JPH0154038B2

JPH0154038B2 -

Info

Publication number: JPH0154038B2
Application number: JP60014114A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Kajiwara; Hideo Suzuki; Hidekatsu Maeda
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1985-01-28
Filing date: 1985-01-28
Publication date: 1989-11-16
Also published as: JPS61173779A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、固定化酵素及びその製造方法に関す
る。

従来より、酵素反応を利用して、有用物質の生
産を行つてきたが、触媒である酵素は水溶性であ
るため、一回の使用だけで廃棄していた。しかし
ながら、酵素は高価であるため、酵素を固定化
し、再利用を図るとともに工程の連続化を行い、
製造コストを大巾に低減させてきた。近年、アミ
ラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素以外に、
ATPやNAD（Ｐ）といつた補酵素を必要とする
ような合成酵素、酸化還元酵素も医療分析の分野
に応用され始め、医薬品、工業原料等の製造に順
次用いられようとしている。しかし、補酵素を必
要とする酵素は、従来の加水分解酵素あるいは異
性化酵素より更に高価でしかも安定性に劣るた
め、従来の固定化法よりも数等優れた固定化法の
出現が期待されている。

酵素の固定化法は大きく３つの方法に大別され
る。第１の方法は、イオン交換樹脂や活性炭など
に酵素を物理的に吸着させる方法である。この方
法では、操作が簡便であるものの、比較的弱い結
合で担体と相互作用している為に、連続反応時に
酵素の脱離が起り、利用できる条件が限られる。

第２の方法は、共有結合法で、担体と酵素を化
学的に共有結合させるものであり、担体と酵素が
強い結合で結ばれる為に、酵素の脱離は極めて少
ないが、酵素分子を化学修飾する為失活などが起
りやすい。特に脱水素酵素及びモノオキシゲナー
ゼなどは不安定な場合が多く、その反応の影響を
大きく受ける。

第３の方法は、包括法であり、酵素をアクリル
アミドやＫ−カラギーナンなどのゲルマトリツク
スやマイクロカプセルで包括する方法である。こ
の包括法は、共有結合法と異なり、酵素分子を直
接化学修飾しないので、失活などが起らない。ま
た、ゲルの網目やマイクロカプセル膜の孔径を適
当に調整することにより、酵素分子をゲル及びマ
イクロカプセル内に捕捉、固定しながら小さな基
質分子のみを通すようにすることが可能であり、
酵素分子の脱離を防止することができる。

一方、前述の補酵素を必要とする酵素は２量体
あるいは４量体を形成している場合が多い。そし
て、各単量体同士の結合力は非常に弱く、４量体
のどこか一個所を担体に共有結合させた場合、４
量体のままで長時間維持させるのはきわめて困難
である。このような場合ではゲル包括法による固
定化が望ましい。また、NAD（Ｐ）Ｈの再生反応
を組合せるために２種類の酵素（リンゴ酸脱水素
酵素及びギ酸脱水素酵素）を同時に固定する場合
は、今までの固定化法で対応できるのはマイクロ
カプセル内に酵素群を包括固定化する方法のみで
ある。ゲル包括法といえどもゲルの１区画に２種
類の酵素をはめ込むのはきわめて困難である。ま
た、酵素の安定条件とゲル化の最適条件がかなら
ずしも一致するとは限らない。しかしながら、既
存のマイクロカプセルでは、カラムに充填して連
続的な生産を行う場合、マイクロカプセルが変形
し、目詰りが起り、圧損失が高くなるという実用
上根本的な欠陥を有している。

本発明は、かかる従来技術の問題を解決するた
になされたもので、酵素を水とほとんど混和しな
い有機溶媒に包まれた液滴中に包含し、その液滴
をゲル素材を含む溶液に分散した後に、ゲル化反
応を起し、ゲルが生成した後に有機溶媒を除いて
非カプセル化状態で多数の独立した酵素を含有す
る液滴を分散保持する液滴固定化酵素ゲルを調製
することを特徴とする。

この方法では、ゲル化反応の起る場と、酵素が
存在する場とが有機溶媒層により遮断される為
に、異つた条件にすることが出来るので、酵素が
安定な条件とゲル化の最適条件とがかなり異つて
いても安定に固定化することが出来る。また、通
常のゲル包括法の場合、酵素の含有量を増すと、
酵素分子がゲルマトリツクスの生成そのものを妨
害し、酵素の漏出が著しく増す場合があるが、こ
の方法では、そういつたこともない。また、特に
共役反応系を固定した場合、ゲル包括体中の無数
の独立した液滴中に全て濃縮して配置される為、
共役反応が効率よく行われる。また従来あまり行
われていない、細胞破砕物と酵素の共役反応の固
定などを容易に行うことができる。温度条件を除
いて、酵素、菌体、菌体破砕物、動植物細胞等の
安定化のために必要とする制限条件にかかわら
ず、ゲル化の最適条件を選ぶことが出来るため、
固く且つ弾性のあるゲルを作ることが出来る。さ
らにカラム中での連続使用に適した液滴包括固定
化酵素ゲルを得ることも可能である。

本発明により得られる固定化酵素は、高分子ゲ
ルマトリツクス中に、酵素を含有する液滴を非マ
イクロカプセル化状態で分散保持させた構造を有
している点で新規である。

基本的には、この固定化酵素の調製法は以下の
とうりである。

酵素及び必要ならば安定剤を含む緩衝液もしく
は水溶液（W₁層）を界面活性剤を含有し、水と
混和しない有機溶媒（Ｏ層）に撹拌分散し、油中
水の液滴を作り、１次乳化液とする。この１次乳
化液を更にゲル素材を含む緩衝液もしくは水溶液
（W₂層）中に撹拌分散して、（W₁／Ｏ）／W₂型
の複合乳化液（２次乳化液）とする。この２次乳
化液を例えば重合開始剤などを加えることによ
り、直ちにゲル化を行なわせ、液滴を無数に包含
したゲル包括体を得る。このゲルを適当な大きさ
に、粉砕、切断等により加工し、緩衝液での洗滌
を行うことによつて、Ｏ層の有機溶媒を徐々に水
中に溶け込ませ、更に洗滌液面から、この有機溶
媒を蒸発させて、Ｏ層を除くことによつて、酵素
を含有した液滴を包括した固定化酵素を調製す
る。このようにして酵素の洩出を認めず、しかも
充填カラム反応器に適した液滴包括固定化酵素ゲ
ルを得る。この固定化法を用いることによつて、
複数の共役反応系を固定化することが出来、しか
も、オルガネラ、菌体破砕物、乾燥菌体、生菌
体、動植物細胞等をそのまま液滴中に包括、固定
化することができる。このような新しい固定化法
は現在まで報告されておらず、酵素利用技術の発
展に寄与する効果はきわめて大きい。

本発明を以下具体的に詳述する。

本発明に用いられる酵素は、反応条件が厳しく
ないため、特に不安定な酵素でない限り使用可能
である。具体的酵素名としては、アルコール脱水
素酵素、アルデヒド脱水素酵素、グルタミン酸脱
水素酵素、イソロイシン脱水素酵素、ギ酸脱水素
酵素、乳酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グ
ルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリセルアル
デヒド−３−リン酸脱水素酵素などの脱水素酵
素、オルシノール−２−モノオキシゲナーゼ、フ
エノール−２−モノオキシゲナーゼなどのモノオ
キシゲナーゼ、酢酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、
グリセロールキナーゼなどのキナーゼなどの補酵
素を必要とする酵素群の他、β−アミラーゼ、グ
ルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ、リパー
ゼ、ホスフアターゼ、プロテアーゼ、エステラー
ゼなどの加水分解酵素、グルコースオキシダー
ゼ、パーオキシダーゼのようなオキシゲナーゼな
どがあげられる。また、酵素は、精製されたもの
でなくて良い。したがつて、必要酵素活性を持つ
培養液、培養濾液、生菌体、乾燥菌体、菌体破砕
物、オルガネラ、プロトプラスト、動・植物細
胞、細胞破砕物でも良い。但し、それらのものが
固体である場合、液滴内に入り得るような微細な
ものにする必要がある。更にこれらの酵素を混合
物として使用してもよい。補酵素を仲介とするよ
うな共役反応を行う酵素系の場合は、より好都合
である。なぜならば、酵素は液滴中に閉じ込めら
れているにもかかわらず、遊離で存在するため、
共有結合法に見られるように物理的あるいは立体
的な障害による反応阻害が存在せず、また、ゲル
中では液滴という限られた空間に酵素が濃縮され
て存在するために、反応が速く行なわれるためで
ある。

しかしながら、酵素が高分子のゲル中に含まれ
るため、高分子を基質とするような酵素、α−ア
ミラーゼ、キチナーゼ、セルラーゼなどの加水分
解酵素の場合には、この固定化法は有効ではな
い。しかし、これらの酵素を用いて、低分子基質
を分解する場合には、有効である。

本発明でいう安定剤とは、酵素を安定化する薬
剤のことであり、ヘモグロビン、ゼラチン、血清
アルブミンのような蛋白質、アラビアゴム、澱粉
のような多糖類、ポリエチレングリコール、ポリ
ビニルアルコールのような水溶性合成高分子、
NAD（Ｐ），ATPのような補酵素、EDTAのよう
なキレート剤、特別の場合では、金属塩、グルタ
チオンなどの抗酸化剤などであり、どのような物
を組合わせるかは使用される酵素により異る。こ
れらのものは、市販の酵素標品に含まれるもの
で、長期間の酵素活性の維持に役立つものであ
り、本来安定性の高い酵素の場合には、必要では
なく、本固定化酵素調製の際にも添加する必要は
ない。

また、ゲル化に際しW₁層とW₂層はＯ層により
へだてられている為、本来的にゲル架橋反応を阻
害するようなものでも安定剤として使用すること
が出来る。

本発明でいう緩衝液は、架橋反応や酵素活性の
安定に適したものならばいずれのものでも良く、
W₁層とW₂層はゲル化時にＯ層によりへだてられ
ている為、全く異つたものでも良いので、架橋反
応や酵素活性の安定に最適のものを選択すること
が出来る。

本発明で用いる有機溶媒は、沸点が100℃以下
で且つ水とほとんど混和しない性質のものであれ
ば良く、例えば、ベンゼン、シクロヘキサン、エ
チルエーテル、酢酸エチル、四塩化炭素、クロロ
ホルム、ハロゲン化エチレンなどが挙げられる。

本発明で用いるゲル素材は、W₂層に含有され、
固定化酵素のゲルマトリツクスを供給するような
ものならばいずれのものでも良く、生成する液滴
が数μｍ〜数百μｍの大きさを有するので、大抵
のゲルから脱落することはない。例えば、普通よ
く用いられるアクリルアミドによる重合法やメタ
クリルアミド、アクリル酸、ヒドロキシエチルメ
タクリレートなどのコポリマーとの共重合法、光
架橋性モノマーや光架橋性プレポリマーやウレタ
ンプレポリマーなどによる方法がある。また、以
下に示した架橋と組合せた親水性高分子によるゲ
ル化法がある。

アルギン酸（多価陽イオンによる架橋）；寒天、
カラギーナン（冷却によるゲル化）などの多糖
類；ゼラチン、コラーゲン、アルブミン、カゼイ
ン（グルタルアルデヒドなどとのシツフ塩基によ
る架橋）などの蛋白質；ポリエチレングリコール
ジアクリレート（二重結合のラジカル架橋重合）
ようなビニル基をもつ合成高分子；ポリビニルア
ルコール（PVA）（グルタルアルデハイドなどに
よる架橋）；PVA、ポリエチレンイミン（エピク
ロルヒドリンによる架橋）；PVA、ポリアクリル
アミド、ポリビニルピロリドン（放射線架橋）；
PVA（安息香酸ナトリウムとともにUV照射する
事による光架橋）など。

以下、本発明を実施例を用いて説明する。本発
明はこれらの実施例により限定されるものではな
い。

実施例１耐熱性リンゴ酸脱水素酵素（以下MDHと略
記、Thermus thermophilus（サーマスサーモフ
イルス）由来、生化学工業製）150U（国際標準単
位）、ギ酸脱水素酵素（以下FDHと略記、
Candida boidinii（キヤンデイダボイデイニ）由
来、ベーリンガー社製）45Uを含む0.01Mピロリ
ン酸緩衝液（PH8.5）１mlを、界面活性剤
（Span85）４滴を加えたベンゼン１mlに激しく撹
拌しながら滴下した。生成した１次乳化液をポリ
エチレングリコールジアクリレート（分子量約
4000）２ｇ、メチレンビスアクリルアミド100mg
を含む0.01Mピロリン酸緩衝液（PH8.5）10mlに
激しく撹拌しながら滴下した。生成した２次乳化
液に直ちに６％過硫酸カリウム水溶液500μと
ジメチルアミノプロピオニトリル100μを加え、
よく撹拌した後に、窒素ガスを吹きつけながら、
30℃で静置した。約５分でゲル化が起り、その後
２時間、30℃に保つた。生成したゲルをワーリン
グブレンダーで粉砕し、100mlの0.1Mトリス塩酸
緩衝液とともにビーカー中で30℃に保ち、振とう
しながら、ベンゼンを除いた。２時間の振とうの
後吸引濾過し、固定化酵素標品（14.5ｇ）を得
た。

この固定化酵素標品及び洗浄液の活性を測定し
た所、洗浄液中には投入MDH活性の19％、投入
FDH活性の0.5％が測定され、また固定化酵素標
品には、投入MDH活性の19％、投入FDH活性の
10％が測定された。なお、MDHの活性測定はオ
キザロ酢酸0.52mM及びNADH0.2mMの濃度条
件の0.1Mリン酸緩衝液（PH7.5）を用い、30℃で
340nmの吸光度の減少の初速度から求めた（１ユ
ニツトは、PH7.5、30℃の時に１分間に1μmoleの
オキザロ酢酸を還元するのに必要な酸素活性）。
また、FDHの活性測定は、ギ酸33mM及び
NAD1mMの濃度条件の0.1Mリン酸緩衝液（PH
7.5）を用い、30℃で340nmの吸光度の増加の初
速度からFDH活性を求めた（１ユニツトはPH
7.5、30℃の時に１分間に1μmoleのギ酸を酸化す
るのに必要な酵素活性）。

実施例２実施例１で調製したゲル600mgを、キチンフレ
ーク300mg（湿重量）とともに、内径５mm×全長
100mmのカラムに充填し、更に両端をグラスウー
ルで密封した。ついで、このカラムを30℃の恒温
水槽に沈め、基質液を15ml／時間の流速で送液
し、共役反応を行なわせた。なお、基質液として
オキザロ酢酸15mM、ギ酸100mM、NAD0.3mM
を含み、更に安定剤として、システイン1mM、
EDTA0.1mM、防腐剤としてソルビン酸カリウ
ム0.01％を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）
を用いた。基質液は毎日取替え、２週間共役反応
を行わせた。溶出液は7.5mlづつフラクシヨンコ
レクターで分取し、生成リンゴ酸量を測定した。

なお、リンゴ酸量の測定は、NAD2mM及びリ
ンゴ酸脱水素酵素（ブタ心臓由来、ベーリンガー
社製）10ユニツト／mlの濃度条件の0.2Mヒドラ
ジン塩酸緩衝液（PH9.3）を用い、30℃で反応を
行い、初発応時と反応終了時の340nmの吸光度差
から生成NADH量を求め、試料中のリンゴ酸量
を算出した。

この結果、初期（２〜４日）において共役活性
の上昇が見られ、この活性は２週間にわたつて維
持され、安定したリンゴ酸の生産が見られた。こ
の場合、約12日目における基質変換率は約3.5％
であつた。

実施例３ MDH160Uを含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH
7.5）１mlをSpan85 ４滴を加えたベンゼン１ml
に激しく撹拌しながら滴下した。生成した１次乳
化液をアクリルアミド1.9ｇ、メチレンビスアク
リルアミド100mgを含む0.01Mピロリン酸緩衝液
（PH8.5）10mlに激しく撹拌しながら滴下した。生
成した２次乳化液に直ちに0.6％過硫酸カリウム
とジメチルアミノプロピオニトリル10μを加え
撹拌した後、窒素ガスを吹きつけながら30℃に静
置した。約３分でゲル化し、その後２時間30℃に
保つた。生成したゲルをワーリングブレンダーで
粉砕し、100mlのトリス塩酸緩衝液（PH7.5）とと
もに、ビーカー中で、30℃に保ち、振とうしなが
ら、ベンゼンを飛ばした。２時間の振とうの後、
吸引濾過して固定化酵素標品（14.6ｇ）を得た。

この結果、ゲルの洗浄液中には投入MDH活性
の14％が検出された。またゲルの総酵素活性は、
投入MDH活性の５％が測定され、アクリルアミ
ドがポリエチレングリコールジアクリレートと同
様に使用できることが分つた。

実施例４キヤンデイダ・トロピカリス（Candida
tropicalis，IAM12202）をリン酸２水素カリウ
ム0.1％、硫酸マグネシウム７水塩0.05％、塩化
カルシウム２水塩0.01％、食塩0.02％、カザミノ
酸0.4％、イーストエキストラクト0.1％、Ｄ−キ
シロース８％を含むPH5.0の培養液に接種し、30
℃、48時間振とう培養した。菌体を遠心分離で回
収し、洗浄した後に凍結乾燥を行い、アルドース
レダクターゼ活性のある細胞破砕物を得た。

凍結乾燥菌体110mgを0.4mlの0.1Mトリス塩酸
緩衝液（PH7.5）に懸濁し、Span85 ２滴を含む
ベンゼン0.5mlに激しく撹拌しながら滴下し、乳
化を行つた。この１次乳化液をポリエチレングリ
コールジアクリレート（分子量約4000）1.2ｇ及
びメチレンビスアクリルアミド50mgを含む0.01M
ピロリン酸緩衝液（PH8.5）５mlに激しく撹拌し
ながら滴下し、２次乳化液を得た。２次乳化液に
６％過硫酸カリウム250μとジメチルアミノプ
ロピオニトリル50μを加え、よく混和した後に
窒素ガスを吹きつけながら30℃で静置した。約５
分でゲル化が起り、その後３時間25℃に保つた。
生成したゲルをワーリングブレンダーで粉砕し、
50mlのトリス塩酸緩衝液（PH7.5）とともにビー
カー中で30℃に保ち、振とうしながらベンゼンを
除いた。１時間の振とうの後、吸引濾過し、7.7
ｇの固定化細胞破砕物を得た。

この固定化細胞破砕物及び洗浄液を
NADP2mM、グルコース1M、グルコース−６
−リン酸0.3M、グルコース−６−リン酸脱水素
酵素（酵母由来、ベーリンガー社製）5unit／ml
を含む0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH7.5）とともに
30℃で５時間反応を行い、反応液の一部を採り、
固型物を除いた後、イオン交換樹脂によるHPLC
により生成したソルビトール量を測定した。

この結果、洗浄液中にはソルビトールの生成は
認められず、また固定化細胞破砕物ゲルには投入
アルドースレダクターゼ活性の35％が測定され
た。このような方法でも固定化アルドースレダク
ターゼを得ることができ、実用的な観点からもき
わめて有用と考えられる。

実施例５サツカロミセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae、発研１号）をグル
コース１％、イーストエキストラクト0.3％、ペ
プトン0.5％、マルツエキス0.3％を含む培地に接
種し、30℃で２日間振とう培養を行つた。菌体を
遠心分離で回収し、洗浄した後、菌体300mg（湿
重量）を採り700μの0.1Mリン酸緩衝液（PH
6.0）に懸濁した。菌体懸濁液を、Span85を４滴
含むベンゼン１mlに激しく撹拌しながら滴下し１
次乳化液を得た。この乳化液を約60℃の３％カツ
パー・カラギーナン水溶液に激しく撹拌しながら
滴下し、２次乳化液を得た。この２次乳化液をガ
ラス板上に３mm厚にひろげ、ゲル化したものを４
℃に１時間保つた。このゲルを５mm×５mmに切断
し、50mlの1.2％KCl溶液中で30℃で振とうする
ことによつて、ゲルの強化とベンゼンの除去を行
つた。２時間の振とうの後、吸引濾過し、８ｇの
固定化微生物標品を得た。

この標品の２ｇをグルコース１％、イーストエ
キストラクト0.3％、ペプトン0.5％、マルツエキ
ス0.3％、塩化カリウム1.2％を含む培養液に投入
し、30℃で２日間静置した。この結果、顕微鏡下
でゲル中で菌体の生育が認められ、培養濾液に著
しいエタノールの蓄積を認めた。

Claims

【特許請求の範囲】１高分子ゲルマトリツクス中に、酵素を含有す
る多数の独立した液滴を非マイクロカプセル化状
態で分散保持させた構造を有する固定化酵素。２酵素を含有する水性液滴が有機溶媒溶液中に
分散している一次乳化液を、ゲル素材を含有する
水性媒体中に分散させて二次乳化液となし、該ゲ
ル素材をゲル化させた後、該有機溶媒を除去して
該液滴を包括固定化することを特徴とする固定化
酵素の製造法。