスミド増幅にひき続き、また細胞がなお成育し
かつ増幅可能である間に、再び温度を一定のコピ
ー数を与える低温度側へシフトし、そして生成し
た細胞あたりより多数のプラスミドを保持してい
る細菌が、この低温度において、問題の温度感受
性蛋白質の生産に用いられる。約30℃以上の温度
では生育可能でない生物は多数存在し、それらの
蛋白質は、そのためより高温度においては変性さ
れることが知られている。従つて、この温度規制
の実施態様は、該生物に固有の遺伝子産物が組み
変えDNA／クローニング技術によつて調製され
る場合に特に重要なことが分る。 以上に示した如く、爆発的増殖を含む特徴的な
温度依存性のコピー数挙動を示すプラスミドは、
所望の生産性に関する遺伝子を有するが特徴的な
爆発的行動はもたない親プラスミドからの変異処
理によつて誘導しうる。しかしながら、多くの実
際的目的のため量産培養で用いるプラスミドはク
ローニング・ベクターとして、特徴的な温度依存
性の爆発的増殖を示す適当なプラスミドを用いる
組み変えDNA技術によつて調製されたものであ
ろう。これは、在来の組み変えDNA技術の利点
と、温度規制及び細胞あたり極めて高いプラスミ
ドコピー数が得られるという利点とが組合わさ
れ、その結果、異種DNAフラグメントにより伝
達されたポリペプチドもしくは蛋白質の生産が増
幅されるものである。本発明のクローニング・ベ
クターを用いて得られる極めて大きなプラスミド
コピー数は、発生学的には問題の宿主細菌から比
較的に遠隔であるため、これ迄は全く生産され得
なかつたかもしくはいかなる程度においても充分
量は生産され得なかつた蛋白質の大量生産や任意
な適当量の生産をクローニング技術によつて可能
とすることを期待させる。従つて本発明のクロー
ニング・ベクターに関する部分は非常に重要な部
分である。 クローニング・ベクターとして有用であるため
には、プラスミドは少なくとも１種の制限エンド
ヌクレアーゼに対して、一つおよび一つだけのエ
ンドヌクレアーゼに感受性部位（site）を示さね
ばならず、該部位はこの部位に異種DNAのフラ
グメントを挿入したのち、生成した組み変え
DNAが自動的に増殖することを可能とし、本発
明の利点をあげるため温度依存性のコピー数パタ
ーンを示す能力を保有するものであるべきであ
る。 組み換えDNA技術に用いるのにもつとも適し
た制限エンドヌクレアーゼ類は、クローニング・
ベクターおよびDNAフラグメントの両者上にい
わゆる“付着端”（cohesive ends）、云いかえれ
ば塩基対（base pairing）を同一配列になし得る
相補的塩基配列をもつ分子末端において一重鎖領
域（single stranded regions）を与えるもので
ある。 実施例にみられる如く、制限エンドヌクレアー
ゼに対して１部位を有するクローニング・ベクタ
ー類が調製され、また一つの制限エンドヌクレア
ーゼに対する１部位と他の制限エンドヌクレアー
ゼに対するもうひとつの部位とを有するベクター
類も調製された。上記諸条件をみたすクローニン
グ・ベクター類を組立てる有利な方法としては、
温度依存性の爆発的増殖を示すより大きいプラス
ミドから、有用な制限エンドヌクレアーゼに感受
性の１部位のみを示す充分小サイズであつて、し
かもなお特定の温度依存性の増殖挙動に不可欠な
遺伝子を含有するに充分なサイズをもつた“ミニ
プラスミド”（miniplasmid）を調製する場合が
多い。そのようなミニプラスミド類は、より大き
なプラスミドから、自然突然変異によつて生成す
るかもしくは生体外で調製された（次いで形質転
換される）、親プラスミドのミニプラスミド誘導
体を保持する細菌性クローンを単離することによ
つて調製できる。所望のミニプラスミド類（もし
くはそれらを含有する細菌類）の単離は適切なよ
く知られたスクリーニング法および／または選別
方法によつて達成される。 原則として、理想的なクローニング・ベクター
は、望ましくない蛋白質の生産をコードした遺伝
子はできるだけ僅かしか含有していないものであ
る。しかしながら多くの目的のためには、プラス
ミドを保持する細胞の同定および／または選別に
有用ないわゆるマーカーを伝達する遺伝子を含有
するクローニング・ベクターが望ましい。もつと
も有用なマーカーは抗生物質耐性、たとえばアン
ピシリン耐性であり、これは宿主細菌中への組み
換えDNAの形質転換のための処理後、組み換え
プラスミドを受取つていない細菌の簡易な相互選
別を可能とするためである。しかしながら、マー
カーをもたないクローニング・ベクターもたとえ
ば、組み換えによつて挿入されるべき遺伝子が自
身内にマーカーを保持している場合等においては
有用なクローニング・ベクターたり得る。 クローニング・ベクターとして用いられる本発
明のプラスミドにマーカー、たとえば抗生物質耐
性の導入が望まれる場合、それ自体公知のDNA
フラグメントの転座（transposition）法によつ
て行われる。そのような転座の１例は、実施例５
に例示されている。マーカー機能を伝達する異種
DNAフラグメントを導入する他の方法は、組み
換えDNA技術によるものであろうが、これはク
ローニング・ベクター上の制限部位（restriction
site）を使い尽すので、クローニング・ベクター
が組み換えDNA技術に有用な少なくとも２つの
制限部位を有する場合においてのみ利用し得る。 本発明のクローニング・ベクター調製の他の実
施態様は、変異により、所望の生物内で充分作動
することが知られている既存のクローニング・ベ
クター中に、たとえばE.coli中で充分確立された
クローニング・ベクターであるプラスミド
PSC101中に上述の温度依存性の爆発的増殖を変
異によつて導入することである。 実施例でも用いられた方法 数種のエシエリヒア・コリＫ−12株（第１表）
およびプラスミド（第２表）が用いられた。 用いた実験法は、微生物遺伝学（J.ミラー、メ
ソツズ イン モレキユラー バイオロジイ、コ
ールドスプリング、ハーバー研究所）および遺伝
子工学（T.田中およびB.バイスブルム、J.バクテ
リオロジイ、第212巻（1975）354〜362）に用い
られた標準法であつた。
【表】
シエント エシエリヒア・
コリ変異体”
コリ変異体”
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ プラスミド保持宿主細菌が一つの温度で培養
される場合はコントロールされた一定のプラスミ
ドコピー数を示すが、プラスミド保持宿主細菌が
より高い温度で成育される場合には少なくとも20
倍多数のもしくは全くコントロールされていない
コピー数を与える改変されたプラスミドコピー数
コントロールを示す組み換えDNAプラスミドで
あり、 この組換えDNAプラスミドが、上記のコピー
数コントロールを同様に示すクローニングベクタ
ーを、このクローニングベクターとは異種の
DNAに連結することによつて作製され、 かつ該クローニングベクターが、上記の改変さ
れたコピー数コントロールを示さないプラスミド
R1またはR1の誘導体を変異処理に付し、次いで
得られたプラスミドを含有し、一つの温度でコン
トロールされた一定のプラスミドコピー数を示し
かつより高い温度では少なくとも20倍多数のもし
くは全くコントロールされていないコピー数を与
える細菌クローンを、該細菌に対し非制限的であ
ることが知られている培地で前記細菌の発育を阻
害する性質によつて評価して選別することによ
り、得られるプラスミドか、またはこの得られた
プラスミド由来のプラスミドである組換えDNA
プラスミド。 ２ 前記プラスミドを保持する宿主細菌がより高
い温度で培養された際、全くコントロールされて
いないコピー数を与える改変されたプラスミドコ
ピー数コントロールを示す請求の範囲第１項記載
の組換えDNAプラスミド。 ３ ミニプラスミドである請求の範囲第１項また
は２項記載のプラスミド。 ４ プラスミドが、少なくとも一つの制限エンド
ヌクレアーゼに対し一つかつ一つだけの該エンド
ヌクレアーゼ感受性の作用部位を保持し、該作用
部位は、この作用部位における異種DNAのフラ
グメントの挿入後、生成する組み換えDNAプラ
スミドが自律的に複製可能であり、そのプラスミ
ドを保持する宿主細菌が一つの温度で培養される
場合にコントロールされた一定のプラスミドコピ
ー数を示すが、プラスミドを保持する宿主細菌が
より高い温度で成育される場合は、少なくとも20
倍多数のもしくは全くコントロールされていない
コピー数を与える改変されたプラスミドコピー数
を示す性能を保有している、ような作用部位であ
る、クローニング・ベクターとして有用なプラス
ミドであり、 かつ該プラスミドが、上記の改変されたコピー
数コントロールを示さないプラスミドR1または
R1の誘導体を変異処理に付し、次いで得られた
プラスミドを含有し、一つの温度でコントロール
された一定のプラスミドコピー数を示しかつより
高い温度では少なくとも20倍多数のもしくは全く
コントロールされていないコピー数を与える細菌
クローンを、該細菌に対し非制限的であることが
知られている培地で前記細菌の発育を阻害する性
質によつて評価して選別することにより、得られ
るプラスミドか、またはこの得られたプラスミド
由来のプラスミドであるクローニング・ベクター
として有用なプラスミド。 ５ 前記プラスミドを保持する宿主細菌がより高
い温度で培養される際、全くコントロールされて
いないコピー数を与える改変されたプラスミドコ
ピー数を示す請求の範囲第４項記載のプラスミ
ド。 ６ ミニプラスミドである請求の範囲第５項記載
のプラスミド。 ７ pKN402、DSM1228である請求の範囲第６
項に記載のプラスミド。 ８ pKN410、DSM1230である請求の範囲第６
項に記載のプラスミド。 ９ pKN403、DSM1229である請求の範囲第６
項に記載のプラスミド。 １０ 細菌が一つの温度で培養される場合はコン
トロールされた一定のプラスミドコピー数を示す
が、細菌がより高い温度で成育される場合には少
なくとも20倍多数のもしくは全くコントロールさ
れていないコピー数を与える改変されたプラスミ
ドコピー数コントロールを示す組み換えDNAプ
ラスミド保持細菌であり、 この組換えDNAプラスミドが、上記のコピー
数コントロールを同様に示すクローニングベクタ
ーを、このクローニングベクターとは異種の
DNAに連結することによつて作製され、 かつ該クローニングベクターが、上記の改変さ
れたコピー数コントロールを示さないプラスミド
R1またはR1の誘導体を変異処理に付し、次いで
得られたプラスミドを含有し、一つの温度でコン
トロールされた一定のプラスミドコピー数を示し
かつより高い温度では少なくとも20倍多数のもし
くは全くコントロールされていないコピー数を与
える改変されたコピー数コントロールを示す細菌
クローンを、該細菌に対し非制限的であることが
知られている培地で前記細菌の発育を阻害する性
質によつて評価して選別することにより、得られ
るプラスミドか、またはこの得られたプラスミド
由来のプラスミドである組換えDNAプラスミド
保持細菌。 １１ プラスミドが、このプラスミドを保持する
宿主細菌がより高い温度で培養された際、全くコ
ントロールされていないコピー数を与える改変さ
れたプラスミドコピー数コントロールを示す請求
の範囲第１０項記載の細菌。 １２ プラスミドがミニプラスミドである請求の
範囲第１０または１１項記載の細菌。 １３ プラスミドが少なくとも一つの制限エンド
ヌクレアーゼに対し一つかつ一つだけの該エンド
ヌクレアーゼ感受性の作用部位を保持するプラス
ミドから形成され、、該作用部位は、この作用部
位における異種DNAのフラグメントの挿入後、
生成する組み換えDNAプラスミドが自律的に複
製可能であり、このプラスミドを保持する宿主細
菌が一つの温度で培養される場合にコントロール
された一定のプラスミドコピー数を示すが、プラ
スミドを保持する宿主細菌がより高い温度で成育
される場合は、少なくとも20倍多数のもしくは全
くコントロールされていないコピー数を与える改
変されたプラスミドコピー数を示す性能を保有し
ている、ような作用部位である細菌であり、 かつ前記プラスミドが、上記の改変されたコピ
ー数コントロールを示さないプラスミドをR1ま
たはR1の誘導体変異処理に付し、次いで得られ
たプラスミドを含有し、一つの温度でコントロー
ルされた一定のプラスミドコピー数を示しかつよ
り高い温度では少なくとも20倍多数のもしくは全
くコントロールされていないプラスミドコピー数
を与える改変されたコピー数コントロールを示す
細菌クローンを、該細菌に対し非制限的であるこ
とが知られている培地で前記細菌の発育を阻害す
る性質によつて評価して選別することにより、得
られるプラスミドか、またはこの得られたプラス
ミド由来のプラスミドである請求の範囲第１１項
または１２項に記載の細菌。 １４ 中温性細菌であつて、その中でプラスミド
が32℃までの温度ではコントロールされた一定の
プラスミドコピー数を示すが、該プラスミドは36
℃以上の温度では少なくとも20倍多数のもしくは
全くコントロールされていないコピー数を与える
改変されたプラスミドコピー数コントロールを示
す請求の範囲第１０〜１３項の何れか１つに記載
の細菌。 １５ エシエリヒア・コリである請求の範囲第１
０〜１４項の何れか１つに記載の細菌。
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