JPH0139066B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、生物学的物質の自動化された研究お
よび特性づけに関し、さらに詳しくは、細胞体積
の自動化された測定方法に関する。

生物学および医学の多くの分野において、細胞
の体積を知ることは重要である。たとえば、赤血
球の平均細胞体積（mean cell volume＝MCV）
は疾病の診断に使用される１つの標準の血液学的
パラメーターである。

懸濁液、たとえば血液中の中の細胞の平均体積
を測定するために使用されてきた常用の、むしろ
直接的な方法は、細胞を沈降させ、そして細胞懸
濁液の合計の体積と、詰まつた沈降細胞が占める
体積とを測定することである。細胞の濃度は独立
の手段により側定され、そして平均の細胞体積は
合計体積と細胞濃度との積で割つた充填された細
胞体積として計算される。この方法はかなり精確
であるが、ある種の高い精度の応用には十分でな
く、充填された細胞の間に捕捉された液体につい
て補正を行うことが必要である。さらに、この方
法自体は退屈な時間のかかる方法である。

したがつて、本発明の主目的は、細胞を懸濁液
から沈降させることを必要とせず、且つ不完全な
沈降充填によつて生ずる誤差を排除する、自動化
された細胞体積の測定法を提供することである。
これに関連する目的は、簡単な本質的に定量的に
反復可能な改良された方法を提供することであ
る。

先行技術には、また、流れ細胞メーター
（flow cytometer）としても知られている、細胞
分析器を通る流れを利用することにより、細胞体
積の測定への懸濁―充填アプローチについての改
良のアプローチを包む。これらのアプローチルの
種々のタイプが知られており、先行技術、たとえ
ば、米国特許第3275834号（Stevens）および同
第2565508号において知られている。これらは、
細胞体積の測定を行うことができる速度と精度を
改良することを意図している。

流れ細胞測定（flow cytometric）器具におい
て、細胞懸濁液を感知ゾーンに通し、このゾーン
は種々の細胞性質に関する信号を提供する。一般
に、細胞濃度は十分に低くて、ただ１つの細胞が
いずれの時間においても感知ゾーン中を通る。米
国特許第3275834号中に例示されたシステムにお
いて、感知ゾーンは光ビームにより定められ、一
方米国特許第2565508号中に例示されるシステム
において、感知ゾーンは電気インピーダンス感知
オリフイスである。感知ゾーンが光ビームである
とき、流れ細胞測定細胞体積への従来のアプロー
チは典型的には細胞大きさの測度として光の散乱
または吸光を利用する。しかしながら、これらの
光学的信号は、また、細胞の形状および屈折率、
並びに細胞体積に依存し、これによつて誤差につ
いての可能性（poteutiality）を導入する。感知
ゾーンとして電気インピーダンスの感知のオリフ
イスを利用するシステムにおいて、オリフイスの
インピーダンスの変化を細胞体積の測度として使
用し、そしてこのアプローチは細胞の形状および
電気抵抗に依存する固有の誤差を含む。したがつ
て、これらの細胞体積の測定に対する流れ細胞測
定のアプローチは、一般に、同時に感知され且つ
分離、求値が困難であり、これにより補正が困難
である、体積以外の細胞の性質によつて導入され
る欠陥によつて特徴づけられる。たとえば、前記
米国特許のいずれに開示されるアプローチも、等
体積ではあるが異なる形状の２つの細胞が２つの
異る細胞体積を有するものとして誤まつて測定さ
れやすい。

本発明の１つの目的は、実際の細胞体積の測定
が他の細胞の性質、たとえば、形状、屈折率およ
び細胞インピーダンスに対する依存性も排除する
か、或いは実質的に減少する方式の、細胞体積の
自動化された測定のための、流れ細胞測定装置を
利用することである。

本発明の原理は、光学的流れ細胞メーターにお
いて螢光体積しや断（exclusion）を利用するこ
とに基づく。本発明の原理に従えば、細胞中に入
り込まず且つ細胞表面に付着しない螢光染料を含
有する等張媒質中に細胞を懸濁させる。この細胞
懸濁液を流れ細胞メーターに通し、この細胞メー
ター内で細胞懸濁液を円筒形試料流に形成し、こ
の流れを集束された光ビーム中を通過させる。試
料流は細胞よりも直径が大きく、そして試料流中
の細胞は個々に光ビーム中を通過する。試料流を
照明する光の波長は、試料中の螢光染料が効率よ
く励起されるように選ばれる。試料料流からの螢
光は適当なレンズおよびフイルタにより集めら
れ、そして検知器、たとえば、光電子増倍管に向
けられる。本発明の原理に従えば、従来の流れ細
胞測定アプローチにおけるように、感知ゾーンは
試料流と集束された光ビームとの交差によつて定
められる。しかしながら、本発明に従えば、細胞
が感知ゾーンに存在しないとき、試料流中の染料
は螢光の不変の水準を生成し、これは検知器から
一定の出力を生成する。細胞が感知ゾーンに入る
とき、細胞の体積に等しい螢光染料の体積は感知
ゾーンから排除され、そして検知ゾーンから放射
された螢光の強度はそれに応じて減少する。この
螢光の減少は検知器の出力の減少として記録され
る。１つの細胞が感知ゾーンを通過するとき、そ
れは１つのパルスを生成し、その振幅ははそれゆ
え細胞の体積に比例する。

以下、本発明を添付図面を参照しながらさらに
詳しく説明する。

まず第１図を参照すると、本発明の原理に従つ
て使用できる装置が様式化されて機能的および構
造的に表示されている。事実、第１図の装置は、
商品名CYTOFLUORGRAPH で商業的に入手
できる特定のシステム（Ortho Instruments、
410University Avenue、Westwood、
Massachusetts 02090製）である。第１図の装置
は、細胞分析のための流れ細胞測定の原理を組み
入れ、そして特定の型の照明に対する細胞螢光応
答を感知する能力を含む。

第１図の装置の焦点に流れチヤンネル１０６が
存在し、ここにおいて懸濁液中の細胞は単一の列
で急速に（たとえば、2500細胞／秒で）感知帯域
を通る。感知帯域は、細胞流と入射光ビーム、典
型的は気体レーザーからの集束された干渉性の光
との交差によつて定められる。細胞が感知ゾーン
を通過するとき、それは入射光と色々な方法で相
互作用する。ある光は、もちろん、細胞により吸
収され、他の光は入射光の軸に対して比較的に狭
い角度で散乱し、そしてなお他の光は入射光の軸
からの非常に発散した角度、たとえば、入射光に
対して直角に散乱される。さらに、細胞自体の性
質、および細胞があらかじめ受けることができる
染色または着色に依存して、螢光放射も起こりう
る。

従来の操作において、細胞流および入射レーザ
ー光に関して種々の方向で位置する光センサは、
各一定の型の細胞に対して独特の組の応答の検知
を可能とする。こうして、第１図は、イオン・レ
ーザー１０１およびヘリウム・ネオン・レーザー
１０２を含み、各レーザーから放射された干渉性
の光は鏡１０３および１０４とレンズ１０５によ
り流れチヤンネル１０６の感知ゾーンへ種々に反
射される。この分野において知られているよう
に、細胞の試料流を流れる流体の鞘内で層流で運
んで、単一細胞が感知ゾーンにおいて一定時間に
おいて照明されることを確保する。それゆえ、各
細胞がレンズからの光により照明されたとき、細
胞と光との相互作用が感知される。

第１図に示すように、吸光センサ１０８は細胞
が遮断した光の量を検知し、そして前方光散乱は
光センサ１０９および１１０によりほぼ半角20゜
の円錐において検知される。センサ１０８，１０
９および１１０によつて発生された電気信号は、
増幅器１２０および１２１に接続される。これら
の増幅器１２０および１２１は適当な振幅の電気
信号になどを引き続く分析および／または表示の
ため提供する。

第１図の装置において、螢光応答により細胞か
ら放射した光は、細胞の流れの方向および入射光
の軸の両方に対して、ほぼ直角で感知される。球
面鏡１２５および集光レンズ１０７はこの光をほ
ぼ半角20゜の円錐で集め、この光を開口１１１を
通して、連続的に二色鏡１１２および第２鏡１１
３へ伝える。第１色フイルタ１１４（たとえば、
赤のような比較的長い波長の光を通すため）は、
選択した光を二色鏡１１２から光センサ１１７
（たとえば、光電子増倍管）へ運ぶ。第２フイル
タ１１５は異なる色の光（たとえば、緑のような
比較的短かい波長の光）を第２鏡１１３から第２
センサへ選択的に通す。それぞれの細胞からの光
に相当するパルスの形のセンサ１１６および１１
７からの電気信号は、増幅器１１８および１１９
へ結合され、これによつてまた適当な処理に適合
する信号を生成する。

第１図の態様に示すように、センサ・セレクタ
１２２は増幅器１１８〜１２１からの信号を利用
する出力ヒストグラムを発生する。たとえば、出
力の１つの有用な形は、センサ１１６からの、緑
の螢光の振幅に対する、プロツトである。このよ
うなヒストグラムは表示１２３に示されており、
ヒストグラム上の各点は個々の細胞を表わす。ヒ
ストグラム上のインジケータの集団または集合
は、同様な型の細胞の群を表わす。非常に明らか
なように、当業者は緑の螢光の強さに対する狭い
前方角の散乱のヒストグラム、軸方向の光の吸光
に対する狭い角度の散乱のヒストグラムなどをつ
くることに有用性を見い出すであろう。

典型的には、流れセル１０６は石英ガラスの平
な部分で構成され、そして特別に造形された注入
ノズルと漏斗を有し、試料の安定な層流と同心的
な鞘を確保する。

次いで、従来のように、光電増倍管１１６およ
び１１７によつて発生した信号は、螢光染料で着
色された流れチヤンネル１０６中の細胞の照明に
より放射された正のパルスの形である。本発明の
原理に従えば、光電子増倍管（たとえば、１１
６）はフイルタ１１５から連続的な螢光信号を受
け取り、そして負のパルスは１つの細胞が流れチ
ヤンネル１０６の感知ゾーンを通過するとき増幅
器１１８へ結合され、この細胞のの通過は感知ゾ
ーンから放射された螢光を排除するか、或いは実
質的に減少させる。それゆえ、増幅器１１８は正
の進行パルスよりもむしろ負の進行パルスを受け
取るように適合させることが好ましい。このよう
な適合は、当業者が普通になすことができる範囲
内であること。

種々の染料および螢光高分子物質が本発明に適
する。本発明の原理の好ましい応用において、染
料は分子量がほぼ20000のデキストランに共役結
合（conjugate）したフルオレツセインイソチオ
シアネート（FITC−デキストラン）から製造さ
れる。大きいデキストラン分子は、染料が細胞中
に入るのを防ぎ、そしてさらにFITC−デカキス
トランが細胞の表面へ付着しないということによ
つて特徴づけられる。

細胞懸濁液のための適当な濃度は、0.01〜１重
量％のFITC―デキストランである。このような
染料について、適当な照明源は、アルゴン・レー
ザー、たとえば、商業的にCYTOFLUO―
ROGAPH として知られている前述のシステム
中に普通に含まれるものから488nmの光である。
青のアルゴン・レーザー１０１による細胞懸濁液
の照明は、緑の螢光を生成し、この螢光は二色鏡
１１２を通過し、鏡１１３から反射され、そして
緑のフイルタ１１５を通過し、光電子増倍管１１
６により電気信号に変えられる。

体積遮断を前提とする、本発明の原理に従え
ば、螢光試料はその中に懸濁する細胞よりも大き
くあるできである。そうでないと、大きい細胞が
光学的感知ゾーンを通過すると、全細胞体積の一
部分だけが遮断される。試料流がその中に懸濁さ
れる細胞よりも適切に大きい感知ゾーンが与えら
れると、細胞によつて遮断される感知ゾーンの体
積の部分は、試料流と交差するレーザー・ビーム
の高さ、試料流の直径、および遮断体積部分が細
胞体積対レーザービーム高さと試料流の横断面積
との積の比であるような細胞の体積で表わすこと
ができる。光の強度がレーザー・ビームを横切つ
て均一である場合、遮断された体積部分は螢光体
積遮断パルスの振幅に正比例する。より起こりう
る事象において、照明レーザー・ビームはその横
断面において均一な強度をもたず、たとえば、ガ
ウス強度分布を用い、中央において強度が強く、
周辺に沿て強度が減少する。このような場合にお
いて、螢光体積遮断パルスの振幅ばかりを測定す
るだけでなく、さらにこのようなパルスの積分
（すなわち、パルスの振幅対時間の表示の下の面
積）を累積することが好ましく、且つ一層精確で
ある。螢光体積遮断パルスの積分は、細胞が不均
一な照明レーザー・ビームで走査されるとき、螢
光体積遮断信号の平均を表わす。多くの応用のた
めに、体積遮断パルスの積分は細胞体積の好まし
い測度である。

単に振幅よりはむしろ、パルスの積分を用いよ
うとする場合、第１図において１１８のような関
連する増幅器回路を光電子増倍管１１６からチヤ
ンネル２を経て提供されるパルスを積分するよう
に適合させることは当業者にとつて可能である。

典型的には、螢光体積遮断パルスを細胞体積の
指数として使用すると、むしろ低い信号対ノイズ
比がが生ずる。たとえば、第２図を参照すると、
血液への添加剤として、前述のような、FITC―
デキストラン共役結合物（conjugate）を用いる
ヒトの赤血球のための積分した螢光体積遮断パル
スの分布が示されている。第２図において、横座
標は積分したパルスの振幅を表わし、そして縦座
標は事象の数、すなわち対応する積分されたパル
ス振幅を有する細胞を表わし、鋭いカツトオフは
積分したパルス振幅軸の下限に示され、これは第
１図に例示した型のシステムにおいて利用するエ
レクトロニクスの人工物（artifact）である。こ
れと対照的に、従来の知識によればヒトの赤血球
のための実際の体積分布が対称のほぼガウス分布
（Gaussian distribution）である。

これらの観測された理論的な分布の特徴は、変
動係数（COV）を標準偏差対平均の比として定
義することによつて定量的に観測することができ
る。信号がノイズを含まない場合、第２図の分布
のCOVは0.15〜0.2であろう（信号中のノイズは
COVを増加する傾向がある。）第２図のデータに
ついて、実際のCOVはほぼ0.8である。それゆ
え、第２図および関連する分析から、信号は非常
にノイズをもち、これによつて螢光の積分および
分析のエレクトロニクスを精確に制御し、そして
それによつて発生したデータを解釈することが多
少困難である。

本発明の１つの特徴に従えば、螢光体積遮断パ
ルスを細胞体積の測度として使用することは、細
胞からの独立の信号を用いて螢光積分および分析
エレクトロニクスをトリガ（trigger）またはゲ
ート（gate）することによつて、有意に向上させ
ることができる。このような独立の信号は、セン
サ１０９および１１０における狭い角度の散乱、
あるいは鏡１１２および光電子増倍管１１７を経
る広い角度の散乱であることができ、ただし鏡１
１２およびフイルタ１１４が螢光成分を感知する
ことと反対に散乱（たとえば、青色の光）を感知
するように適合されている。事実、第２図に示す
データは、細胞がレーザー・ビームを横切るとき
螢光信号と同時に得られた小さい角度の光散乱信
号で、螢光および分析エレクトロニクスをトリガ
することによつて得られた。換言すると、第１図
を参照すると、感知ゾーンを通過する細胞により
散乱された１０９および１１０における光の検知
は、増幅器１２０を経て利用されて、次いでセン
サ・セレクタ１２２を動作またはゲートして増幅
器１１８から螢光データを受け取らせ、且つ所有
させる。別法として、同様なゲートを増幅器１１
９からの広い角度の散乱信号を経て用いることが
できる。

十分な数の細胞を分析する場合、ノイズのある
螢光体積遮断信号を使用して、細胞個体集団の平
均細胞体積を非常に精確に測定することもでき
る。このような１つのアブローチに従えば、よく
知られた統計学的関係を利用して測定の平均の精
度を決定できる。たとえば、信号分布が0.8の
COVをもち、そして50000個の細胞を分析する場
合、平均の積分された体積遮断信号は１％の精度
および99％の信頼水準で決定することができる。
同様に、50000個より多い細胞を分析する場合、
平均値は一層精確に決定することができる。

ある種の条件下で、にせの人工物が必然的に伴
うことがあり、そして高い水準の精度にはこれら
の人工物の補正を必要とすることがある。

第１に、信号は細胞が散乱または吸収した入射
光または螢光によつて影響を受けることがある。
このような散乱および吸収は一般に最小である
が、それらの効果はそれにもかかわらず減少され
うる。散乱効果は、流れチヤンネル１０６中の試
料および鞘流体の屈折率を細胞の屈折率に、でき
るだけ近く、一致させることによつて減少でき
る。吸収効果は励起および放射光の波長を賢明に
選択することに最小にすることができる。

第２に、高い精度の測定は、細胞の存在のため
試料流の乱れに関連する人工物によつて影響を受
けることがある。試料流の直径が細胞よりほんの
わずかに大きい場合、正の極性の螢光パルスは負
の極性の螢光体積遮断パルスのあとに従うことが
ありうる。一般に、細胞の直径が光−流れ感知ゾ
ーンの大きさに近づくにつれて、あとに従う正の
パルスは大きくなり、そして負の遮断パルスは小
さくなるであろう。

非常に小さい試料流の極単な場合において、螢
光体積遮断パルスは無視することができ、一方後
続する正のパルスはむしろ大きい。したがつて、
測定される細胞の種類および直径の相対的範囲に
ついて知ると、流れの大きさを選択することがで
き、これによつて後続する正の螢光パルスを最小
にすることができ、そして負の螢光遮断パルスの
積分の精度はこれによつて保存される。これによ
り望ましさは劣るが、電子観測およびゲート付き
補正を用いて、後続する正のパルスの人工物の望
ましくない効果をを排除することができる。

以上、本発明の好ましい且つ例示的態様につい
て説明したが、多数の他の態様を当業者は本発明
の精神および範囲を逸脱することなく考えること
ができるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は商業的に入手できる流れ細胞螢光分析
装置の様式化した状態を示す図である。第２図は
本発明の原理に従つて開発したヒトの赤血球のた
めの典型的な細胞体積分布を示すチヤートであ
る。 図中、１０１……アルゴン・イオンのレーザ
ー、１０２……He―Neレーザー、１０３……
鏡、１０４……二色鏡、１０５……レンズ、１０
６……流れチヤンネル、流れセル、１０７……集
光レンズ、１０８……吸光センサ、１０９，１１
０……光センサ、１１１……開口、１１２……二
色鏡、１１３……鏡、第２の鏡、１１４……フイ
ルタ、第１の色フイルタ、赤フイルタ・ブロツ
ク、１１５……フイルタ、第２のフイルタ、１１
６……第２の光センサ、光電子増倍管、１１７…
…光センサ、光電子増倍管、１１８……増幅器、
１１９……増幅器、第１の螢光チヤンネル、１２
０，１２１……増幅器、１２２……センサ・セレ
クタ、１２３……表示、１２５……球面鏡。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ） 選択された刺激に対して螢光の応答を
   示し、そして試料の細胞に浸透せず且つ実質的
   に付着しない染料を含む媒質中に該試料の細胞
   を懸濁させ、 ｂ） 該選択された刺激により照明された光学的
   流れ細胞測定感知ゾーンに該媒質を通過させ、 ｃ） 細胞が該感知ゾーンを通過する時の該ゾー
   ンからの螢光放射の減少を検知し、そして ｄ） 螢光放射の該検知された減少の振幅に基づ
   いて細胞体積を求値する、 工程からなることを特徴とする細胞の試料中の細
   胞体積の測定方法。 ２ 該検知工程が、該ゾーンから螢光放射の振幅
   を表わすパルス信号を発生することを含み、そし
   て該求値工程が該パルス信号を積分して平均の細
   胞体積を表わす信号を生成することからなる特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 該ゾーン中の細胞から散乱した該選択した刺
   激の成分を検知する工程をさらに含み、該検知工
   程および評価工程の性能が該刺激の成分のかかる
   検知について条件づけられている特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４ 該染料がデキストランに結合したフルオレツ
   セインイソチオシアネートである特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ５ 該通過工程が該懸濁液を該ゾーンを流過する
   試料流に形成し、該流れは直径が該細胞よりも大
   きいが十分に制限されていて、該ゾーンを１度に
   １つだけの細胞を通過させ、そして青色範囲の収
   束された干渉性の光で該ゾーンを照明することか
   らなる特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 該通過工程が該試料を流れる担体内に閉じ込
   められた層流に形成し、ここで該媒質および該担
   体の光学的屈折率は該細胞の屈折率に一致する特
   許請求の範囲第４項記載の方法。