JPH0136066B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトキソプラズマ、すなわち、直接的凝
集反応によつてトキソプラズマ症の診断を行なう
ためのトキソプラズマ抗原調整品の製造方法に関
する。 トキソプラズマゴンジ（Gondii toxoplasmas）
による急性の感染は血清試験によつて診断され
る。この感染の現在利用できる血清診断法には多
くの問題点があるのでこれに刺激されて他の方法
の研究が行なわれてきた。現時点では、生物学者
が利用できる方法は実行するために大きな費用を
必要とし、長い時間がかかり、又、感染の第１の
段階で使用するには敏感性が不十分である（血液
凝集反応試験を参照）。 提案されている方法では、大量のトキソプラズ
マの抗原が得られると共に、特に非特異性の凝集
反応を排除することによつて凝集反応試験の正確
さ及び敏感性を相当に改善することができる。今
日まで使用されている方法では死んでいる有機体
をそのまま使用する。しかし、非常に簡単なこれ
らの方法は下記の如き２つの好ましくない特徴を
有している： 第１に、敏感性がない。凝集反応試験では、一
般に力価が溶解試験又は従来の免役蛍光試験にお
けるよりも低い。従つて、後者の２種類の試験で
は陽性でありながら、凝集反応方法では陰性を示
す血清がある。 第２に、特異性に欠けている。溶解試験及び免
疫蛍光試験で陰性でありながら、凝集反応試験で
は陽性を示す２、３の血清がある。 本発明は、凝集反応試験の敏感性を増大し、非
特異性の凝集反応を排除する抗原の調製に関する
方法を提供する。このようにして改善された凝集
反応試験によつて、溶解試験によつて得られる結
果と同価値の結果を得ることができる。 提案されている新しい方法に関する技術及び示
表は非常に単純で正確なので、このような抗原を
利用することによつて、使用頻度が時々であつて
もずつと大規模に使用される場合にでも、血清学
を実施している研究所に対して非常に有用であ
る。 本発明の目的は、腹膜内経路によつて、トキソ
プラズマとサルコーマTG180細胞の如きサルコ
ーマ性細胞とを同時にはつかねずみに注射するこ
とによつてトキソプラズマの培養から得られる抗
原を調整する方法を改良することである。即ち、
本発明はトキソプラズマとサルコーマTG180細
胞との混合物が腹膜内経路を経てはつかねずみに
接種され、得られた腹水中にトキソプラズマが収
集されるトキソプラズマ症の診断のためのトキソ
プラズマ抗原調製品の製造方法において、トキソ
プラズマ含有腹水と該サルコーマTG180細胞含
有腹水との混合物をはつかねずみに接種し、接種
後48時間から72時間で腹水を収集することからな
る第１の段階、および第１の段階で得られた腹水
を遠心分離により得られるトキソプラズマに感染
されているサルコーマTG180細胞と非感染サル
コーマTG180細胞との混合物をはつかねずみに
接種し、接種後48時間から72時間で腹水を収集
し、その後収集された腹水にトリプシンを作用さ
せて該感染されているサルコーマTG180細胞か
らトキソプラズマを解放させることからなる第２
段階とからなる２段階における操作を実施するこ
とにより改善されることを特徴とするトキソプラ
ズマ症の診断のためのトキソプラズマ抗原調製品
の製造方法である。本発明の方法により、トキソ
プラズマだけをはつかねずみに接種する従来の方
法から得られる数の約10倍に等しい、一匹のはつ
かねずみあたり相当数のトキソプラズマ（以下、
寄生体、あるいは有機体ともいう）を得ることが
できる。 サルコーマ性細胞と寄生体との混合物が接種さ
れたはつかねずみはサルコーマ性細胞と寄生体と
の両方を含んでいる腹水（以下、滲出液ともい
う）を出し、その割合は接種されたサルコーマ性
細胞と寄生体の比率と、接種後の経過時間の両方
の関数として変化する。これらの滲出液を顕微鏡
で検査して６段階に分けることができる。 第１段階では、細胞の大部分は感染していなく
て、感染されているわずかの細胞はわずかの寄生
体のみを含んでいる。 第２の段階では、５から10％の細胞が感染して
いるが、各細胞はわずかの寄生体のみを含んでい
る。 第３の段階では、約半数の細胞が感染してい
て、その大部分はわずかの寄生体のみを含んでい
る。わずかの数の細胞が非常に強く感染されてい
る。２、３の細胞外トキソプラズマが存在してい
る。 第４の段階では、ほとんどすべての細胞が広く
感染されていて、破裂しかかつている。多数の細
胞外寄生体が見えるが、これはおびただしい数の
細胞内有機体に比較すれば無視できる数である。 第５の段階では、破裂しかかつている、広く感
染された多数の細胞がなお存在している。同時
に、多数の遊離トキソプラズマが観察され、その
形態は正常に見える。 最後に、第６の段階では、すべてのサルコーマ
性細胞が破裂している。きわめて多数の遊離寄生
体が存在している。多くの有機体は明らかに死ん
でいるか、凝集している。 凝集試験及び血清蛍光あるいは染色試験用の満
足できる抗原を得るためには、下記の２つの点に
十分に注意しなければならない：滲出液はもつぱ
ら第４及び第５段階で収集しなくてはならない；
はつかねずみに対する接種はこの滲出液の収集よ
り72時間以下の時間以前に行なわなければなら
ず、最適の時間は48時間である。寄生体のみを接
種されたはつかねずみから得られたトキソプラズ
マと混合された非感染のサルコーマ性細胞をはつ
かねずみに接種する場合には、上記の２つの条件
を満足させるのは困難である。このために、２段
階方法が開発された。 トキソプラズマのRH変種は、２、３日ごとに
はつかねずみからはつかねずみに連続的に腹膜内
移転を行なうことによつて維持することができ
る。サルコーマ性細胞は、10日から12日ごとには
つかねずみに腹膜内移転を行なう。 本発明の抗原の調整は２種類の移転を含んでい
る： まず、第１の段階では、トキソプラズマとサル
コーマ細胞との混合物をはつかねずみに接種す
る。例えば、10日から12日たつた２mlのサルコー
マ性細胞の滲出液が、２、３日以前にトキソプラ
ズマのRH変種が接種されているはつかねずみの
すべての腹水と混合される。次いでこの混合物が
遠心分離され、腹膜内経路によつて沈澱物がはつ
かねずみに接種される。２日後に滲出液を顕微鏡
で検査し、バクテリアの不存在及びサルコーマ性
細胞の感染をチエツクする。 第２の段階では、第１の段階中に得られた細胞
が適切な数の非感染のサルコーマ性細胞と混合さ
せられる。このために、一方では、第１の段階中
に接種されたはつかねずみの滲出液（感染された
細胞を含んでいる）が遠心分離され、他方では、
サルコーマ性細胞（非感染細胞を含んでいる）だ
けが接種されているはつかねずみの滲出液が遠心
分離され、沈澱した細胞が混合される。 混合物内の非感染細胞対感染された細胞の最適
の比率は、下記の第１表に示す如くに、第１の段
階のはつかねずみの感染の程度の関数として変動
する。 一定の量、例えば、2/10mlの非感染細胞と感染
された細胞との適切な混合物が、次いで、腹膜内
経路によつて新しいはつかねずみに接種される。
２日後に、腹膜の滲出液が一般的に第４及び第５
の段階に達し、抗原の調整のために収集すること
ができる。 次の段階は、トリプシン又はその等価物の作用
により、感染されているサルコーマ性細胞からト
キソプラズマを放出することから成る。強く感染
されている細胞はこの処理によつて容易に破壊さ
れる。トリプシンに対する露出の期間が長すぎる
と、又はこの露出中の酵素の濃度が高すぎると、
トキソプラズマはその形態を維持するが抗原とし
て低い値を有する。このために、本発明の方法で
は、トキソプラズマの大部分がサルコーマ性細胞
から放出されれば直ちに、遠心分離及びサルコー
マ性細胞からのトリプシンの排除によつてこの工
程を中断しなくてはならない。従つて、下記の如
き操作を行なう： 第２段階（感染の第及び第段階）のはつか
ねずみの滲出液から得られた沈澱物を、0.05％の
トリプシンを含んでいる、リン酸塩で緩衝された
塩水（PH7.2）又は「PBS」中で懸濁液とし、継
続的にかく拌しながら37℃の水浴中に温置する。
５分ごとにアリコートを検査して、細胞の崩壊が
観察されれば直ちに、懸濁液を遠心分離する。 沈澱物を再びPBS溶液中で懸濁液として遠心
分離する。この第２の遠心分離後に、ホルムアル
デヒドを６％含有する溶液に寄生体を懸濁させ
る。寄生中をホルムアルデヒド溶液内に一晩保持
する。次の日（懸濁後少なくとも16時間）、再び
遠心分離を行なう。次いでPBS中で沈澱物を数
回洗浄し、細胞やホルムアルデヒドのくずを除去
する。次に、寄生体を保存剤を含んでいるアルカ
リ性緩衝液（PH8.7）中に懸濁させる。 ホルムアルデヒドの濃度は高い。寄生体は普通
の三日月形形状を維持していなくてはならない。
固定が不十分な場合には敏感性の小さい抗原が得
られる。 懸濁液を顕微鏡でチエツクすると、一般的にほ
ぼ全てが遊離寄生体から成ることが分る。わずか
のサルコーマ性細胞が残つている場合にはこれら
の細胞を遠心分離によつて除去する。繊維素物質
又は凝固物質が存在する場合にはろ過によつてこ
れらの物質を除去する。寄生体の濃度は、溶解試
験において陽性と認められた血清による試験中に
最適の結果を与えるように調整されている。懸濁
液は４℃に保持する。最適の希釈度は、WHO基
準に関して、又はWHO基準に関する第２の基準
に対して母懸濁液の異なる溶液を滴定することに
よつて定められる。一般に、WHO基準の1/4000
希釈までは最大の凝集反応＋＋＋が得られ、これ
は、反応血中の１ミリリツトルあたり0.125国際
ユニツト（I.U.）の最終濃度に対応する。＋＋、＋
の表示は、1/8000から1/16000の希釈（0.063から
0.031IU／mlによつて得られる。疑わしい、又は
陰性の結果は1/32000（0.016IU／ml）の希釈によ
つて得られる。抗原として使用する懸濁液の希釈
度は、上記の価値尺度で最も明らかな結果が得ら
れるものである。大部分の場合には、１マイクロ
リツトルあたり約10000から50000、好ましくは
20000の有機体を含んでいる。従つて、この寄生
体の濃度は一般的に前述の濃度よりも小さい。 この抗原では、血清に対する凝集反応は、２−
メルカプト−エタノール又はその等価物の存在下
で、マイクロ滴定プレート内で行なわれる。結果
は力価（希釈度の逆数）又は国際ユニツト
（WHO基準に対して）によつて表わされる。上
記の抗原は２−メルカプト−エタノールの不在下
でも使用できる。 【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ トキソプラズマとサルコーマTG180細胞と
   の混合物が腹膜内経路を経てはつかねずみに接種
   され、得られた腹水中にトキソプラズマが収集さ
   れるトキソプラズマ症の診断のためのトキソプラ
   ズマ抗原調製品の製造方法において、トキソプラ
   ズマ含有腹水と該サルコーマTG180細胞含有腹
   水との混合物をはつかねずみに接種し、接種後48
   時間から72時間で腹水を収集することからなる第
   １の段階、および第１の段階で得られた腹水を遠
   心分離により得られるトキソプラズマに感染され
   ているサルコーマTG180細胞と非感染サルコー
   マTG180細胞との混合物をはつかねずみに接種
   し、接種後48時間から72時間で腹水を収集し、そ
   の後収集された腹水にトリプシンを作用させて該
   感染されているサルコーマTG180細胞からトキ
   ソプラズマを解放させることからなる第２段階と
   からなる２段階における操作を実施することによ
   り改善されることを特徴とするトキソプラズマ症
   の診断のためのトキソプラズマ抗原調製品の製造
   方法。 ２ 第１の段階において、２、３日以前にトキソ
   プラズマが接種されたはつかねずみの腹水と、10
   日から12日以前にサルコーマ性細胞が接種された
   はつかねずみの腹水の混合物がはつかねずみに接
   種され、この混合物の接種されたはつかねずみの
   腹水が接種後48時間から72時間で収集されること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 ３ 感染されているサルコーマ性細胞の数と非感
   染のサルコーマ性細胞の数との比が、第１の段階
   におけるはつかねずみの感染の程度の関数として
   変動することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の方法。 ４ 第２段階中に収集された腹水の沈澱物が、37
   ℃の水浴中で、PH7.2の緩衝塩水中の0.05％のト
   リプシン溶液の作用に、細胞の崩壊を起こさせ、
   トキソプラズマを放出させるのに必要な時間だけ
   さらされることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項から第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５ 放出されたトキソプラズマが沈澱後に、少な
   くとも16時間、６％のホルムアルデヒド溶液中に
   懸濁させられ、次いで遠心分離、洗浄され、保存
   剤を含んでいるPH8.7のアルカリ性緩衝液中に懸
   濁されることを特徴とする特許請求の範囲第４項
   に記載の方法。 ６ アルカリ性緩衝液内のトキソプラズマの最適
   な濃度が国際基準によつて定められ、１マイクロ
   リツトルあたり10000から50000トキソプラズマで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記
   載の方法。