JPH0143728B2 - - Google Patents
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- JPH0143728B2 JPH0143728B2 JP56185573A JP18557381A JPH0143728B2 JP H0143728 B2 JPH0143728 B2 JP H0143728B2 JP 56185573 A JP56185573 A JP 56185573A JP 18557381 A JP18557381 A JP 18557381A JP H0143728 B2 JPH0143728 B2 JP H0143728B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
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- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
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Description
本発明は、キレート剤の存在下でそして適当な
場合にはアミノ酸および／または糖または糖アル
コールの存在下で加温することにより、実質的に
肝炎に関して安全な血液凝固第因子（プロトロ
ンピン）および／または第因子の製剤を生成す
る方法に関する。 血液凝固は段階的に進行し、種々の生理学的な
らびに病理学的原因により引き起こされ、そして
その過程が約20種の促進および阻害因子に従属し
ているような複雑な作用である。これらの血液凝
固因子が減少または増大する結果として血液凝固
障害が起こり、そしてこれらのうちのいくつかは
疾患として現われる。 従つてたとえば肝蔵の合成能低下による肝疾患
は血漿プロトロンビンレベル（第因子レベル）
および血漿プロコンバーチレベル（第因子レベ
ル）の下をもたらし、そしてこれは生命を危険に
さらす自然の出血に導くことができる過程であ
る。この場合に第／第因子の濃縮物は即時作
用する治療のために選択される薬物である。 第因子製剤はSoulier氏ら〔「Thrombos.
Diath.Haemorrh.Suppl.」第35巻第61頁（1969
年）〕の方法により生成することができる。 そのような製剤は肝炎を引き起こす危険性がな
いとは云えない。アルブミンはそれを安定剤の存
在下において水性溶液中60℃で10時間加熱した場
合に肝炎に関して安全であると考えられている
〔「J.Clin.Invest.」第27巻第239頁（1948年）参
照〕。従つて適当な安定剤の存在下で加熱された
第／第因子の濃縮物もまた肝炎に関して安全
であると推測することができる。 ドイツ特許出願公開第2916711号公報にはアミ
ノ酸および単糖またはオリゴ糖または糖アルコー
ルを加えることにより水性溶液中の凝固因子を熱
に対して安定化する方法が開示されている。 しかしながらこの方法でさえも第因子を得る
場合にかなりの損失を阻止することはできない
（上記のドイツ特許出願公開公報の実施例４）。通
常第因子の濃縮物中に含有され、そしてその因
子を活性化するために重要である第、およびＸ
因子は上記の条件下で完全に不活性化される。 従つて活性の喪失を低減するために第因子の
水性溶液を熱に対して安定化する方法を発見する
ことはいまだに重要な目的である。 驚くべきことには今やキレート剤たとえばエチ
レンジアミン四酢酸を加えることにより第因子
および／または第因子の水性溶液を熱に対して
安定化できることが見い出された。熱による不活
性化に対して第因子を安定化する方法は現在ま
で知られていない。 本発明はキレート剤の存在下で加温することか
らなり、場合によりアミノ酸およびまたは糖また
は糖アルコールの存在下で加温することにより、
実質的に肝炎に関して安全である血液凝固第お
よび／または第因子の製剤を生成するための方
法に関する。この種のキレート剤の例としてはエ
チレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリ
コール―ビス―（２―アミノエチルエーテル）―
四酢酸（EGTA）、ジアミノシクロヘキサン四酢
酸（CDTA）、ジアミノプロパン四酢酸、ジアミ
ノプロパン―２―オール―四酢酸およびニトロト
リ酢酸ならびにこれらの可溶性金属塩があげられ
る。 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびエ
チレングリコール―ビス―（２―アミノエチルエ
ーテル）―四酢酸（EGTA）のナトリウム塩を
使用するのが好ましい。 現段階の知識によれば、この種のキレート剤の
存在下においては肝炎病原菌の伝達を実質的に排
除することができるほど長時間凝固因子の水性溶
液を加熱することができる。これは特に活性成分
が上澄み液に残存しており、そして肝炎ウイルス
を不溶性沈殿とともに分離徐去することができる
ような沈殿操作と組み合わせて応用される。水性
溶液中約60℃で最低10時間保持された製剤は、今
日実質的に肝炎に関して安全であると考えられ、
特に使用される出発物質が第３世代について試験
したのち肝炎ウイルスを検出することができない
ような人の組織である場合に特にそうであると考
えられる。 本発明の特に好ましい態様においては上記のキ
レート剤のうちの１種を１あたり0.1〜0.3モ
ル、好ましくはエチレンジアミン四酢酸のナトリ
ウム塩を１あたり0.05〜0.3モル、そして場合
によりアミノ酸であるグリシン、α―またはβ―
アラニン、ヒドロキシプロリン、プロリン、グル
タミンまたはα―、β―またはγ―アミノ酪酸の
うちの少なくとも１種好ましくはグリシンを１
あたり1.0〜3.0モル、および単糖またはオリゴ糖
または糖アルコールを20〜60重量％、好ましくは
グリシンを１あたり1.0〜3.0モルおよびスクロ
ースを20〜60重量％、第因子および／または第
因子を含有する溶液好ましくは血漿フラクシヨ
ンまたは胎盤フラクシヨンに加え、その混合物を
30℃〜100℃好ましくは60℃〜100℃の温度で加熱
し、そして１分間ないし48時間好ましくは約10時
間この温度で保持する。その際に最も短い時間は
最も高い温度と組み合わされ、またその逆のこと
も云える。最高の収率を得るためにはそのPH値を
溶液中に存在するそれぞれの凝固因子に特定的に
適合させなければならない。一般的に6.5〜8.0の
範囲内でPH値を保持すべきである。実質的に肝炎
に関して安全である第因子および／または第
因子の製剤が得られる。 キレート剤、アミノ酸または炭水化物が所望の
温度において相応してより高い溶解度を有する場
合には、キレート剤、アミノ酸または炭水化物の
溶解度により１あたり１あたり0.3〜3.0モル
または60重量％の値をそれぞれさらに高濃度に拡
張することができる。この熱処理はまた数種の順
次的段階で行なうこともできる。 エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩のグリ
シンおよびスクロースとの好ましい組合わせを使
用した場合、つぎの条件下で加熱することにより
すなわちPH値6.8〜8.0において１あたり0.05〜
0.3モルの濃度のEDTA―Na2、40〜60重量％の
濃度のスクロースおよび１あたり1.0〜2.5モル
の濃度のグリシンの存在下で60〜70℃で10〜20時
間加熱することにより肝炎に関して安全な製剤が
得られる。 本発明よる方法はEDTA―Na2を添加するため
にドイツ特許出願公開第2916711号公報の方法よ
りも優れている。表に示されたように第因子の
安定化はかなり改善されており、そして第因子
のそれはEDTA―Na2を用いた場合には不可能で
あろう。
場合にはアミノ酸および／または糖または糖アル
コールの存在下で加温することにより、実質的に
肝炎に関して安全な血液凝固第因子（プロトロ
ンピン）および／または第因子の製剤を生成す
る方法に関する。 血液凝固は段階的に進行し、種々の生理学的な
らびに病理学的原因により引き起こされ、そして
その過程が約20種の促進および阻害因子に従属し
ているような複雑な作用である。これらの血液凝
固因子が減少または増大する結果として血液凝固
障害が起こり、そしてこれらのうちのいくつかは
疾患として現われる。 従つてたとえば肝蔵の合成能低下による肝疾患
は血漿プロトロンビンレベル（第因子レベル）
および血漿プロコンバーチレベル（第因子レベ
ル）の下をもたらし、そしてこれは生命を危険に
さらす自然の出血に導くことができる過程であ
る。この場合に第／第因子の濃縮物は即時作
用する治療のために選択される薬物である。 第因子製剤はSoulier氏ら〔「Thrombos.
Diath.Haemorrh.Suppl.」第35巻第61頁（1969
年）〕の方法により生成することができる。 そのような製剤は肝炎を引き起こす危険性がな
いとは云えない。アルブミンはそれを安定剤の存
在下において水性溶液中60℃で10時間加熱した場
合に肝炎に関して安全であると考えられている
〔「J.Clin.Invest.」第27巻第239頁（1948年）参
照〕。従つて適当な安定剤の存在下で加熱された
第／第因子の濃縮物もまた肝炎に関して安全
であると推測することができる。 ドイツ特許出願公開第2916711号公報にはアミ
ノ酸および単糖またはオリゴ糖または糖アルコー
ルを加えることにより水性溶液中の凝固因子を熱
に対して安定化する方法が開示されている。 しかしながらこの方法でさえも第因子を得る
場合にかなりの損失を阻止することはできない
（上記のドイツ特許出願公開公報の実施例４）。通
常第因子の濃縮物中に含有され、そしてその因
子を活性化するために重要である第、およびＸ
因子は上記の条件下で完全に不活性化される。 従つて活性の喪失を低減するために第因子の
水性溶液を熱に対して安定化する方法を発見する
ことはいまだに重要な目的である。 驚くべきことには今やキレート剤たとえばエチ
レンジアミン四酢酸を加えることにより第因子
および／または第因子の水性溶液を熱に対して
安定化できることが見い出された。熱による不活
性化に対して第因子を安定化する方法は現在ま
で知られていない。 本発明はキレート剤の存在下で加温することか
らなり、場合によりアミノ酸およびまたは糖また
は糖アルコールの存在下で加温することにより、
実質的に肝炎に関して安全である血液凝固第お
よび／または第因子の製剤を生成するための方
法に関する。この種のキレート剤の例としてはエ
チレンジアミン四酢酸（EDTA）、エチレングリ
コール―ビス―（２―アミノエチルエーテル）―
四酢酸（EGTA）、ジアミノシクロヘキサン四酢
酸（CDTA）、ジアミノプロパン四酢酸、ジアミ
ノプロパン―２―オール―四酢酸およびニトロト
リ酢酸ならびにこれらの可溶性金属塩があげられ
る。 エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびエ
チレングリコール―ビス―（２―アミノエチルエ
ーテル）―四酢酸（EGTA）のナトリウム塩を
使用するのが好ましい。 現段階の知識によれば、この種のキレート剤の
存在下においては肝炎病原菌の伝達を実質的に排
除することができるほど長時間凝固因子の水性溶
液を加熱することができる。これは特に活性成分
が上澄み液に残存しており、そして肝炎ウイルス
を不溶性沈殿とともに分離徐去することができる
ような沈殿操作と組み合わせて応用される。水性
溶液中約60℃で最低10時間保持された製剤は、今
日実質的に肝炎に関して安全であると考えられ、
特に使用される出発物質が第３世代について試験
したのち肝炎ウイルスを検出することができない
ような人の組織である場合に特にそうであると考
えられる。 本発明の特に好ましい態様においては上記のキ
レート剤のうちの１種を１あたり0.1〜0.3モ
ル、好ましくはエチレンジアミン四酢酸のナトリ
ウム塩を１あたり0.05〜0.3モル、そして場合
によりアミノ酸であるグリシン、α―またはβ―
アラニン、ヒドロキシプロリン、プロリン、グル
タミンまたはα―、β―またはγ―アミノ酪酸の
うちの少なくとも１種好ましくはグリシンを１
あたり1.0〜3.0モル、および単糖またはオリゴ糖
または糖アルコールを20〜60重量％、好ましくは
グリシンを１あたり1.0〜3.0モルおよびスクロ
ースを20〜60重量％、第因子および／または第
因子を含有する溶液好ましくは血漿フラクシヨ
ンまたは胎盤フラクシヨンに加え、その混合物を
30℃〜100℃好ましくは60℃〜100℃の温度で加熱
し、そして１分間ないし48時間好ましくは約10時
間この温度で保持する。その際に最も短い時間は
最も高い温度と組み合わされ、またその逆のこと
も云える。最高の収率を得るためにはそのPH値を
溶液中に存在するそれぞれの凝固因子に特定的に
適合させなければならない。一般的に6.5〜8.0の
範囲内でPH値を保持すべきである。実質的に肝炎
に関して安全である第因子および／または第
因子の製剤が得られる。 キレート剤、アミノ酸または炭水化物が所望の
温度において相応してより高い溶解度を有する場
合には、キレート剤、アミノ酸または炭水化物の
溶解度により１あたり１あたり0.3〜3.0モル
または60重量％の値をそれぞれさらに高濃度に拡
張することができる。この熱処理はまた数種の順
次的段階で行なうこともできる。 エチレンジアミン四酢酸ジナトリウム塩のグリ
シンおよびスクロースとの好ましい組合わせを使
用した場合、つぎの条件下で加熱することにより
すなわちPH値6.8〜8.0において１あたり0.05〜
0.3モルの濃度のEDTA―Na2、40〜60重量％の
濃度のスクロースおよび１あたり1.0〜2.5モル
の濃度のグリシンの存在下で60〜70℃で10〜20時
間加熱することにより肝炎に関して安全な製剤が
得られる。 本発明よる方法はEDTA―Na2を添加するため
にドイツ特許出願公開第2916711号公報の方法よ
りも優れている。表に示されたように第因子の
安定化はかなり改善されており、そして第因子
のそれはEDTA―Na2を用いた場合には不可能で
あろう。
【表】
加熱された溶液からの凝固因子の回収および精
製は30〜45％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを用
いて沈殿させ、そして上澄み液を0.4〜1.0％
（ｗ／ｖ）の燐酸カルシウムに吸着させることに
より行なわれる。 有利には出発フラクシヨンは安定化されるべき
因子が上記の方法により富化されているようなフ
ラクシヨンである。 関連性のある物質の測定法に関する知識により
第または第因子の富化および精製の目安をモ
ニターすることは当業者によく知られている。こ
れらのモニター法を使用することにより生成物の
満足すべき収率および満足すべき純度に関して操
作条件を制御することができる。 肝炎に関して安全な第および／または第因
子の濃縮物を得るために、使用される出発物はた
とえばSoulier氏らの方法〔「Thrombosis Diath.
Haemrrh.Suppi.」第35巻第61頁（1969年）〕によ
り得られるようなフラクシヨンである。このため
にはEDTA0.01モル／を用いて抗凝固化された
血液から得られた血漿を燐酸カルシウムに吸着さ
せ、そして固体分を遠心分離する。このようにそ
れらの因子は吸着剤に定量的に結合され、そして
えん酸三ナトリウム塩0.2モル／を用いて数回
溶出することにより回収できる。合した溶出液を
−８℃〜＋４℃の温度でアルコールおよび酢酸の
組み合わせを用いて沈殿させることによりさらに
精製する。それらの因子はこのようにして同時に
濃縮される。 上記の濃縮物をPH7.6で適当な緩衝液好ましく
はそれぞれ0.06モル／および0.02モル／の濃
度の塩化ナトリウム塩／くえん酸ナトリウムに溶
解し、そしてそれらの因子の活性を測定する。 活性の測定は当業者によく知られている。第
因子に対してはこれはたとえばF.Koller氏らの方
法〔「Dtsch.med.Wschr.」第81巻第516頁（1956
年）〕により行なうことができる。このためには
第因子を欠く血漿１部たとえば0.1mlおよび希
釈された通常の血漿１部を混合する。この混合物
を＋37℃で30秒間保持する。つぎにたとえばドイ
ツ特許第2356493号明細書に従つて製造されたカ
ルシウムを含有するトロンボプラスチン２部を加
え、そして血餅を生ずるまでに経過した時間を測
定する。定量的データを得るためには通常の血漿
の希釈系列を用いて得られた校正曲線を参照する
ことにより第因子を含有する溶液を用いて得ら
れた凝固時間を読みとる。 第因子１単位は通常の血漿１ml中に含まれる
第因子の活性に相当する。 第因子はたとえばF.Koller氏らの方法
〔「Acta haemat.」第６巻第１頁（1951年）〕によ
り測定することができる。このためには第因子
を欠く血漿１部たとえば0.1mlおよび希釈された
通常の血漿１部を混合する。この混合物を＋37℃
で30秒間保持する。つぎにたとえばドイツ特許第
2356493号明細書に従つて製造されたカルシウム
を含有するトロンボプラスチン２部を加え、そし
て血餅が生ずるまでに経過した時間を測定する。
定量的データを得るためには通常の血漿の希釈系
列を用いて得られた校正曲線を参照することによ
り第因子を含有する溶液を用いて得られた凝固
時間を読みとる。 第因子１単位は通常の血漿１ml中に含まれる
第因子の活性に相当する。 肝炎ウイルスを撲減するためにキレート剤およ
びグリシンおよびスクロースをその溶液に加え、
そして全体を加熱する。 さらに精製するためには必要ならば上記の加熱
された溶液を遠心分離し、そして30〜45％（ｗ／
ｖ）の硫酸アンモニウムを用いて不純物を沈殿さ
せることにより除去する。 上澄み液を0.04〜1.0％（ｗ／ｖ）の燐酸カル
シウムに吸着させ、その吸着している吸着剤を洗
浄し、くえん酸緩衝液で溶出し、そして溶出液を
透析する。 人に投与するためにはその生成物を減菌過に
付す。 本発明は特に肝炎に関して安全な第および第
因子の製剤に関するものであり、それはこの方
法により得ることができ、そして蛋白質含有量が
低い。 保存の際の安定性を増大するために蛋白質安定
化物質たとえば蛋白質、アミノ酸または炭水化物
をその製剤に加えるのが有利である。最後にこの
処理に付された製剤を凍結乾燥された形態で入手
することができ、そしてこの場合に抗凝固剤たと
えばヘパリンを添加することが有利である。 薬学的に投与するのに適当な溶液の場合、本発
明による生成物は凝血異常症を治療するための薬
物であり、そして第因子および／または第因
子の欠如により引き起こされた出血を治療し且つ
予防するために有利には注入剤として静脈内経路
によりそれを使用することができる。 本発明をさらによく理解せしめるために以下に
実施例をあげて説明する。 実施例 １ 人のくえん酸添加血漿からの肝炎に関して安全
な第／第因子凝縮物の製造 陰イオン交換体（タイプA50セフアデツクス―
DEAE）250gをくえん酸添加血漿500に加え、
そしてその混合物を60分間撹拌する。吸着剤を沈
降させたのち上澄み液である血漿をサイフオンで
吸い上げ、そして残留物を0.85％塩化ナトリウム
溶液20で洗浄する。 吸着剤をPH8.0の１モル／塩化ナトリウム溶
液7.5で溶出し、つぎに廃棄する。溶出液にグ
リシン1.12Kg、スクロース11.2KgおよびEDTA―
Na2143gを加え、そしてその混合物をPH7.6で且
つ60℃で10時間加熱する。 冷却後その混合物を蒸留水50で希釈し、そし
て40％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム濃度とな
す。沈殿を遠心分離し、そして廃棄する。燐酸カ
ルシウム0.5Kgを上澄み液に加え、それをPH7.6で
30分間放置する。遠心分離したのち上澄み液を廃
棄し、そして吸着剤を0.5モル／塩化ナトリウ
ム溶液10で２回洗浄する。0.2モル／のくえ
ん酸三ナトリウム塩、0.15モル／に塩化ナトリ
ウム、2g／100mlのグリシン、0.3U／mlのアンチ
トロンビンおよび14IU／mlのヘパリンを含有
するPH8.0の緩衝液1.8を用いてその吸着剤を溶
出する。遠心分離補助剤としてコロイド状シリカ
0.2g／100mlを加えたのち30000gで遠心分離する
ことにより溶出液を吸着剤から分離する。残留物
を廃棄し、そして0.06モル／の塩化ナトリウ
ム、0.02モル／のくえん酸三ナトリウム塩およ
び2g／100mlのグリシンを含有するPH７の緩衝液
100に対してその上澄み液を３時間透析する。
透析物を第および第因子の活性について試験
し、所望の濃度に調節し、減菌過し、単位薬量
に分割し、そして凍結乾燥する。 それぞれ200単位の第因子を含む約250個の薬
量単位が血漿500から得られる。 実施例 ２ Soulier氏らの方法〔Thromb.Diath.
Haemorrh.Suppl.」第35巻第61頁（1969年）〕に
より生成された第因子複合体の濃縮物の肝炎ウ
イルス不活性化のための加熱 それぞれ約200単位を有する第因子濃縮物の
４個の薬量単位から得られた凍結乾燥生成物を、
2.2モル／のグリシン、1g／mlのスクロースお
よび800mgのEDTA―Na2を含有する水性溶液20
mlに溶解する。そのPH値は7.6である。完全に溶
解したのちその容器を密封し、そして水浴中60℃
で10時間インキユベートする。冷却したのちその
混合物を蒸留水160mlで希釈し、そして40％
（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで飽和させる。沈殿
を遠心分離し、そして上澄み液を燐酸カルシウム
0.8gに吸着させる。 以下のすべての段階は換算しうる量的割合を考
慮して実施例１と同様に行なわれる。
製は30〜45％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウムを用
いて沈殿させ、そして上澄み液を0.4〜1.0％
（ｗ／ｖ）の燐酸カルシウムに吸着させることに
より行なわれる。 有利には出発フラクシヨンは安定化されるべき
因子が上記の方法により富化されているようなフ
ラクシヨンである。 関連性のある物質の測定法に関する知識により
第または第因子の富化および精製の目安をモ
ニターすることは当業者によく知られている。こ
れらのモニター法を使用することにより生成物の
満足すべき収率および満足すべき純度に関して操
作条件を制御することができる。 肝炎に関して安全な第および／または第因
子の濃縮物を得るために、使用される出発物はた
とえばSoulier氏らの方法〔「Thrombosis Diath.
Haemrrh.Suppi.」第35巻第61頁（1969年）〕によ
り得られるようなフラクシヨンである。このため
にはEDTA0.01モル／を用いて抗凝固化された
血液から得られた血漿を燐酸カルシウムに吸着さ
せ、そして固体分を遠心分離する。このようにそ
れらの因子は吸着剤に定量的に結合され、そして
えん酸三ナトリウム塩0.2モル／を用いて数回
溶出することにより回収できる。合した溶出液を
−８℃〜＋４℃の温度でアルコールおよび酢酸の
組み合わせを用いて沈殿させることによりさらに
精製する。それらの因子はこのようにして同時に
濃縮される。 上記の濃縮物をPH7.6で適当な緩衝液好ましく
はそれぞれ0.06モル／および0.02モル／の濃
度の塩化ナトリウム塩／くえん酸ナトリウムに溶
解し、そしてそれらの因子の活性を測定する。 活性の測定は当業者によく知られている。第
因子に対してはこれはたとえばF.Koller氏らの方
法〔「Dtsch.med.Wschr.」第81巻第516頁（1956
年）〕により行なうことができる。このためには
第因子を欠く血漿１部たとえば0.1mlおよび希
釈された通常の血漿１部を混合する。この混合物
を＋37℃で30秒間保持する。つぎにたとえばドイ
ツ特許第2356493号明細書に従つて製造されたカ
ルシウムを含有するトロンボプラスチン２部を加
え、そして血餅を生ずるまでに経過した時間を測
定する。定量的データを得るためには通常の血漿
の希釈系列を用いて得られた校正曲線を参照する
ことにより第因子を含有する溶液を用いて得ら
れた凝固時間を読みとる。 第因子１単位は通常の血漿１ml中に含まれる
第因子の活性に相当する。 第因子はたとえばF.Koller氏らの方法
〔「Acta haemat.」第６巻第１頁（1951年）〕によ
り測定することができる。このためには第因子
を欠く血漿１部たとえば0.1mlおよび希釈された
通常の血漿１部を混合する。この混合物を＋37℃
で30秒間保持する。つぎにたとえばドイツ特許第
2356493号明細書に従つて製造されたカルシウム
を含有するトロンボプラスチン２部を加え、そし
て血餅が生ずるまでに経過した時間を測定する。
定量的データを得るためには通常の血漿の希釈系
列を用いて得られた校正曲線を参照することによ
り第因子を含有する溶液を用いて得られた凝固
時間を読みとる。 第因子１単位は通常の血漿１ml中に含まれる
第因子の活性に相当する。 肝炎ウイルスを撲減するためにキレート剤およ
びグリシンおよびスクロースをその溶液に加え、
そして全体を加熱する。 さらに精製するためには必要ならば上記の加熱
された溶液を遠心分離し、そして30〜45％（ｗ／
ｖ）の硫酸アンモニウムを用いて不純物を沈殿さ
せることにより除去する。 上澄み液を0.04〜1.0％（ｗ／ｖ）の燐酸カル
シウムに吸着させ、その吸着している吸着剤を洗
浄し、くえん酸緩衝液で溶出し、そして溶出液を
透析する。 人に投与するためにはその生成物を減菌過に
付す。 本発明は特に肝炎に関して安全な第および第
因子の製剤に関するものであり、それはこの方
法により得ることができ、そして蛋白質含有量が
低い。 保存の際の安定性を増大するために蛋白質安定
化物質たとえば蛋白質、アミノ酸または炭水化物
をその製剤に加えるのが有利である。最後にこの
処理に付された製剤を凍結乾燥された形態で入手
することができ、そしてこの場合に抗凝固剤たと
えばヘパリンを添加することが有利である。 薬学的に投与するのに適当な溶液の場合、本発
明による生成物は凝血異常症を治療するための薬
物であり、そして第因子および／または第因
子の欠如により引き起こされた出血を治療し且つ
予防するために有利には注入剤として静脈内経路
によりそれを使用することができる。 本発明をさらによく理解せしめるために以下に
実施例をあげて説明する。 実施例 １ 人のくえん酸添加血漿からの肝炎に関して安全
な第／第因子凝縮物の製造 陰イオン交換体（タイプA50セフアデツクス―
DEAE）250gをくえん酸添加血漿500に加え、
そしてその混合物を60分間撹拌する。吸着剤を沈
降させたのち上澄み液である血漿をサイフオンで
吸い上げ、そして残留物を0.85％塩化ナトリウム
溶液20で洗浄する。 吸着剤をPH8.0の１モル／塩化ナトリウム溶
液7.5で溶出し、つぎに廃棄する。溶出液にグ
リシン1.12Kg、スクロース11.2KgおよびEDTA―
Na2143gを加え、そしてその混合物をPH7.6で且
つ60℃で10時間加熱する。 冷却後その混合物を蒸留水50で希釈し、そし
て40％（ｗ／ｖ）の硫酸アンモニウム濃度とな
す。沈殿を遠心分離し、そして廃棄する。燐酸カ
ルシウム0.5Kgを上澄み液に加え、それをPH7.6で
30分間放置する。遠心分離したのち上澄み液を廃
棄し、そして吸着剤を0.5モル／塩化ナトリウ
ム溶液10で２回洗浄する。0.2モル／のくえ
ん酸三ナトリウム塩、0.15モル／に塩化ナトリ
ウム、2g／100mlのグリシン、0.3U／mlのアンチ
トロンビンおよび14IU／mlのヘパリンを含有
するPH8.0の緩衝液1.8を用いてその吸着剤を溶
出する。遠心分離補助剤としてコロイド状シリカ
0.2g／100mlを加えたのち30000gで遠心分離する
ことにより溶出液を吸着剤から分離する。残留物
を廃棄し、そして0.06モル／の塩化ナトリウ
ム、0.02モル／のくえん酸三ナトリウム塩およ
び2g／100mlのグリシンを含有するPH７の緩衝液
100に対してその上澄み液を３時間透析する。
透析物を第および第因子の活性について試験
し、所望の濃度に調節し、減菌過し、単位薬量
に分割し、そして凍結乾燥する。 それぞれ200単位の第因子を含む約250個の薬
量単位が血漿500から得られる。 実施例 ２ Soulier氏らの方法〔Thromb.Diath.
Haemorrh.Suppl.」第35巻第61頁（1969年）〕に
より生成された第因子複合体の濃縮物の肝炎ウ
イルス不活性化のための加熱 それぞれ約200単位を有する第因子濃縮物の
４個の薬量単位から得られた凍結乾燥生成物を、
2.2モル／のグリシン、1g／mlのスクロースお
よび800mgのEDTA―Na2を含有する水性溶液20
mlに溶解する。そのPH値は7.6である。完全に溶
解したのちその容器を密封し、そして水浴中60℃
で10時間インキユベートする。冷却したのちその
混合物を蒸留水160mlで希釈し、そして40％
（ｗ／ｖ）硫酸アンモニウムで飽和させる。沈殿
を遠心分離し、そして上澄み液を燐酸カルシウム
0.8gに吸着させる。 以下のすべての段階は換算しうる量的割合を考
慮して実施例１と同様に行なわれる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ キレート剤の存在下でそして場合によりアミ
ノ酸および／または糖または糖アルコールの存在
下で加温することを特徴とする、実質的に肝炎に
関して安全な血液凝固第および／または第因
子の生成方法。 ２ キレート剤がエチレンジアミン四酢酸または
エチレングリコール―ビス―（２―アミノエチル
エーテル）―四酢酸のナトリウム塩である特許請
求の範囲第１項記載の方法。 ３ キレート剤が１あたり0.1〜１モルの濃度
で存在する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ キレート剤を１あたり0.1〜0.3モル、そし
て場合によりアミノ酸であるグリシン、α―また
はβ―アラニン、ヒドロキシプロリン、プロリ
ン、グルタミンおよびα―、β―またはγ―アミ
ノ酪酸のうちの少なくとも１種を１あたり1.0
〜3.0モルおよび単糖またはオリゴ糖または糖ア
ルコールを20〜60重量％加え、そしてその混合物
を30℃〜100℃の温度で１分間ないし48時間加熱
することからなる、特許請求の範囲第１項記載の
方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19803043857 DE3043857A1 (de) | 1980-11-21 | 1980-11-21 | Verfahren zur herstellung von blutgerinnungsfaktoren und danach hergestellte praeparation der faktoren ii und vii |
Publications (2)
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|---|---|
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| JPH0143728B2 true JPH0143728B2 (ja) | 1989-09-22 |
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Family Applications (1)
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| EP (1) | EP0052827B1 (ja) |
| JP (1) | JPS57116018A (ja) |
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