【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、バチルス属の産生する中性付近に至
適PHを持つ金属プロテアーゼの溶解方法に関する
ものである。
更に詳しくは、金属プロテアーゼの飽和濃度を
更に上げるため、0.5mole／から飽和濃度のア
ルカリ金属、アルカリ土類金属またはアンモニウ
ムハロゲン化物を添加することにより溶解度を上
げることを特徴とする該酵素飽和溶液の調製方法
に関する。
一般的に、蛋白質ことに微生物の菌体外へ分泌
される菌体外蛋白質−菌体外酵素および細胞内に
おいても、細胞液−体液に溶解して存在するいわ
ゆる遊離状態の蛋白質、酵素の溶解度は高いこと
が知られている。
例えば、血清アルブミンは血液中で40mg／ml
（６×10-4mole／）存在し（エフ・ダブリユ
ー・プトナム著「トレース・コンポーネント・オ
ブ・プラズマ」第５巻、アラン・アール・リース
社、ニユーヨーク（1976））、実験室的には約70
mg／mlという高濃度の中性水溶液を容易に調製で
きる（アール・エフ・プロブスタインら、ジヤー
ナル・オブ・フイジカル・ケミストリー．第83
巻、1226頁（1979））。
また、ニワトリ卵白リゾチームでは、PH3.3に
おいては100mg／ml（７×10-3mole／）の水溶
液を用いて実験を行つた例（シー・シー・マクド
ナルドら、ジヤーナル・オブ・アメリカン・ケミ
カル・ソサエテイ．第93巻、235頁（1971））、が
あり、リボヌクレアーゼＡでは、約100mg／ml
（0.01mole／）（デイー・エツチ・ミードウズ
ら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシーズ．第58巻、1307
頁（1967））、ウシ膵臓トリプシン・インヒビター
（BPTI）では、約140mg／ml（0.02mole／）の
水溶液を実験に用いている例がある（ジー・ワグ
ナーら、ジヤーナル・オブ・マグネチツク・レゾ
ナンス、第20巻、435頁（1975））。
一方、中性付近に至適PHを有する金属プロテア
ーゼ、いわゆる中性金属プロテアーゼの溶解度は
最大の活性を有する中性PH領域では約１mg／ml程
度である。
一般に、酵素反応速度Ｖは、次のミハエリスー
メンテン式によりあらわされる。
Ｖ＝kcat・e0・Ｓ／Km＋Ｓ ……(1)
ここに、
Ｓ：基質濃度（mole／）
e0：酵素初濃度（mole／）
Km：ミハエリス定数（mole／）
Kcat：酵素反応のターン・オーバー数（sec-1）
である。この式から明らかなように、酵素反応の
速度Ｖは反応系に加えた酵素の初濃度に比例して
増大する。
このミハエリスーメンテン式は容易に積分で
き、
Kcat・e0・ｔ＝（S0−Ｓ）＋Km・lnS0／Ｓ ……(2)
をえる。
ここに、
Ｓは時間ｔにおける基質濃度（S0−Ｓ＝ｐ）
である。この式に従えば、基質から生成物への変
換が、いかなる場合でも、ある変換率に到達する
に要する時間は、用いる酵素の濃度に反比例する
ことが明らかである。
従つて、酵素触媒反応において、酵素濃度を大
きくすることは反応の初速度を比例的に増大さ
せ、その結果、基質から生成物への一定の変換レ
ベルに到達するに要する時間を反比例的に減少短
縮させることになる。このことは、反応液中に酵
素を大量に溶かしこむことができれば、反応時間
は限りなく短縮可能であることを意味しており、
殊に、酵素を工業的に利用する場合には、反応器
の運転時間を飛躍的に短縮できるという利点があ
るのみならず、基質や生成物あるいは酸素反応に
必要な補酵素や活性化剤などのエフエクターの反
応器内での滞留時間を短縮できるという利点があ
る。これらの物質の多くは不安定であり、滞留時
間が短かいことは、多くの場合に好都合である。
他方、酵素自体にとつても反応時間のうちに、
撹拌に伴う応力や表面変性の原因により、徐々に
変性・失活がおこる。この種の失活も反応時間の
短縮により防ぐことが可能である。更に、一般に
酵素蛋白雌の安定性は希薄溶液中よりは、濃厚溶
液中の方が高いことが知られている。
以上の如く酵素反応において、酵素の濃度を可
能な限り大きくして反応させることは単に時間的
な節約にとどまらず、それに付随する様々の利点
が生じる。
一般に、蛋白質は水溶液中での少量の塩類の添
加により、その溶解度が増大するが、塩濃度が高
くなると溶解度は減少する。
これは蛋白質分子の水和が小さくなり、蛋白質
分子が相互に近接凝集するためである。この原理
は塩析操作として応用される。
同一の蛋白質、一定の塩類を用いた場合、塩の
濃度が蛋白質の塩析をおこさせるのに充分な濃度
では、蛋白質の水に対する溶解度は塩溶液のイオ
ン強度と共に減少する。
すなわち、よく知られた次の関係式が成立す
る。
logS＝β−Ks・Ｉ ……(3)
ここに、
Ｓ：蛋白質の溶解度（mole／）
Ｉ：イオン強度
β：イオン強度０での蛋白質の仮想上の溶解度
（温度、PHに依存）
Ks：塩析定数（一定の蛋白質、一定の塩類によ
り定まる定数）
一般に塩析には、硫酸アンモニウム、硫酸ナト
リウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩
化ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが用いら
れる。
蛋白質は、その等電点において溶解度が最小で
あり、この関係は塩類濃度の高低や有機溶媒、金
属イオンの有無にもかかわわらずほぼ成立する。
この関係は、等電点沈殿法として知られてい
る。逆に、蛋白質の等電点から大きくはずれたPH
域では、溶解度を上昇させうることを意味する
（エイ・エル・レーニンジヤー著、「バイオケミス
トリー第２版」第７章、ウオース・パブリツシヤ
ー（1975））。
しかし、この方法は、等電付近に至適PHのある
酵素では、酵素活性の極端な低下と酵素の変性が
まぬがれえず、適用することは一般に不可能であ
る。
本発明者らは、バチルス属の産生する中性付近
に至適PHを有する金属プロテアーゼの溶解度を上
げるため、鋭意研究の結果、理由不明ではあるが
0.5mole／から飽和濃度のアルカリ金属、アル
カリ土類金属またはアンモニウムのハロゲン化物
を添加すると、その溶解度が上がることを見出し
本発明を達成したものである。
本発明で使用されるバチルス属の中性金属プロ
テアーゼに属する酵素の市販品としては、サーモ
ライシン、サーモアーゼ、プロリシン、ニユート
ラーゼ、バチルス・エス・ビーNo.36プロテアー
ゼ、プロテイナーゼＴ−940、HT−プロテオリ
テイツク・バクテリアル・プロテアーゼなどが例
示される。
また、アルカリ金属またはアルカリ土類金属と
しては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カル
シウム、マグネシウム等であり、これらおよびア
ンモニウムの塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン化
物が添加物として例示される。
これらは、0.5mole／から各化合物の飽和濃
度溶液であるが、好ましくは1mole／以上であ
り、特にこれらの塩類の飽和濃度溶液の添加が好
ましい。この範囲以外では、酵素の溶解度は余り
上がらず好ましくない。
溶液の温度は、その塩類溶液の凝固点かけ70
℃、好ましくは0゜〜40℃である。この範囲以上の
温度では、酵素活性が著しく低下し実際的でない
うえに、上に述べた濃度の塩類の存在下では溶解
度は減少する傾向にある。また、範囲以下の温度
では、溶液が凍結するため好ましくない。
以下に説明するように、本発明に用いる塩の種
類と濃度はバチルス属の中性金属プロテアーゼの
溶解度を上げると共に、活性の何らの低下を引き
おこさないばかりか、10倍以上もの活性増大を引
きおこすことを本発明者らは見出した。
すなわち、塩類の添加により、酵素蛋白質の
「飽和溶解度の上昇」と共に「本質的な酵素活性」
（式(1)におけるkcatに相当する）の飛躍的な上昇
が引おこされる。従つて、酵素の飽和溶解度での
酵素活性は、（溶解度の上昇率）×（本質的な酵素
活性の上昇率）として相乗的に表現される。
以上のことから本発明は、当該酵素の利用を考
慮する場合、極めて重大な意義をもつと考えられ
る。
バチルス属の中性金属プロテアーゼの活性に対
する影響について、Zn2+イオンが活性表現に必
須の金属であり、カルシウムイオンが構造安定性
の増大に関与することが明らかにされている（メ
ソツズ・イン・エンザイモロジー、第19巻、569
〜575頁および642〜651頁、アカデミツクプレ
ス・ニユーヨーク（1970））。
この場合のカルシウムイオン濃度は100ｍ
mole／程度の濃度であり、本発明法の如き
0.5mole／から飽和濃度を使用する方法とは、
基本的に目的および効果が異なるものである。
本発明に使用できる種々の基質としては、例え
ば、カルボベンジルオキシ−Ｌ−アラニル−グリ
シン−メチルエステル（Ｚ−Ala−Gly−OMe）、
カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フエ
ニルアラニンメチルエステル（Ｚ−Leu−Phe−
OMe）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−アラニル−
Ｌ−セリン−メチルエステル（Ｚ−Ala−Ser−
OMe）、カルボベンジルオキシ−グリシル−Ｌ−
フエニルアラニン−アミド（Ｚ−Gly−Phe−
NH2）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシル−
Ｌ−ロイシン−メチルエステル（Ｚ−Leu−Leu
−OMe）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−ロイシル
−Ｌ−チロシン−アミド（Ｚ−Leu−Try−
NH2）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−バリル−Ｌ
−アラニン−メチルエステル（Ｚ−Val−Ala−
OMe）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−バリル−Ｌ
−ロイシン−メチルエステル（Ｚ−Val−Leu−
OMe）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−バリル−Ｌ
−フエニルアラニン−メチルエステル（Ｚ−Val
−Phe−OMe）、カルボベンジルオキシ−Ｌ−バ
リル−Ｌ−チロシン−メチルエステル（Ｚ−Val
−Tyr−OMe）、フリルアクリロイル−グリシル
−Ｌ−ロイシン−アミド（FAGLA）などの合成
ペプチド類およびインスリン、ヘモグロビン、カ
ゼインどの天然のペプチドや蛋白質がある。
本発明で調製された金属プロテアーゼの利用面
について説明を加える。
当該のバチルス属の中性金属プロテアーゼは、
基質特異性が広く、かつ強力なペプチド結合の加
水分解力を有しており、アミノ酸への分解率が高
いことが特徴的である。
また、チーズ製造への応用、皮革工業への応
用、食品工業への応用−食品蛋白質に作用させ味
と香りを付与、食物蛋白質の軟化、食味向上、吸
収・消化率の向上、ペプチド合成およびプラステ
イン合成への応用、味噌・醤油の速醸と合成清酒
の製造、食肉軟化などがあげられる。これらのう
ち、本発明は、(1)ペブチド合成およびプラステイ
ン合成への応用、および(2)味噌・醤油の速醸に対
し、大きな有効性を発揮することが期待できる。
また、当該酵素は、蛋白質に作用して効率よく
アミノ酸にまで分解する力をもつが、基質となる
蛋白質は、一般に高塩濃度下では不安定もしくは
変性状態にあり、プロテイナーゼの作用をうけや
すい構造をもつている。この点で、本発明は、プ
ロテイナーゼを用いる蛋白質の完全加水分解の目
的には極めて有用と考えられる。
次に本発明を実施例により更に詳細に説明する
が、その要旨を超えない限り、下記実施例によつ
て限定されるものではない。
実施例 １
結晶サーモライシン（大和化成製）の30mgを20
ｍmole／のトリス・ヒドロキシメチルアミノ
メタン・塩酸塩、10ｍmole／のCaCl2および０
ないし4.5mole／の種々の濃度度のNaClを含有
するPH7.5の緩衝液5.0mlに懸濁させた。
この懸濁液を０℃、25℃、37℃および60℃で静
かに１時間撹拌したのち、ミリポア社製メンブレ
ン・フイルターHA（0.45μｍ）にて過し、液
の吸光度を分光光度計にて測定し、溶液内のサー
モライシン濃度を決定した。
サーモライシン濃度の吸光度からの算出には、
277nｍでの吸光度1.83がサーモライシン１mg／ml
に相当する（ワイ・オオタら、ジヤーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー．第241巻、
5919頁（1966））とした。
結果を表１に示した。
The present invention relates to a method for dissolving a metalloprotease produced by Bacillus and having an optimum pH near neutrality. More specifically, in order to further increase the saturation concentration of the metal protease, the solubility of the enzyme saturated solution is increased by adding an alkali metal, alkaline earth metal or ammonium halide at a saturation concentration of 0.5 mole/ to Regarding the preparation method. In general, the solubility of proteins, particularly extracellular proteins and enzymes secreted outside the microbial cell, and so-called free proteins and enzymes that exist dissolved in cell fluids and body fluids, even within cells. is known to be high. For example, serum albumin is 40 mg/ml in the blood.
(6 × 10 -4 mole/) (F.D. Putnam, "Trace Components of Plasma", Vol. 5, Allan Earle Rees Co., New York (1976)), and in the laboratory, approximately 70
A neutral aqueous solution with a high concentration of mg/ml can be easily prepared (RF Probstein et al., Journal of Physical Chemistry. No. 83).
Vol. 1226 (1979)). In addition, for chicken egg white lysozyme, an example was conducted using an aqueous solution of 100 mg/ml (7 x 10 -3 mole/) at pH 3.3 (C.C. MacDonald et al., Journal of American Chemical Society, Vol. 93, p. 235 (1971)), and for ribonuclease A, it is approximately 100 mg/ml.
(0.01mole/) (D.E.T. Meadows et al., Proceedings of the National Academy of Sciences. Volume 58, 1307
(1967)), and for bovine pancreatic trypsin inhibitor (BPTI), an aqueous solution of approximately 140 mg/ml (0.02 mole/) is used in experiments (G. Wagner et al., Journal of Magnetic Resonance, Volume 20, page 435 (1975)). On the other hand, the solubility of metal proteases having an optimal pH near neutrality, so-called neutral metal proteases, is about 1 mg/ml in the neutral pH range where they have maximum activity. Generally, the enzyme reaction rate V is expressed by the following Michaelis-Menten equation. V=kcat・e 0・S/Km+S...(1) Here, S: Substrate concentration (mole/) e 0 : Enzyme initial concentration (mole/) Km: Michaelis constant (mole/) Kcat: Enzyme reaction turn・The number of overs (sec -1 ). As is clear from this equation, the rate V of the enzymatic reaction increases in proportion to the initial concentration of enzyme added to the reaction system. This Michaelis-Menten equation can be easily integrated to obtain Kcat・e 0・t=(S 0 −S)+Km・lnS 0 /S ……(2). Here, S is the substrate concentration at time t (S 0 −S=p). According to this equation, it is clear that the time required for the conversion of substrate to product to reach a certain conversion rate in any case is inversely proportional to the concentration of enzyme used. Therefore, in an enzyme-catalyzed reaction, increasing the enzyme concentration proportionally increases the initial rate of the reaction and, as a result, inversely decreases the time required to reach a given level of conversion of substrate to product. It will be shortened. This means that if a large amount of enzyme can be dissolved in the reaction solution, the reaction time can be infinitely shortened.
In particular, when enzymes are used industrially, they not only have the advantage of dramatically shortening the operating time of the reactor, but they also have the advantage of dramatically shortening the operating time of the reactor, as well as reducing the production of substrates, products, coenzymes and activators necessary for oxygen reactions, etc. This has the advantage that the residence time of the effector in the reactor can be shortened. Many of these materials are unstable and short residence times are often advantageous. On the other hand, for the enzyme itself, during the reaction time,
Denaturation and deactivation occur gradually due to stress associated with stirring and surface denaturation. This type of deactivation can also be prevented by shortening the reaction time. Furthermore, it is generally known that the stability of enzyme proteins is higher in concentrated solutions than in dilute solutions. As described above, in enzymatic reactions, carrying out the reaction at the highest possible concentration of enzymes not only saves time, but also brings about various advantages associated with this. Generally, the solubility of a protein increases when a small amount of salt is added to an aqueous solution, but the solubility decreases as the salt concentration increases. This is because the hydration of protein molecules becomes smaller and the protein molecules aggregate in close proximity to each other. This principle is applied as a salting out operation. When using the same protein and certain salts, the solubility of the protein in water decreases with the ionic strength of the salt solution when the salt concentration is sufficient to cause salting out of the protein. That is, the following well-known relational expression holds true. logS=β-Ks・I...(3) where, S: Solubility of protein (mole/) I: Ionic strength β: Virtual solubility of protein at ionic strength 0 (depends on temperature and PH) Ks: Salting out constant (constant determined by a certain protein and certain salts) Ammonium sulfate, sodium sulfate, magnesium sulfate, potassium phosphate, sodium chloride, sodium citrate, etc. are generally used for salting out. Proteins have the lowest solubility at their isoelectric point, and this relationship holds almost regardless of the salt concentration, the presence or absence of organic solvents, and metal ions. This relationship is known as isoelectric focusing. Conversely, a pH that deviates significantly from the protein's isoelectric point
(A. L. Lenninger, "Biochemistry 2nd Edition" Chapter 7, Worth Publishing (1975)). However, this method is generally impossible to apply to enzymes whose optimum pH is around isoelectricity, as it is inevitable that the enzyme activity will be extremely reduced and the enzyme will be denatured. The present inventors have conducted extensive research to increase the solubility of metalloproteases produced by Bacillus that have an optimal pH near neutrality.
The present invention was achieved by discovering that the solubility increases when an alkali metal, alkaline earth metal, or ammonium halide is added at a saturation concentration of 0.5 mole/min. Commercially available enzymes belonging to the Bacillus neutral metalloprotease used in the present invention include thermolysin, thermoase, prolysin, neutrase, Bacillus SB No. 36 protease, proteinase T-940, and HT-proteolite. Examples include bacterial protease. Examples of alkali metals or alkaline earth metals include sodium, potassium, lithium, calcium, and magnesium, and halides of these and ammonium such as chlorine, bromine, and iodine are exemplified as additives. These are 0.5 mole/ to saturated solutions of each compound, preferably 1 mole/or more, and addition of saturated solutions of these salts is particularly preferred. Outside this range, the solubility of the enzyme does not increase much, which is not preferable. The temperature of the solution is the freezing point of the salt solution times 70
℃, preferably 0° to 40°C. Temperatures above this range significantly reduce enzyme activity and are impractical, and in addition, solubility tends to decrease in the presence of salts at the concentrations mentioned above. Furthermore, temperatures below this range are not preferred because the solution freezes. As explained below, the type and concentration of salts used in the present invention not only increase the solubility of Bacillus neutral metalloproteases but also do not cause any decrease in activity, but instead cause an increase in activity by more than 10 times. The present inventors have discovered that. In other words, the addition of salts increases the saturation solubility of the enzyme protein and increases the essential enzyme activity.
(corresponding to kcat in equation (1)) is caused. Therefore, the enzyme activity at the saturated solubility of the enzyme is synergistically expressed as (rate of increase in solubility) x (rate of increase in essential enzyme activity). Based on the above, the present invention is considered to have extremely important significance when considering the use of the enzyme. Regarding the influence on the activity of neutral metalloproteases belonging to Bacillus, it has been revealed that Zn 2+ ions are essential metals for expression of activity, and calcium ions are involved in increasing structural stability (Methods in Enzymology, Volume 19, 569
-575 and 642-651, Academic Press New York (1970)). In this case, the calcium ion concentration is 100m
The concentration is about 1 mole/mole, as in the method of the present invention.
The method of using saturation concentration from 0.5mole/ is as follows.
They basically have different purposes and effects. Various substrates that can be used in the present invention include, for example, carbobenzyloxy-L-alanyl-glycine-methyl ester (Z-Ala-Gly-OMe),
Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-phenylalanine methyl ester (Z-Leu-Phe-
OMe), carbobenzyloxy-L-alanyl-
L-serine-methyl ester (Z-Ala-Ser-
OMe), carbobenzyloxy-glycyl-L-
Phenylalanine-amide (Z-Gly-Phe-
NH 2 ), carbobenzyloxy-L-leucyl-
L-leucine-methyl ester (Z-Leu-Leu
-OMe), carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosine-amide (Z-Leu-Try-
NH 2 ), carbobenzyloxy-L-valyl-L
-alanine-methyl ester (Z-Val-Ala-
OMe), carbobenzyloxy-L-valyl-L
-Leucine-methyl ester (Z-Val-Leu-
OMe), carbobenzyloxy-L-valyl-L
-phenylalanine-methyl ester (Z-Val
-Phe-OMe), carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosine-methyl ester (Z-Val
-Tyr-OMe), furylacryloyl-glycyl-L-leucine-amide (FAGLA), and natural peptides and proteins such as insulin, hemoglobin, and casein. A description will be given of the utilization aspects of the metalloprotease prepared according to the present invention. The neutral metalloprotease of the Bacillus genus is
It has broad substrate specificity and strong peptide bond hydrolyzing power, and is characterized by a high rate of decomposition into amino acids. In addition, applications to cheese production, leather industry, and food industry - act on food proteins to impart flavor and aroma, soften food proteins, improve taste, improve absorption and digestibility, peptide synthesis, and Applications include tein synthesis, quick brewing of miso and soy sauce, production of synthetic sake, and meat tenderization. Among these, the present invention is expected to be highly effective in (1) application to peptide synthesis and plastein synthesis, and (2) quick brewing of miso and soy sauce. In addition, the enzyme has the ability to act on proteins and efficiently break them down into amino acids, but the proteins that serve as substrates are generally unstable or denatured under high salt concentrations, and have structures that are susceptible to the action of proteinases. It has In this respect, the present invention is considered to be extremely useful for the purpose of complete hydrolysis of proteins using proteinases. Next, the present invention will be explained in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples unless the gist thereof is exceeded. Example 1 20 mg of crystalline thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei)
mmole/tris hydroxymethylaminomethane hydrochloride, 10 mmole/CaCl 2 and 0
The suspension was suspended in 5.0 ml of a pH 7.5 buffer solution containing various concentrations of NaCl from 4.5 to 4.5 mole/mole. This suspension was gently stirred at 0°C, 25°C, 37°C, and 60°C for 1 hour, filtered through a Millipore membrane filter HA (0.45 μm), and the absorbance of the liquid was measured using a spectrophotometer. to determine the thermolysin concentration in the solution. To calculate thermolysin concentration from absorbance,
Absorbance at 277nm is 1.83 for thermolysin 1mg/ml
(Wai Ota et al., Journal of Biological Chemistry. Vol. 241,
5919 pages (1966)). The results are shown in Table 1.
【表】
表中の数字の単位はmg／ml
実施例 ２
結晶サーモライシン（大和化成製）の30mgを実
施例１で用いた緩衝液においてNaClの代りに
種々の濃度のCaCl2を添加した緩衝液2.5mlに懸濁
したのち、実施例１と同様の処理を施し、溶解度
を求めた。
CaCl2無添加の場合、０℃、25℃および37℃に
おいても、溶解度は約１mg／mlであり、CaCl2が
0.75mole／まで、温度に依存せず直線的に増
大し、この時の溶解度は約７mg／mlであつた。こ
れ以上のCaCl2濃度では溶解度は一定であつた。
実施例 ３
結晶サーモライシン30mgを実施例１で用いた緩
衝液においてNaClの代りにKBrを加えた緩衝液
2.5mlに懸濁した。その後は実施例１と同様の処
理を施した。
０℃、25℃、37℃のいずれの温度においても
KBrの添加濃度と共に溶解度はほぼ直線的に増
大し、KBr1.7mole／において最大値（約４
mg／ml）に到達した。それ以上飽和濃度までの
KBrを添加しても溶解度は、温度に依存せず約
４mg／mlのままであつた。
実施例 ４
実施例３においてKBrの代りにLiClを用いた
ところ、実施例３と全く同様の結果をえた。
実施例 ５
サーモアーゼ（大和化成製）10ｇを水100mlに
懸濁後、凍結分離により不溶物を除去し、上澄の
懸濁液を凍結乾燥した。この凍結乾燥物100mgを、
種々濃度のKClを溶解した水５mlに懸濁し、実施
例１と同様の操作を25℃にて行つた。
KCl無添加のとき約１mg／mlであつた溶解度
は、KClを3mole／添加すると約４mg／mlまで
上昇した。
実施例 ６
実施例５と同様に調製したサーモアーゼの凍結
乾燥物100mgを用いて、種々濃度のNaIを含む水
溶液に懸濁して実施例５と同様にして溶解度を測
定した。
NaI2mole／で最大溶解度（3.5mg／ml）に到
達した。
実施例 ７
結晶サーモライシン（大和化成製）30mgを種々
の濃度の塩化アンモニウムを含む水溶液（PH7.5
に調整）５mlに懸濁液、25℃で１時間振とうし、
実施例１に従い過し、サーモライシンの溶解度
を求めた。
塩化アンモニウム無添加の時約１mg／mlの溶解
度は1.5mole／の添加により約２倍となるが、
3.0mole／の添加により３倍となつた。
飽和濃度の塩化アンモニウム添加により、溶解
度は3.5mg／mlとなつた。
実施例 ８
バチルス・エスビーNo.36プロテアーゼ（天野
製薬製）10ｇを水50mlに懸濁後、透析チユーブ
（ビスキング社製）にて30の水に対して一昼夜
透析した後、凍結乾燥した。この凍結乾燥物100
mgを種々の濃度のLiClを含む水５mlに懸濁し、実
施例５と同じ操作を行つた。吸光度からの蛋白質
濃度の換算にはサーモライシンの場合と同じ値
（酵素濃度１mg／ml当りの吸光度：1.83（2.77n
ｍ））を仮定して用いた。
LiCl無添加のとき、溶液解は約２mg／mlである
が、LiCl3mole／添加すると約５mg／mlにまで
直線的に上昇した。それ以上の濃度から飽和濃度
までにおいても、その溶解度にはほとんど変化が
なかつた。
実施例 ９
結晶サーモライシン60mgを40ｍmole／のト
リス・ヒドロキシルメチル・アミノメタン塩酸塩
と10ｍmole／のCaCl2を含むPH7.5の緩衝液
（緩衝液０）に懸濁し、25℃にて１時間静かに撹
拌したのち、ミリポア社製メンブレン・フイルタ
ーHAタイプ0.45μｍで過した。この液は
「緩衝液０」に対するサーモライシンの飽和溶液
である。
「緩衝液０」にNaClを1mole／、2mole／
、および3mole／となるように添加して得ら
れる緩衝液をそれぞれ「緩衝液１」、「同２」およ
び「同３」とする。それぞれの緩衝液を用いて
「サーモライシン溶液０」と同様にして「サーモ
ライシン溶液１」、「同２」および「同３」を調製
する。
実施例１に示した方法で、それぞれのサーモラ
イシン溶液の濃度を求めたところ、「サーモライ
シン溶液０」では1.2mg／ml（3.4×10-5mole／
）、「同１」では2.0mg／ml（5.7×10-5mole／
）、「同２」では3.2mg／ml（9.1×10-5mole／
）、および「同３」では3.6mg／ml（10.3×
10-5mole／）であつた。
それぞれの緩衝液を用いて、フリルアクリロイ
ル−グリシル−Ｌ−ロイシンアミド（FAGLA）
（ベガ・フオツクス社製）4.0×10-4mole／の濃
度の溶液を調製し、それぞれ「FAGLA溶液０」、
「同１」、「同２」、「同３」とする。
それぞれのNaCl濃度における飽和濃度のサー
モライシンによるFAGLAの加水分解反応をスト
ツプト・フロー装置（ユニオン技研製RA−401）
を用いて経済的に追跡した。
反応は、25℃、PH7.5にて、サーモライシン溶
液ととFAGLA溶液を0.25mlずつ迅速に（約１ｍ
sec）混合することにより行い、反応に伴う345n
ｍの吸光度変化を利用して追跡した。得られた反
応の初速度Ｖは、
NaCl無添加のとき
1.3×10-4mole・l-1・s-1
NaCl1mole／の添加のとき
2.5×10-4mole・l-1・s-1、
NaCl2mole／の添加のとき
6.3×10-4mole・-1・s-1、
NaCl3mole／添加のとき
11.2×10-4mole・-1・s-1
と求められた。
NaCl添加に伴うＶの増大の度合は、溶解度の
増大の度合より、はるかに大きく、これはサーモ
ライシンの本質的な活性に対するNaClの増強効
果が相乗的に効いている結果である。[Table] The units of numbers in the table are mg/ml.
Example 2 30 mg of crystalline thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei) was suspended in 2.5 ml of the buffer used in Example 1 with various concentrations of CaCl 2 added instead of NaCl, and then the same procedure as in Example 1 was carried out. The solubility was determined. When CaCl 2 is not added, the solubility is approximately 1 mg/ml even at 0°C, 25°C and 37°C, and CaCl 2
The solubility increased linearly to 0.75 mole/ml, independent of temperature, and the solubility at this time was about 7 mg/ml. The solubility remained constant at CaCl 2 concentrations above this level. Example 3 30 mg of crystalline thermolysin was added to the buffer used in Example 1 with KBr added instead of NaCl.
Suspended in 2.5ml. After that, the same treatment as in Example 1 was performed. At any temperature of 0℃, 25℃, 37℃
The solubility increases almost linearly with the addition concentration of KBr, and the maximum value (approximately 4
mg/ml) was reached. up to saturation concentration
Even with the addition of KBr, the solubility remained at about 4 mg/ml, independent of temperature. Example 4 When LiCl was used in place of KBr in Example 3, the same results as in Example 3 were obtained. Example 5 After suspending 10 g of thermoase (manufactured by Daiwa Kasei) in 100 ml of water, insoluble matter was removed by freeze separation, and the supernatant suspension was freeze-dried. 100mg of this freeze-dried product,
Various concentrations of KCl were dissolved in 5 ml of water and suspended in the same manner as in Example 1 at 25°C. The solubility, which was about 1 mg/ml without the addition of KCl, increased to about 4 mg/ml when 3 mole/ml of KCl was added. Example 6 Using 100 mg of lyophilized thermoase prepared in the same manner as in Example 5, the solubility was measured in the same manner as in Example 5 by suspending it in aqueous solutions containing NaI at various concentrations. Maximum solubility (3.5 mg/ml) was reached at NaI2mole/. Example 7 30 mg of crystalline thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei) was added to an aqueous solution containing various concentrations of ammonium chloride (PH7.5).
Adjust the suspension to 5 ml, shake at 25℃ for 1 hour,
The solubility of thermolysin was determined according to Example 1. The solubility of about 1 mg/ml without the addition of ammonium chloride is approximately doubled by adding 1.5 mole/ml.
It tripled by adding 3.0 mole/. Addition of ammonium chloride at a saturating concentration resulted in a solubility of 3.5 mg/ml. Example 8 10 g of Bacillus SB No. 36 protease (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was suspended in 50 ml of water, dialyzed against 30 liters of water overnight in a dialysis tube (manufactured by Visking Co., Ltd.), and then freeze-dried. This freeze-dried product 100
mg was suspended in 5 ml of water containing various concentrations of LiCl, and the same operation as in Example 5 was performed. To convert protein concentration from absorbance, use the same value as for thermolysin (absorbance per 1 mg/ml enzyme concentration: 1.83 (2.77n).
m)) was used. When no LiCl was added, the solution solution was about 2 mg/ml, but when LiCl3 mole/ml was added, it increased linearly to about 5 mg/ml. There was almost no change in solubility even at higher concentrations up to saturation concentration. Example 9 60 mg of crystalline thermolysin was suspended in a pH 7.5 buffer (buffer 0) containing 40 mmole/tris-hydroxylmethyl-aminomethane hydrochloride and 10 mmole/CaCl 2 and gently incubated at 25°C for 1 hour. After stirring, the mixture was filtered through a Millipore membrane filter HA type 0.45 μm. This solution is a saturated solution of thermolysin in "buffer 0". Add 1 mole/, 2 mole/NaCl to “buffer 0”
, and the buffer solutions obtained by adding 3 moles/mole/mole/mole/mole/mole are respectively referred to as "buffer solution 1,""buffer solution 2," and "buffer solution 3.""Thermolysin solution 1", "Thermolysin solution 2" and "Thermolysin solution 3" are prepared in the same manner as "Thermolysin solution 0" using the respective buffer solutions. When the concentration of each thermolysin solution was determined by the method shown in Example 1, the concentration of "thermolysin solution 0" was 1.2 mg/ml (3.4 × 10 -5 mole/
), 2.0mg/ml (5.7×10 -5 mole/
), 3.2mg/ml (9.1×10 -5 mole/
), and 3.6mg/ml (10.3×
10 -5 mole/). furyl acryloyl-glycyl-L-leucineamide (FAGLA) using the respective buffers.
(manufactured by Vega Foxx) solutions with a concentration of 4.0 × 10 -4 mole/ were prepared, respectively "FAGLA solution 0",
"Same 1", "Same 2", "Same 3". The hydrolysis reaction of FAGLA by thermolysin at a saturation concentration at each NaCl concentration was measured using a stop-flow device (RA-401 manufactured by Union Giken).
was economically tracked using The reaction was carried out rapidly at 25°C and pH 7.5 by adding 0.25 ml of thermolysin solution and FAGLA solution (approximately 1 m
sec) by mixing, 345n accompanying the reaction
Tracking was carried out using the change in absorbance of m. The initial velocity V of the reaction obtained is: 1.3×10 -4 mole・l −1・s −1 when NaCl is not added, 2.5×10 −4 mole・l −1・s −1 when NaCl1mole/ is added, When NaCl2mole/ was added, 6.3×10 -4 mole・-1・s −1 and when NaCl3mole/ was added, it was calculated as 11.2×10 −4 mole・-1・s −1 . The degree of increase in V with the addition of NaCl is much greater than the degree of increase in solubility, and this is the result of the synergistic enhancing effect of NaCl on the essential activity of thermolysin.