JPH0145360B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明は安定な配糖体組成物に関するものであ
り、さらに詳しくは共役酵素法を利用するα−ア
ミラーゼ活性測定試薬の基質として有用な配糖体
に関するものである。 （従来の技術） 血清、尿、膵液等の体液を対象とするα−アミ
ラーゼ活性の測定は、臨床診断上重要な意義を有
しており、特に急性或は慢性の膵炎、膵臓癌、更
には流行性耳下腺炎等の鑑別診断に当つては必須
の測定項目となつている。 従来、提案されているα−アミラーゼ活性の測
定法の中で共役酵素法が最近注目されている。共
役酵素法としては、特に特開昭53−11092号公報、
特開昭54−25893号公報、特開昭54−51892号公報
に開示されているようなオリゴ糖の還元性末端に
ｐ−ニトロフエノール、４−メチルウンベリフエ
ロンを代表とする吸光性及び感光性のフエノール
性ヒドロキシル基を有する化合物がグリコシド結
合した配糖体を基質として用いる方法が特に優
れ、実用化されている。また特開昭56−35998号
公報に開示されているようなオリゴ糖の還元性末
端に２，４−ジクロロフエノール等のフエノール
性ヒドロキシル基を有する化合物であつて、例え
ば４−アミノアンチピリン等と酸化縮合して有色
色素を生成するものがグリコシド結合したオリゴ
糖アグリコンとして用いる方法も実用化されてい
る。 （発明の解決しようとする問題点） ところがオリゴ糖の重合度が５、６又は７であ
る上記配糖体を基質とする共役酵素法によるα−
アミラーゼ活性測定法では、基質の溶液安定性が
十分なものではなく、数日ないし数週間にわたつ
て使用する場合、保存中において基質が分解して
試薬ブランクの上昇、更には基質量不足を生ずる
ことがある。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは基質を含む溶液の安定化を計る目
的で種々検討したところ、特定濃度のノニオン界
面活性剤を配合すると基質が著しく安定化するこ
とを見出し、本発明に到達した。 すなわち本発明は繰り返し単位が１〜10である
マルトオリゴ糖の還元末端ヒドロキシル基に水酸
基を有する芳香族化合物が結合した配糖体を全組
成物に対して0.02〜100mg／mlおよびノニオン界
面活性剤を全組成物に対して0.2容量％以上含有
する緩衝液又は水からなることを特徴とするα−
アミラーゼ測定用基質溶液である。 本発明における配糖体は、繰返し単位数が１〜
10であるマルトオリゴ糖の還元性末端ヒドロキシ
基に対し、水酸基を有する芳香族化合物がグリコ
シド結合したものである。グリコシド結合はα−
結合、β−結合のいずれでもよい。ここでマルト
オリゴ糖としては、例えばマルトース、マルトト
リオース、マルトテトラオース、マルトペンタオ
ース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース
などがあり、特にマルトテトラオース、マルトペ
ンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタ
オースが好ましい。 本発明におけるマルトオリゴ糖に結合したアグ
リコンとしては、グルコシダーゼの作用により遊
離し、遊離することにより呈色するか、あるいは
定量が容易なものであれば何れでもよいが、特に
水酸基を有する芳香族化合物である。 本発明のマルトオリゴ糖の還元性末端にα−ま
たはβ−結合により結合した水酸基を有する芳香
族化合物としては、フエノールの外に、ハロゲン
原子、ヒドロキシ基、炭素原子数１〜６のアルキ
ル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基ま
たはニトロ基を有するフエノール類であり、例え
ばクロロフエノール、ジクロロフエノール、ヒド
ロキシフエノール、アルキルフエノール、アルコ
キシフエノール、安息香酸またはニトロフエノー
ル、ハロゲン化ニトロフエノール、アルキル化ニ
トロフエノール、アルコキシ化ニトロフエノー
ル、ニトロ化安息香酸、ジニトロフエノールなど
が挙げられる。また４−メチル−ウンベリフエロ
ンなどの芳香族化合物であつてもよい。 特に少なくとも１つのニトロ基を有するフエノ
ール類、例えば４−ニトロフエノール、２−クロ
ロ−４−ニトロフエノール、２，６−ジクロロ−
４−ニトロフエノール、２，６−ジブロモ−４−
ニトロフエノール、２−ブロモ−４−ニトロフエ
ノール、２−ニトロフエノール、２−ヒドロキシ
−４−ニトロフエノール、３−ヒドロキシ−４−
ニトロフエノールなどが好ましい。 次に本発明の配糖体を更に具体例によつて説明
すると、例えば下記の様なものが挙げられる。 α−フエニルペンタオサイド、α−２−クロロ
フエニルペンタオサイド、α−２，６−ジクロロ
フエニルペンタオサイド、α−４−ニトロフエニ
ルペンタオサイド、α−２−クロロ−４−ニトロ
フエニルペンタオサイド、α−２−メチル−４−
ニトロフエニルペンタオサイドなどがあり、また
これらのβ−結合体、またはテトラオシド、ヘキ
サオシド、ペンタオサイドなどがある。これらの
混合物であつてもよい。 マルトオリゴ糖は置換基、例えばハロゲン、ア
ルコキシカルボニル基、脂肪族又は芳香族基を結
合したスルホニル基、脂肪族又は芳香族基を結合
したカルボニル基、フエニル基又はグルコース残
基が１，６−結合したマルトオリゴ糖でもよく、
またマルトオリゴ糖鎖の２個の水酸基が分子内架
橋結合したものなど、部分的に修飾されているも
のも含む。 本発明において、配糖体は全組成物に対して
0.2〜100mg／ml、好ましくは0.5〜10mg／ml含有
させる。 基質に対するα−アミラーゼのミカエリス定数
（Km）値が略0.3ｍＭであり、通常Kmの３〜10
倍の基質濃度下で測定されることが基準となる
が、検査分析に供せられる基質溶液中の濃度とし
ては更にこれの１〜20倍であることが好ましい。 本発明において用いるノニオン界面活性剤とし
ては、HLB値が11〜18の範囲のものであれば何
でもよいが、例えばポリオキシエチレン−ｐ−イ
ソオクチルフエニルエーテル、ポリオキシエチレ
ンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンラウリ
ルエステル、ポリオキシエチレン−ｐ−ノニルフ
エニルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエー
テルなどがある。 本発明において、ノニオン界面活性剤は全組成
物に対して0.2容量％以上、好ましくは0.3〜1.2容
量％含有させる。通常、血液等の体液を測定する
ための臨床検査試薬においては体液中の脂質、蛋
白質等に起因する混濁の影響を低減するために、
界面活性剤を添加することが一般に実施されてい
るが、この目的のために添加する界面活性剤の量
は通常0.2容量％未満である。本発明ではノニオ
ン界面活性剤を全組成物に対して0.2容量％以上
含有させることにより、基質である配糖体の安定
化を行なうことができる。0.2容量％未満では安
定化を行なうことができない。 本発明の組成物は上記配糖体およびノニオン界
面活性剤のほかに、緩衝液又は水を含む。 本発明では配糖体を溶解させた緩衝液又は水に
ノニオン界面活性剤を加えてもよいし、又ノニオ
ン界面活性剤を溶解させた緩衝液又は水に配糖体
を加えてもよい。さらに緩衝液又は水に同時に配
糖体とノニオン界面活性剤を添加してもよい。 本発明の配糖体の組成物には必要により発色
材、例えば４−アミノアンチピリンなど、酵素、
例えばα−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ
など、酸化剤、例えば過ヨウ素酸ナトリウムなど
が含有されていてもよい。 本発明の配糖体組成物は体液中のα−アミラー
ゼ活性測定の基質として利用し得る。 （発明の効果） 本発明ではノニオン界面活性剤を全組成物に対
して0.2容量％以上含有させることにより、配糖
体の安定性向上させることができる。特にノニオ
ン界面活性剤が0.1容量％では保管日数（25℃）
７日で安定性が失なわれるに比して、ノニオン界
面活性剤が0.2容量％以上では７日以上安定に保
管することができる。 （実施例） 以下本発明を実施例により説明する。 実施例 １ ピペス緩衝液（PH6.7）0.05Mにβ−２，４−
ジクロロフエニルマルトペンタオサイド
4μmole／mlおよび４−アミノアンチピリン
4μmole／mlを加えて基質含有緩衝液を得た。次
いでトリトン−Ｘ（ポリオキシエチレンイソオク
チルフエニルエーテル）を0.6容量％又は1.2容量
％又は第１表に示されるノニオン界面活性剤を添
加して基質試液とした。 得られた基質試液の安定性を測るために下記酵
素試液および発色液を用いて、次の操作により吸
光度を測定した。 試薬組成 酵素試液 ピペス緩衝液 0.05M（PH6.7） α−グルコシダーゼ 100u／ml β−グルコシダーゼ 10u／ml トリトンＸ−100（ポリオキシエチレンイソオク
チルフエニルエーテル） 0.1％ 発色液 ホウ酸緩衝液 0.1M（PH8.4） 過ヨウ素酸ナトリウム水溶液 10ミリモル／ 検体20μを試験管にとり酵素試液0.5mlと混合
し、37℃で約５分間加温した。次いで基質試液
0.5mlを添加し、37℃で正確に10分間加温した後、
発色液2.0mlを添加し、５分間放置の後、吸光度
を波長500nｍで測定した。 本操作を検体の代りに水20μを用いる場合
（試薬ブランク）と２，４−ジクロルフエノール
２ミリモル／含有する水溶液を用いる場合（標
準）についても繰返し測定し、得られた吸光度か
ら次式に従つてα−アミラーゼ値を計算により求
めた。 アミラーゼ活性値（ｕ／）＝検体の吸光度−試
薬ブランク吸光度／標準の吸光度−試薬ブランク吸光度
×2000×１／10 前記種々の基質試液を４℃及び25℃に保管した
場合の試薬ブランクの変化を第１表に示す。試薬
ブランクが経日的に上昇することは該基質（β−
２，４−ジクロロフエニルマルトペンタオサイ
ド）が分解して結果的に２，４−ジクロロフエノ
ールが生成していることに対応する。故に本発明
による試液は配糖体が安定化されていることが明
らかである。

【表】

【表】

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 繰り返し単位が１〜10であるマルトオリゴ糖
   の還元末端ヒドロキシル基に水酸基を有する芳香
   族化合物が結合した配糖体を全組成物に対して
   0.2〜100mg／mlおよびノニオン界面活性剤を全組
   成物に対して0.2容量％以上含有する緩衝液又は
   水からなることを特徴とするα−アミラーゼ測定
   用基質溶液。