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JPH0141223B2 - - Google Patents
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JPH0141223B2 - - Google Patents

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JPH0141223B2
JPH0141223B2 JP58060969A JP6096983A JPH0141223B2 JP H0141223 B2 JPH0141223 B2 JP H0141223B2 JP 58060969 A JP58060969 A JP 58060969A JP 6096983 A JP6096983 A JP 6096983A JP H0141223 B2 JPH0141223 B2 JP H0141223B2
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JP
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mmol
solution
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ascorbic acid
ammonium sulfate
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JP58060969A
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Nobuyuki Nakajima
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は、体液中に存在する各種成分を定量す
る際のアスコルビン酸の影響を除去する方法に関
する。 体液中の各種成分を定量することによつて各種
疾病を診断することは現在広く行なわれている
が、この測定法として近年特に酵素反応を介する
比色定量法が多く採用されている。例えば、(1)酸
化酵素反応系を介して過酸化水素を生成させ、こ
れをペルオキシダーゼの共存下被酸化性色原体に
作用させて生成する色素化合物を比色定量する方
法、(2)脱水素酵素反応系を介してNADHまたは
NADPHを生成させ、これを電子伝達系存在下
にテトラゾリウム塩に作用させ、還元して生ずる
ホルマザンを比色定量する方法などがある。 ところが体液中にはアスコルビン酸が存在して
いるため、アスコルビン酸の強い還元性により上
記比色定量法における酸化、還元系が影響を受
け、測定に誤差を生じさせるという難点がある。
アスコルビン酸は正常人血清中にも1.2mg／dl程
度存在するが、疾病の治療に大量のアスコルビン
酸が用いられることにより血清中濃度が著るしく
増加しており、測定に与える影響は極めて大き
い。上記(1)の定量法においては、被酸化性色原体
が縮合して生成した色素を還元して測定値に負の
誤差を与え、(2)の定量法においてはテトラゾリウ
ム塩を還元してホルマザンを生成させ、測定値に
正の誤差を与える。 このようにして、アスコルビン酸の影響は血清
中に存在するグルタチオンやビリルビンの場合よ
りもはるかに大きく、上記反応系を利用する尿
酸、トランスアミラーゼ、中性脂肪、HDLコレ
ステロール、クレアチニンおよび遊離脂肪酸等の
測定の場合にその影響を除くことが強く要望され
る。 従来はこの点に関して、酸化酵素の一種である
アスコルビン酸オキシダーゼ（ASOD）を用いる
方法が一般に行なわれていたが、ASODを用いる
方法はアスコルビン酸の影響を軽減することはで
きても完全に除くことは困難であり、またASOD
は酵素であるので非常に高価な上、安定性も悪
く、かつ混在する物質の影響を強く受けるという
欠点がある。 本発明者らは、ASODに代り、アスコルビン酸
の影響除去の効果が大で、かつ安定な化学物質を
用いる測定法について種々検討を重ねていたが、
下記の一般式(A)または(B) （式中R1〜5はそれぞれＨ、アルキル基、カルボ
キシアルキル基またはヒドロキシアルキル基であ
り、Ｘはエチレン基；１個または２個のアルキ
ル、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキ
ルが置換したエチレン基；もしくはトランスシク
ロヘキセン基である。） で表わされる化合物の鉄錯体、またはグルコン酸
の鉄錯体に著るしい上記効果のあることを見出
し、本発明を完成した。 すなわち本発明は、上記鉄錯体の１種または２
種以上を添加することを特徴とする体液成分測定
におけるアスコルビン酸の影響を除去する方法に
関する。 上記(A)で表わされる化合物としては、ニトリロ
三酢酸（NTA）、ジヒドロキシエチルグリシン
（DHEG）、イミノ二酢酸（IDA）、ヒドロキシエ
チルイミノ二酢酸（HIDA）、トリス（ヒドロキ
シメチル）メチルグリシン（Tricine）およびニ
トリロ二酢酸プロピオン酸（NDAP）等があり、
また(B)で表わされる化合物としては、トランスシ
クロヘキサンジアミン四酢酸（CyDTA）、エチ
レンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレンジアミ
ン二酢酸（EDDA）、ヒドロキシエチルエチレン
ジアミン三酢酸（EDTA―OH）、およびジアミ
ノプロパン四酢酸（Methyl―EDTA）等がある。
鉄は２価でも３価でもよく、好ましくは３価のも
のを用いる。 また本発明方法が適用される定量分析の被酸化
性色原体系としては、例えば４―アミノアンチピ
リンとナフトール誘導体、４―アミノアンチピリ
ンとアニリン誘導体および４―アミノアンチピリ
ンとナフトール誘導体等多くの過酸化水素発色系
があり、電子伝達系としては、ジアホラーゼ、フ
エナジンメトサルフエート（PMS）およびその
誘導体等が挙げられる。勿論これらのほかにも、
アスコルビン酸が干渉するようないかなる測定に
も本発明方法は適用できる。 本発明の方法は、体液成分測定の際にその反応
系に上記鉄錯体が存在することによつて効果を奏
するので、何らかの方法で上記鉄錯体を反応系に
添加すればよい。 次に試験例および実施例により本発明を説明す
る。 試験例 １ 過酸化水素系における鉄錯体のアスコルビン酸
の影響除去の効果を調べるために、代表例として
NTA、DHEG、IDA、HIDA、Tricine、
NDAP、CyDTA、EDTA、EDDA、EDTA―
OH、MeEDTAおよびグルコン酸それぞれの２
価および３価の鉄錯体を用い、以下の試験を行な
つた。 １ 使用した試薬 (1) 反応試薬（第１表参照、イ〜クの27種類）
イ〜クの構成々分 (1) 緩衝液（Borax Buffer） …ホウ砂50ｍmol／（PH7.0） (2) NTA溶液 …NTA0.5ｍmol／ (3) NTA―Fe()溶液 …NTA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (4) NTA―Fe()溶液 …NTA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (5) DHEG―Fe()溶液 …DHEG0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (6) DHEG―Fe()溶液 …DHEG0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (7) IDA―Fe()溶液 …IDA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (8) IDA―Fe()溶液 …IDA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (9) HIDA―Fe()溶液 …HIDA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (10) HIDA―Fe()溶液 …HIDA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (11) Tricine―Fe()溶液 …Tricine0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (12) Tricine―Fe()溶液 …Tricine0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (13) NDAP―Fe()溶液 …NDAP0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (14) NDAP―Fe()溶液 …NDAP0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (15) CyDTA―Fe()溶液 …CyDTA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (16) CyDTA―Fe()溶液 …CyDTA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (17) EDTA―Fe()溶液 …EDTA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (18) EDTA―Fe()溶液 …EDTA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (19) EDDA―Fe()溶液 …EDDA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (20) EDDA―Fe()溶液 …EDDA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (21) EDTA―OH―Fe()溶液 …EDTA―OH0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (22) EDTA―OH―Fe() …EDTA―OH0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (23) MeEDTA―Fe()溶液 …MeEDTA―OH0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (24) MeEDTA―Fe()溶液 …MeEDTA―0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (25) グルコン酸塩―Fe()溶液 …グルコン酸塩0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (26) 硫酸第一鉄アンモニウム溶液 … 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ 〔Fe（SO4）2（NH4）2〕 (27) 硫酸第二鉄アンモニウム溶液 … 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ 〔Fe2（SO4）4（NH4）2〕 上記各溶液の残部は水
【表】 ０印は添加したものを示す
(2) 発色液（PH7.0） ホウ砂 50ｍmol／ TOOS* ３ｍmol／ ４―アミノアンチピリン 1.5ｍmol／ ペルオキシダーゼ 5000単位／ 残部水 ＊TOOS：Ｎ―エチル―Ｎ―（２―ヒド
ロキシ―３―スルホプロピル）―ｍ―ト
ルイジン (3) アスコルビン酸酸溶液 アスコルビン酸 20mg／dl 残部水 (4) 過酸化水素溶液 過酸化水素 1.5ｍmol／ 残部水 ２ 操作および結果 第１表の反応試薬イークの各２mlに(3)アスコ
ルビン酸溶液20μまたは精製水20μを加え、
37℃で５分間加温した後、(2)発色液１mlを加
え、直ちに(4)過酸化水素溶液20μまたは精製
水20μを添加して更に37℃５分間加温し、波
長555nmにおける吸光度を測定した。 その結果、以下の第２表に示す如く、本発明
による鉄錯体を添加したハ〜ノの反応試薬では
アスコルビン酸の影響を完全に除去することが
できるが、硫酸第一鉄アンモニウムのみでは呈
色反応が阻害され、また硫酸第二鉄アンモニウ
ムおよびNTAのみの添加ではアスコルビン酸
の影響を除去する効果がなかつた。
【表】
【表】 試験例 ２ ホルマザン系における鉄錯体のアスコルビン酸
の影響除去の効果を調べるために、代表例として
CyDTA―Fe()およびCyDTA―Fe()を用い、
以下の試験を行なつた。 １ 使用した試薬 (1) 反応試薬（第３表参照Ａ〜F6種類）Ａ〜
Ｆの構成々分 (1) 緩衝液 …ホウ砂50ｍmol／（PH7.0） (2) CyDTA溶液 …CyDTA0.5ｍmol／ (3) CyDTA―Fe()溶液 …CyDTA0.5ｍmol／ 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (4) CyDTA―Fe()溶液 …CyDTA0.5ｍmol／ 硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (5) 硫酸第二鉄アンモニウム溶液 硫酸第二鉄アンモニウム0.5ｍmol／ (6) 硫酸第一鉄アンモニウム溶液 …硫酸第一鉄アンモニウム0.5ｍmol／ 上記各溶液の残部は水
【表】 ０印は添加したものを示す
(2) 発色液（PH7.0） ホウ砂 50ｍmol／ フエナジンメトサルフエート
0.3ｍmol／ ニトロテトラゾリウムブルー
1.5ｍmol／ 残部水 (3) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 20mg／dl 残部水 (4) NADH溶液 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド ２ｍmol／ 残部水 ２ 操作および結果 第３表の反応試薬Ａ〜Ｆの各２mlに、(3)アス
コルビン酸溶液20μまたは精製水20μを加
え、37℃で５分間加温した後、(2)発色液１mlを
加え、直ちに(4)NADH溶液20μまたは精製水
20μを添加してさらに37℃、５分間加温し、
波長580nmにおける吸光度を測定した。 その結果、下記の第４表に示す如く、本発明
によるCyDTA―鉄錯体を添加した場合（Ｃ、
Ｄ）、ホルマザン系におけるアスコルビン酸の
影響を完全に除去することができるが、硫酸第
二鉄アンモニウム、硫酸第一鉄アンモニウムあ
るいはCyDTAのみの添加では何ら効果がなか
つた。
【表】 実施例 １ 中性脂肪の測定 １ 試薬 (1) 鉄錯体添加試薬 PH7.6 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 0.1mol／ TOOS ２ｍmol／ グリセロキナーゼ 100u/ グリセロ―３―リン酸オキシダーゼ
10000u/ ペルオキシダーゼ 2500u/ アデノシン三リン酸 １ｍmol／ EDDA―Fe() 0.1ｍmol／ 残部水 (2) 対照試薬 PH7.6 (1)の試薬よりEDDA―Fe()を除いたも
の (3) 反応試薬 PH7.6 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 0.1mol／ リポプロテインリパーゼ 200000u/ ４―アミノアンチピリン ３ｍmol／ 残部水 (4) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 50mg／dl 残部水 ２ 操作および結果 血清20μ（検体）を入れた試験管２本およ
び精製水20μ（試薬ブランク）を入れた試験
管１本を用意し、前者のうち１本には(4)アスコ
ルビン酸溶液20μを、他の１本には精製水
20μをさらに加える。これら３本の試験管そ
れぞれに、(1)鉄錯体添加試薬２mlを加えた後37
℃で５分間加温し、ついで(3)反応試薬１mlを加
え、37℃で５分間加温し、波長555nmにおける
吸光度を測定した。同様にして(1)鉄錯体添加試
薬を(2)対照試薬に代えて行ない、吸光度を測定
した。 その結果は第５表に示す如く、鉄錯体添加試
薬を用いるとアスコルビン酸の影響を除く効果
が非常に大であつた。
【表】 実施例 ２ トランスアミナーゼの測定(1) １ 試薬 (1) 鉄錯体添加GOT（GOT：グルタミン酸オ
キザ口酢酸トランスアミナーゼ）用試薬PH
7.4 リン酸―カリウム 10ｍmol／ TOOS ２ｍmol／ Ｌ―アスパラギン酸 100ｍmol／ α―ケトグルタール酸 ５ｍmol／ チアミンピロリン酸 0.4ｍmol／ オキザロ酢酸脱炭酸酵素 2000u/ ピルビン酸オキシダーゼ 3000u/ ペルオキシダーゼ 2000u/ DHEG―Fe() 0.5ｍmol／ 残部水 (2) 対照GOT用試薬 PH7.4 (1)の試薬よりDHEG―Fe()を除いたも
の (3) 鉄錯体添加GPT用試薬 PH7.4 リン酸―カリウム 10ｍmol／ TOOS ２ｍmol／ Ｌ―アラニン 100ｍmol／ α―ケトグルタール酸 ５ｍmol／ チアミンピロリン酸 0.4ｍmol／ ピルビン酸オキシダーゼ 3000u/ ペルオキシダーゼ 2000u/ DHEG―Fe() 0.5ｍmol／ 残部水 (4) 対照GPT（GPT：グルタミン酸トランス
アミナーゼ）用試薬 (3)の試薬よりDHEG―Fe()を除いたも
の (5) 反応試薬 ４―アミノアンチピリン 2.5ｍmol／ 残部水 (6) 反応停止液 クエン酸ナトリウム 0.1mol／ 残部水 (7) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 20mg／dl 残部水 ２ 操作および結果 血清20μ（検体）を入れた試験管２本およ
び精製水20μ（試薬ブランク）を入れた試験
管１本を用意し、前者のうち１本には(7)アスコ
ルビン酸溶液20μを、他の１本には精製水
20μをさらに加える。これら３本の試験管そ
れぞれに(1)鉄錯体添加GOT用試薬0.8mlを加え
た後、37℃、３分間加温し、次に(5)反応試薬
0.2mlを加えて37℃で20分間反応させた後、(6)
反応停止液２mlを加え、波長555nmにおける吸
光度を測定した。同様にして(1)の試薬を(2)対照
GOT用試薬、(3)鉄錯体添加GPT用試薬、また
は(4)対照GPT用試薬に代えて行ない、吸光度
を測定した。 その結果は第６表に示す如く、鉄錯体添加試
薬を加えた場合にはアスコルビン酸の影響を除
く効果が大であつた。
【表】 実施例 ３ トランスアミナーゼの測定(2) １ 試薬 (1) 鉄錯体添加GOT用試薬 PH7.4 リン酸―カリウム 10ｍmol／ ４―アミノアンチピリン 0.5ｍmol／ 2.4―ジクロルフエノール ２ｍmol／ Ｌ―アスパラギン酸 100ｍmol／ α―ケトグルタール酸 ５ｍmol／ チアミンピロリン酸 0.4ｍmol／ オキザロ酢酸脱炭酸酵素 2000u/ ピルビン酸オキシダーゼ 3000u/ ペルオキシダーゼ 2000u/ EDTA―OH―Fe() 0.2ｍmol／ 残部水 (2) 対照GOT用試薬 PH7.4 (1)の試薬よりEDTA―OH―Fe()を除
いたもの (3) 鉄錯体添加GPT用試薬 PH7.4 リン酸―カリウム 10ｍmol／ ４―アミノアンチピリン 0.5ｍmol／ ２，４―ジクロルフエノール
２ｍmol／ Ｌ―アラニン 100ｍmol／ α―ケトグルタール酸 ５ｍmol／ チアミンピロリン酸 0.4ｍmol／ ピルビン酸オキシダーゼ 3000u/ ペルオキシダーゼ 2000u/ EDTA―OH―Fe() 0.2ｍmol／ 残部水 (4) 対照GPT用試薬 PH7.4 (3)のGPT用試薬よりEDTA―OH―Fe
（）を除いたもの (5) 反応停止液 クエン酸ナトリウム 0.1ｍmol／ 残部水 (6) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 10mg／dl 残部水 ２ 操作および結果 血清20μ（検体）を入れた試験管２本およ
び精製水20μ（試薬ブランク）を入れた試験
管１本を用意し、前者のうち１本には(6)アスコ
ルビン酸溶液20μを、他の１本には精製水
20μを加える。これら３本の試験管それぞれ
に(1)の試薬１mlを加えて37℃、20分間加温した
後、(5)反応停止液２mlを加え、波長500nmにお
ける吸光度を測定した。同様にして(1)の試薬を
(2)対照GOT用試薬、(3)鉄錯体添加GPT用試薬
または(4)対照GPT用試薬に代えて行ない、吸
光度を測定した。 その結果は、第７表に示す如く、鉄錯体添加
試薬を用いるとアスコルビン酸の影響を除く効
果が大であることが明らかとなつた。
【表】 実施例 ４ 乳酸脱水素酵素の測定 １ 試薬 (1) 鉄錯体添加試薬 PH8.6 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン 0.1ｍmol／ DL―乳酸 0.15ｍmol／ β―ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド ５ｍmol／ ジアホラーゼ 3000u/ CyDTA―Fe() 1.5ｍmol／ 残部水 (2) 対照試薬 PH8.6 (1)の試薬よりCvDTA―Fe()を除いた
もの (3) 発色液 ニトロテトラゾリウムブルー
３ｍmol／ 残部水 (4) 反応停止液 塩 酸 0.1ｍmol／ 残部水 (5) アスコルビン酸溶液 アスコルビン酸 20mg／dl 調部水 ２ 操作および結果 血清20μ（検体）を入れた試験管２本およ
び精製水20μ（試薬ブランク）を入れた試験
管１本を用意し、前者のうち１本には(5)アスコ
ルビン酸溶液20μを、他の１本には精製水
20μを加える。これら３本の試験管それぞれ
に(1)の試薬0.8mlを加えて37℃、３分間加温し、
(3)発色液0.2mlを加えて37℃、20分間反応させ
た後、(5)反応停止液５mlを加え、波長570nmに
おける吸光度を測定した。同様にして(1)の試薬
を(2)の試薬に代えて行ない、吸光度を測定し
た。 その結果は第８表に示す如く、鉄錯体を用い
た場合にはアスコルビン酸の影響を除く効果が
大であつた。
【表】 以上で明らかな如く、本発明は上記した鉄錯体
を添加して体液成分の測定を行なうことにより、
測定値に及ぼすアスコルビン酸の影響を完全に除
去することができるものである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 次の一般式(A)または(B) （式中R1〜5はそれぞれＨ；アルキル基；カルボ
    キシアルキル基；またはヒドロキシアルキル基で
    あり、Ｘはエチレン基；１個または２個のアルキ
    ル、カルボキシアルキルまたはヒドロキシアルキ
    ルが置換したエチレン基；もしくはトランスシク
    ロヘキセン基である。） で表わされる化合物の２価または３価の鉄の錯体
    の１種または２種以上を添加することを特徴とす
    る体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方
    法。 ２ グルコン酸の２価または３価の鉄の錯体の１
    種または２種以上を添加することを特徴とする体
    液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法。
JP6096983A 1983-04-08 1983-04-08 体液成分測定におけるアスコルビン酸の消去方法 Granted JPS59187266A (ja)

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