JPH0211233B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0211233B2 JPH0211233B2 JP59040185A JP4018584A JPH0211233B2 JP H0211233 B2 JPH0211233 B2 JP H0211233B2 JP 59040185 A JP59040185 A JP 59040185A JP 4018584 A JP4018584 A JP 4018584A JP H0211233 B2 JPH0211233 B2 JP H0211233B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- terminator
- ptp19
- bamh
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、転写の終結に関写する遺伝子である
ターミネーターをクローニングするためのプラス
ミドベクター、すなわち、ターミネーター・クロ
ーニング用プラスミドpTP19−１（以下、pTP19
−１と示す。）に関するものである。 遺伝子の発現とは、一般にDNAに蓄えられた
情報がタンパク質として生産されることを意味し
ているが、遺伝子の発現過程は、DNA中の情報
が一度RNAに移されて、次に、RNAが読みとら
れてタンパク質が作られるという２段階の過程よ
り成り立つている。前者を転写の段階、後者を翻
訳の段階と称するが、微生物の遺伝子の発現の調
節は主に転写の段階で行なわれることが明らかに
されている。転写は、RNAポリメラーゼがDNA
を鋳型としてRNAを合成してゆく反応であるが、
その過程を調べると、DNA上のプロモータと呼
ばれる部位をRNAポリメラーゼが認識してDNA
に結合する転写の開始の過程、DNAに結合した
RNAポリメラーゼが酵素反応により鋳型DNAに
従つてRNAを合成する転写の経継の過程、及び、
DNA上のターミネーターと呼ばれる特定の部位
をRNAポリメラーゼが認識して、RNA合成をや
め、RNAポリメラーゼがDNAから離れる転写の
終結の過程の３段階に分けることができる。 最近の遺伝子操作技術の進歩に伴い、特定の遺
伝子の産物を多量に作らせることが行なわれてい
る。上記の転写のメカニズムを利用し、転写の開
始反応をさかんにすると、具対的には強いプロモ
ータを用いたりするのであるが、そうすると多量
のRNAが作られ、その結果目的のタンパク質を
作らせることができるというものである。一般に
このような操作はプラスミド上にクローン化した
遺伝子について行なうのであるが、プラスミド上
の特定の遺伝子を強力なプロモータの支配下にお
き発現させると、時によつては目的の遺伝子だけ
ではなく、その下流に存在する遺伝子の発現にも
影響を与え、下流の遺伝子産物の増大が宿主菌体
の生存に悪影響をおよぼし、安定に目的遺伝子の
産物を作らせることができなくなることが知られ
ている。このようなことを解消するためには、目
的遺伝子の転写の終結を確実に起させ、その下流
の遺伝子の発現に影響を与えなくすることが必要
であると考えられる。ところが、今のところ転写
の終結に関する研究はそれほど進んでいない。こ
のようなことから、転写の終結に関与する遺伝
子、すなわちターミネーターを効率よく取り出す
技術の開発が必要とされている。 このような背景に鑑み、本発明者らは、鋭意研
究を重ね、すでに創成しているジヒドロ葉酸還元
酵素（以下、DHFRと示す）遺伝子を利用した
転写の開始に関与する遺伝子であるプロモータを
検出するためのプラスミドベクターpTP18−４
［微工研菌寄第7348号（特開昭60−126087参照）］
を用いて、これを組換えることにより、ターミネ
ーターを効率よく分離することができるプラスミ
ドベクター、すなわちターミネーター・クローニ
ング用プラスミドを創成するに至つた。 本発明のターミネーターのクローニングの原理
は、プロモータを欠いたDHFR遺伝子の上流に
何らかのプロモータを導入し、かつ導入したプロ
モータとプロモータを欠いたDHFR遺伝子の間
に特定の制限酵素部位を持つような構造の融合遺
伝子は、導入したプロモータからの転写により、
DHFR遺伝子の転写が行なわれ、DHFRを多量
に作ることができるようになる。ところが、導入
したプロモータとプロモータを欠いたDHFR遺
伝子の間の特定の制限酵素部位に、ターミネータ
ーを含むDNA断片を導入すると、上流のプロモ
ータからの転写は、新たに導入されたターミネー
ターの所で終結し、下流のDHFR遺伝子の転写
が起らなくなり、DHFRを作ることができない。
一方、特定の制限酵素部位に、ターミネーターを
含まない、もしくは、転写を弱めるようなシグナ
ルを含まないDNA断片を導入した場合は、上流
のプロモータからの転写は、新たに導入された
DNA断片上では、終結が起らないので、下流の
DHFR遺伝子の転写が行なわれ、DHFRが多量
に作られるようになる。このように、ターミネー
ターDNAが導入された場合のみ、DHFRの生産
をおさえられるため、DNAの挿入がない場合、
及び、ターミネーターを含まない、もしくは、転
写の減弱シグナルを含まないDNA断片が導入さ
れた場合のいずれの場合とも明瞭に区別できるの
である。 ところで、すでに本発明者らが明らかにしてい
るように（特願昭56−143520）、DHFRを多量に
作る菌体は、トリメトプリム（以下、Tpと略す）
という薬剤に対して耐性を獲得することができ
る。また、その耐性の強さは、菌体中のDHFR
含量に依存する（Iwakura et al；J.
Biochemistry、vol93、pp927（1983））。この性質
を利用すると、ターミネーターがクローン化され
た菌体を容易に選択することができるのである。
すなわち、本発明のターミネーター・クローニン
グ用プラスミドを含有する菌体は、7μｇ／mlの
Tpを含む培地中で生育できるが、このプラスミ
ドにターミネーターがクローン化されたプラスミ
ドを含有する菌体は、もはや、7μｇ／mlのTpを
含む培地中には生育できないのである。本発明の
ターミネーター・クローニング用プラスミドには
選択マーカーとして、アンピシリン耐性を与える
遺伝子を有しているので、プラスミドが導入され
た菌体を、アンピシリンを含む寒天培地上に、コ
ロニーとして得、得られたコロニーについて、
Tp耐性を示すか否かについて調べ、Tp耐性を示
さないコロニーを分離し、その菌体からプラスミ
ドを分離すれば、そのプラスミドには、ターミネ
ーターが組み込まれているのである。 本発明のターミネーター・クローニング用プラ
スミドpTP19−１（以下、pTP19−１と略す）
は、宿主にアンピシリン耐性及びTp耐性を付与
することができ、第１図の制限酵素開裂地図に示
される構造を有し、約5.3キロ塩基対の大きさの
試験管内DNA組換えによつて得られる新規なプ
ラスミドである。そして、pTP19−１は、
Escherichia coliK12C600株に導入されて安定状
態に保たれ、pTP19−１を含有するEscherichia
coliK12C600株は、微工研にFERMP−7476とし
て寄託されている。 本発明のpTP19−１は、すでに本発明者らが
創成しているプロモータ・クローニング用プラス
ミドpTP18−４（特願昭58−234051）に、プラス
ミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺
伝子のプロモータを導入することにより創成する
ことができる。実施例１及び２に記載するよう
に、pTP19−１は、pTP18−４のBamH及び
Pst切断によつて得られる２本のDNA断片のう
ち約4.2キロ塩基対の大きさのDNA断片と、プラ
スミドベクターpBR322のBamH及びPst切
断によつて得られる２本のDNA断片のうち約1.1
キロ塩基対のDNA断片とが制限酵素切断部位の
相補性により結合した構造をしている。従つて、
実施例１に従い製造されたpTP19−１は、
pTP18−４のBamH及びPst切断によつて得
られる２本のDNA断片のうち約4.2キロ塩基対の
大きさのDNA断片と、プラスミドベクター
pBR322のBamH及びPst切断によつて得ら
れる２本のDNA断片のうち約1.1キロ塩基対の大
きさのDNA断片とが結合することによつて得ら
れた物であり、逆にいえば、pTP19−１は、
pTP18−４のBamH及びPst切断によつて得
られる２本のDNA断片のうち約4.2キロ塩基対の
大きさのDNA断片と、プラスミドベクター
pBR322のBamH及びPst切断によつて得ら
れる２本のDNA断片のうち約1.1キロ塩基対の
DNA断片とを制限酵素切断部位の相補性により
結合することによつて得ることができる。２本の
DNA断片の結合は、T4DNAリガーゼを用いて
行うことができる。結合によつて種々の結合物が
できる可能性があるが、上記の２本のDNAが正
しく結合し、pTP19−１の構造をとるものだけ
が、大腸菌にアンピシリン及びTpに対する耐性
を付与できる。アンピシリン及びTp耐性に形質
転換した大腸菌から組換えプラスミドを分離する
ことによりpTP19−１を得ることができるので
ある。pTP19−１に唯一存在する制限酵素
BamH部位は、導入されたプロモータと
pTP18−４に存在するプロモータを欠くDHFR
遺伝子との間に存在する。pTP19−１を含有す
るEscherichia coliK12C600株は、7μｇ／mlの
Tpを含有する培地に生育可能で、約0.24ユニツ
ト／mgタンパクのDHFRを生産し、プラスミド
を含有しないEscherichia coliK12C600株の含有
量の約24倍のDHFRを有している。 ターミネーターのクローニングは、通常のクロ
ーニングにより行なうことができ、制限酵素
BamHによつて切断されたDNA断片とpTP19
−１とを、T4DNAリガーゼにより結合させ融合
プラスミドを作成し、これをEscherichia
coliK12C600株に、通常のトランスホーメシヨン
法、例えば、対数生長期の菌体を低温でCaCl2処
理し、DNA取り込み能力を付与した菌体を作成
し、取り込ませる方法により導入し、これをアン
ピシリンを含む寒天培地に広げ、培養することに
よつて、プラスミドを取り込んだ菌体をコロニー
として分離することができる。得られたコロニー
を保存して、その一部を、つまようじで、7μ
ｇ／mlのTpを含む寒天培地に移し、培養を続け、
生長するか否かを調べ、24〜48時間後に、コロニ
ーが得られないものに対応する保存したコロニー
を分離する。このようにして分離した菌体は、す
でに述べたように、ターミネーターを含むDNA
断片を含んだ融合プラスミドを含んでいるはずで
ある。この菌体から、プラスミドを分離し、これ
を制限酵素BamHで切断することにより、タ
ーミネーターを含むDNA断片を検出し、分離す
ることができる。 本発明のpTP19−１においては、クローニン
グ部位として、制限酵素BamH部位を利用し
ているが、すでに、本発明者らが示した方法（特
願昭58−234051）に従えば、制限酵素BamH
に限定されないことは、明白である。 また、本発明に示したプラスミドの創成方法、
プラスミドの導入方法等、本発明の実施は、当業
者であれば、本明細書によつて容易に行うことが
できる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ pTP19−１の作製。 pTP18−４約1μｇ及びpBR322約1μｇを100μ
の反応液（７ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、
MgCl2、７ｍM2−メルカプトエタノール（以下、
2MEと示す。）６ｍＭ NaCl）中で、２ユニツ
トの制限酵素BamHI及び、２ユニツトの制限酵
素Pstを用いて、30℃、２時間反応させた。
300μの冷エタノールを加え反応を停止させ、
これをドライアイス・エタノール中に10分間放置
した後、12000回転10分間の遠心分離により、
DNAを沈でんとして集め、上清を捨てた。真空
デシケータ中で、エタノールを充分除いた後、
100μのリガーゼ用反応液（70ｍＭ Tvis−
HCl、PH7.4、７ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチオト
レイトール（以下、DTTと示す。）、0.5ｍＭ
ATP）に溶解し、これに、約0.5ユニツトの
T4DNAリガーゼを加え、冷蔵庫中（約４〜10
℃）で、18時間、DNAの連結反応を行わせた。
この反応物を、Norgardらの方法（M.V.
Norgard、K.Keem、J.J.Nonahan；Gene、
vol3、pp299（1978））に従つて、Escherichia
coliK12C600株に取り込ませた。この処理をした
菌体を、50μｇ／mlのアンピシリンナトリウム、
及び7μｇ／mlのTpを含む栄養寒天培地（１中
に２ｇのグルコース、１ｇのK2HPO4、５ｇのイ
ーストエキス、５ｇのポリペプトン及び15ｇの寒
天を含む寒天培地。）上に広げ、37℃で、24時間
培養することにより、500個以上のコロニーを得
ることができた。これらのコロニーから適当に１
個選び、TanakaとWeisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol121、pp354（1975）に従つてプラスミドの調
製を行い、これをpTP19−１と名ずけた。 実施例 ２ pTP19−１の構造。 実施例１において得られたpTP19−１の制限
酵素開裂地図を決定するために、表に示す制限酵
素による切断を行い、これをアガロースゲル電気
流動法により分析し、λフアージDNAの制限酵
素Hind切断によつて得られるDNA断片を分子
サイズのマーカーとして、各切断によつて得られ
るDNA断片の分子サイズを決定したところ以下
の表に示す結果が得られた。
ターミネーターをクローニングするためのプラス
ミドベクター、すなわち、ターミネーター・クロ
ーニング用プラスミドpTP19−１（以下、pTP19
−１と示す。）に関するものである。 遺伝子の発現とは、一般にDNAに蓄えられた
情報がタンパク質として生産されることを意味し
ているが、遺伝子の発現過程は、DNA中の情報
が一度RNAに移されて、次に、RNAが読みとら
れてタンパク質が作られるという２段階の過程よ
り成り立つている。前者を転写の段階、後者を翻
訳の段階と称するが、微生物の遺伝子の発現の調
節は主に転写の段階で行なわれることが明らかに
されている。転写は、RNAポリメラーゼがDNA
を鋳型としてRNAを合成してゆく反応であるが、
その過程を調べると、DNA上のプロモータと呼
ばれる部位をRNAポリメラーゼが認識してDNA
に結合する転写の開始の過程、DNAに結合した
RNAポリメラーゼが酵素反応により鋳型DNAに
従つてRNAを合成する転写の経継の過程、及び、
DNA上のターミネーターと呼ばれる特定の部位
をRNAポリメラーゼが認識して、RNA合成をや
め、RNAポリメラーゼがDNAから離れる転写の
終結の過程の３段階に分けることができる。 最近の遺伝子操作技術の進歩に伴い、特定の遺
伝子の産物を多量に作らせることが行なわれてい
る。上記の転写のメカニズムを利用し、転写の開
始反応をさかんにすると、具対的には強いプロモ
ータを用いたりするのであるが、そうすると多量
のRNAが作られ、その結果目的のタンパク質を
作らせることができるというものである。一般に
このような操作はプラスミド上にクローン化した
遺伝子について行なうのであるが、プラスミド上
の特定の遺伝子を強力なプロモータの支配下にお
き発現させると、時によつては目的の遺伝子だけ
ではなく、その下流に存在する遺伝子の発現にも
影響を与え、下流の遺伝子産物の増大が宿主菌体
の生存に悪影響をおよぼし、安定に目的遺伝子の
産物を作らせることができなくなることが知られ
ている。このようなことを解消するためには、目
的遺伝子の転写の終結を確実に起させ、その下流
の遺伝子の発現に影響を与えなくすることが必要
であると考えられる。ところが、今のところ転写
の終結に関する研究はそれほど進んでいない。こ
のようなことから、転写の終結に関与する遺伝
子、すなわちターミネーターを効率よく取り出す
技術の開発が必要とされている。 このような背景に鑑み、本発明者らは、鋭意研
究を重ね、すでに創成しているジヒドロ葉酸還元
酵素（以下、DHFRと示す）遺伝子を利用した
転写の開始に関与する遺伝子であるプロモータを
検出するためのプラスミドベクターpTP18−４
［微工研菌寄第7348号（特開昭60−126087参照）］
を用いて、これを組換えることにより、ターミネ
ーターを効率よく分離することができるプラスミ
ドベクター、すなわちターミネーター・クローニ
ング用プラスミドを創成するに至つた。 本発明のターミネーターのクローニングの原理
は、プロモータを欠いたDHFR遺伝子の上流に
何らかのプロモータを導入し、かつ導入したプロ
モータとプロモータを欠いたDHFR遺伝子の間
に特定の制限酵素部位を持つような構造の融合遺
伝子は、導入したプロモータからの転写により、
DHFR遺伝子の転写が行なわれ、DHFRを多量
に作ることができるようになる。ところが、導入
したプロモータとプロモータを欠いたDHFR遺
伝子の間の特定の制限酵素部位に、ターミネータ
ーを含むDNA断片を導入すると、上流のプロモ
ータからの転写は、新たに導入されたターミネー
ターの所で終結し、下流のDHFR遺伝子の転写
が起らなくなり、DHFRを作ることができない。
一方、特定の制限酵素部位に、ターミネーターを
含まない、もしくは、転写を弱めるようなシグナ
ルを含まないDNA断片を導入した場合は、上流
のプロモータからの転写は、新たに導入された
DNA断片上では、終結が起らないので、下流の
DHFR遺伝子の転写が行なわれ、DHFRが多量
に作られるようになる。このように、ターミネー
ターDNAが導入された場合のみ、DHFRの生産
をおさえられるため、DNAの挿入がない場合、
及び、ターミネーターを含まない、もしくは、転
写の減弱シグナルを含まないDNA断片が導入さ
れた場合のいずれの場合とも明瞭に区別できるの
である。 ところで、すでに本発明者らが明らかにしてい
るように（特願昭56−143520）、DHFRを多量に
作る菌体は、トリメトプリム（以下、Tpと略す）
という薬剤に対して耐性を獲得することができ
る。また、その耐性の強さは、菌体中のDHFR
含量に依存する（Iwakura et al；J.
Biochemistry、vol93、pp927（1983））。この性質
を利用すると、ターミネーターがクローン化され
た菌体を容易に選択することができるのである。
すなわち、本発明のターミネーター・クローニン
グ用プラスミドを含有する菌体は、7μｇ／mlの
Tpを含む培地中で生育できるが、このプラスミ
ドにターミネーターがクローン化されたプラスミ
ドを含有する菌体は、もはや、7μｇ／mlのTpを
含む培地中には生育できないのである。本発明の
ターミネーター・クローニング用プラスミドには
選択マーカーとして、アンピシリン耐性を与える
遺伝子を有しているので、プラスミドが導入され
た菌体を、アンピシリンを含む寒天培地上に、コ
ロニーとして得、得られたコロニーについて、
Tp耐性を示すか否かについて調べ、Tp耐性を示
さないコロニーを分離し、その菌体からプラスミ
ドを分離すれば、そのプラスミドには、ターミネ
ーターが組み込まれているのである。 本発明のターミネーター・クローニング用プラ
スミドpTP19−１（以下、pTP19−１と略す）
は、宿主にアンピシリン耐性及びTp耐性を付与
することができ、第１図の制限酵素開裂地図に示
される構造を有し、約5.3キロ塩基対の大きさの
試験管内DNA組換えによつて得られる新規なプ
ラスミドである。そして、pTP19−１は、
Escherichia coliK12C600株に導入されて安定状
態に保たれ、pTP19−１を含有するEscherichia
coliK12C600株は、微工研にFERMP−7476とし
て寄託されている。 本発明のpTP19−１は、すでに本発明者らが
創成しているプロモータ・クローニング用プラス
ミドpTP18−４（特願昭58−234051）に、プラス
ミドベクターpBR322のテトラサイクリン耐性遺
伝子のプロモータを導入することにより創成する
ことができる。実施例１及び２に記載するよう
に、pTP19−１は、pTP18−４のBamH及び
Pst切断によつて得られる２本のDNA断片のう
ち約4.2キロ塩基対の大きさのDNA断片と、プラ
スミドベクターpBR322のBamH及びPst切
断によつて得られる２本のDNA断片のうち約1.1
キロ塩基対のDNA断片とが制限酵素切断部位の
相補性により結合した構造をしている。従つて、
実施例１に従い製造されたpTP19−１は、
pTP18−４のBamH及びPst切断によつて得
られる２本のDNA断片のうち約4.2キロ塩基対の
大きさのDNA断片と、プラスミドベクター
pBR322のBamH及びPst切断によつて得ら
れる２本のDNA断片のうち約1.1キロ塩基対の大
きさのDNA断片とが結合することによつて得ら
れた物であり、逆にいえば、pTP19−１は、
pTP18−４のBamH及びPst切断によつて得
られる２本のDNA断片のうち約4.2キロ塩基対の
大きさのDNA断片と、プラスミドベクター
pBR322のBamH及びPst切断によつて得ら
れる２本のDNA断片のうち約1.1キロ塩基対の
DNA断片とを制限酵素切断部位の相補性により
結合することによつて得ることができる。２本の
DNA断片の結合は、T4DNAリガーゼを用いて
行うことができる。結合によつて種々の結合物が
できる可能性があるが、上記の２本のDNAが正
しく結合し、pTP19−１の構造をとるものだけ
が、大腸菌にアンピシリン及びTpに対する耐性
を付与できる。アンピシリン及びTp耐性に形質
転換した大腸菌から組換えプラスミドを分離する
ことによりpTP19−１を得ることができるので
ある。pTP19−１に唯一存在する制限酵素
BamH部位は、導入されたプロモータと
pTP18−４に存在するプロモータを欠くDHFR
遺伝子との間に存在する。pTP19−１を含有す
るEscherichia coliK12C600株は、7μｇ／mlの
Tpを含有する培地に生育可能で、約0.24ユニツ
ト／mgタンパクのDHFRを生産し、プラスミド
を含有しないEscherichia coliK12C600株の含有
量の約24倍のDHFRを有している。 ターミネーターのクローニングは、通常のクロ
ーニングにより行なうことができ、制限酵素
BamHによつて切断されたDNA断片とpTP19
−１とを、T4DNAリガーゼにより結合させ融合
プラスミドを作成し、これをEscherichia
coliK12C600株に、通常のトランスホーメシヨン
法、例えば、対数生長期の菌体を低温でCaCl2処
理し、DNA取り込み能力を付与した菌体を作成
し、取り込ませる方法により導入し、これをアン
ピシリンを含む寒天培地に広げ、培養することに
よつて、プラスミドを取り込んだ菌体をコロニー
として分離することができる。得られたコロニー
を保存して、その一部を、つまようじで、7μ
ｇ／mlのTpを含む寒天培地に移し、培養を続け、
生長するか否かを調べ、24〜48時間後に、コロニ
ーが得られないものに対応する保存したコロニー
を分離する。このようにして分離した菌体は、す
でに述べたように、ターミネーターを含むDNA
断片を含んだ融合プラスミドを含んでいるはずで
ある。この菌体から、プラスミドを分離し、これ
を制限酵素BamHで切断することにより、タ
ーミネーターを含むDNA断片を検出し、分離す
ることができる。 本発明のpTP19−１においては、クローニン
グ部位として、制限酵素BamH部位を利用し
ているが、すでに、本発明者らが示した方法（特
願昭58−234051）に従えば、制限酵素BamH
に限定されないことは、明白である。 また、本発明に示したプラスミドの創成方法、
プラスミドの導入方法等、本発明の実施は、当業
者であれば、本明細書によつて容易に行うことが
できる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ pTP19−１の作製。 pTP18−４約1μｇ及びpBR322約1μｇを100μ
の反応液（７ｍＭ Tris−HCl、PH7.4、
MgCl2、７ｍM2−メルカプトエタノール（以下、
2MEと示す。）６ｍＭ NaCl）中で、２ユニツ
トの制限酵素BamHI及び、２ユニツトの制限酵
素Pstを用いて、30℃、２時間反応させた。
300μの冷エタノールを加え反応を停止させ、
これをドライアイス・エタノール中に10分間放置
した後、12000回転10分間の遠心分離により、
DNAを沈でんとして集め、上清を捨てた。真空
デシケータ中で、エタノールを充分除いた後、
100μのリガーゼ用反応液（70ｍＭ Tvis−
HCl、PH7.4、７ｍＭ MgCl2、10ｍＭジチオト
レイトール（以下、DTTと示す。）、0.5ｍＭ
ATP）に溶解し、これに、約0.5ユニツトの
T4DNAリガーゼを加え、冷蔵庫中（約４〜10
℃）で、18時間、DNAの連結反応を行わせた。
この反応物を、Norgardらの方法（M.V.
Norgard、K.Keem、J.J.Nonahan；Gene、
vol3、pp299（1978））に従つて、Escherichia
coliK12C600株に取り込ませた。この処理をした
菌体を、50μｇ／mlのアンピシリンナトリウム、
及び7μｇ／mlのTpを含む栄養寒天培地（１中
に２ｇのグルコース、１ｇのK2HPO4、５ｇのイ
ーストエキス、５ｇのポリペプトン及び15ｇの寒
天を含む寒天培地。）上に広げ、37℃で、24時間
培養することにより、500個以上のコロニーを得
ることができた。これらのコロニーから適当に１
個選び、TanakaとWeisblumの方法（T.
Tanaka、B.Weisblum；J.Bacteriology、
vol121、pp354（1975）に従つてプラスミドの調
製を行い、これをpTP19−１と名ずけた。 実施例 ２ pTP19−１の構造。 実施例１において得られたpTP19−１の制限
酵素開裂地図を決定するために、表に示す制限酵
素による切断を行い、これをアガロースゲル電気
流動法により分析し、λフアージDNAの制限酵
素Hind切断によつて得られるDNA断片を分子
サイズのマーカーとして、各切断によつて得られ
るDNA断片の分子サイズを決定したところ以下
の表に示す結果が得られた。
【表】
【表】
この表に示された結果より、第１図に示す制限
酵素開裂地図を決定した。 実施例 ３ pTP19−１を利用したターミネーターのクロ
ーニング。 Escherichia coliK12の染色体DNA約3μｇと
pTP19−１約1μｇを100μの反応液で中で、５
ユニツトの制限酵素BamHを用いて、30℃、
２時間切断反応を行わせた。その後、300μの
冷エタノールを加え反応を停止させ、これをドラ
イアイス・エタノール中に10分間放置した後、
12000回転10分間の遠心分離を行うことにより、
DNAを沈でんとして集め、上清を捨てる。真空
デシケータ中でエタノールを充分除いた後、
DNA沈でんを100μのリガーゼ用反応液に溶解
し、これに、約0.5ユニツトのT4DNAリガーゼ
を加え、冷蔵庫中で、18時間、DNAの連結反応
を行わせた。この反応物を、Norgardらの方法に
従つて、Esoherichia coliK12C600株に取り込ま
せた。この処理をした菌体を、50μｇ／mlのアン
ピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地上に広
げ、37℃、24時間培養することにより、500個以
上のコロニーを得ることができた。これらのコロ
ニーから適当に、100個選び、50μｇ／mlのアン
ピシリンナトリウム及び7μｇ／mlのTpを含む栄
養寒天培地上に、つまようじを用いて、１個ずつ
移し、37℃で、24時間培養したところ、88個が、
Tpを含む培地では生長できなかつた。Tp培地で
生長したものから２株、生長できなかつたものか
ら８株選んで、DHFRの生産量を調べたところ、
表に示す結果が得られた。
酵素開裂地図を決定した。 実施例 ３ pTP19−１を利用したターミネーターのクロ
ーニング。 Escherichia coliK12の染色体DNA約3μｇと
pTP19−１約1μｇを100μの反応液で中で、５
ユニツトの制限酵素BamHを用いて、30℃、
２時間切断反応を行わせた。その後、300μの
冷エタノールを加え反応を停止させ、これをドラ
イアイス・エタノール中に10分間放置した後、
12000回転10分間の遠心分離を行うことにより、
DNAを沈でんとして集め、上清を捨てる。真空
デシケータ中でエタノールを充分除いた後、
DNA沈でんを100μのリガーゼ用反応液に溶解
し、これに、約0.5ユニツトのT4DNAリガーゼ
を加え、冷蔵庫中で、18時間、DNAの連結反応
を行わせた。この反応物を、Norgardらの方法に
従つて、Esoherichia coliK12C600株に取り込ま
せた。この処理をした菌体を、50μｇ／mlのアン
ピシリンナトリウムを含む栄養寒天培地上に広
げ、37℃、24時間培養することにより、500個以
上のコロニーを得ることができた。これらのコロ
ニーから適当に、100個選び、50μｇ／mlのアン
ピシリンナトリウム及び7μｇ／mlのTpを含む栄
養寒天培地上に、つまようじを用いて、１個ずつ
移し、37℃で、24時間培養したところ、88個が、
Tpを含む培地では生長できなかつた。Tp培地で
生長したものから２株、生長できなかつたものか
ら８株選んで、DHFRの生産量を調べたところ、
表に示す結果が得られた。
【表】
菌株の番号11は、pTP19−１を含む菌株であ
り、12は、何らのプラスミドを含まない菌株であ
る。また、菌株１〜10の保有するプラスミドを、
Birnboim及びDolyの方法（H.C.Birn boim、J.
Doly；Nucleic Acids Research、vol7、pp1513
（1979））に従つてプラスミドを分離し、アガロー
スゲル電気流動法により、そのサイズを調べたと
ころ、いずれも、約5.3キロ塩基対よりも大きい
プラスミドであることが判明した。菌株３〜10に
おいてTp感受性に変化したのは、pTP19−１の
制限酵素BamH部位に挿入されたDNA中に、
転写の減弱シグナルが存在するためであり、その
ために、DHFRが、菌株９の0.0787から菌株５の
0.0094というように、pTP19−１を含有する菌株
の0.240という値の1/3〜1/24に低下していること
が示された。
り、12は、何らのプラスミドを含まない菌株であ
る。また、菌株１〜10の保有するプラスミドを、
Birnboim及びDolyの方法（H.C.Birn boim、J.
Doly；Nucleic Acids Research、vol7、pp1513
（1979））に従つてプラスミドを分離し、アガロー
スゲル電気流動法により、そのサイズを調べたと
ころ、いずれも、約5.3キロ塩基対よりも大きい
プラスミドであることが判明した。菌株３〜10に
おいてTp感受性に変化したのは、pTP19−１の
制限酵素BamH部位に挿入されたDNA中に、
転写の減弱シグナルが存在するためであり、その
ために、DHFRが、菌株９の0.0787から菌株５の
0.0094というように、pTP19−１を含有する菌株
の0.240という値の1/3〜1/24に低下していること
が示された。
第１図は、pTP19−１の制限酵素による開裂
地図であり、図中符号は制限酵素を表わし、Ｅは
EcoR、ＢはBamH、ＨはHind、ＰはPst
、ＡはAva、PvはPvuを示す。また、数字
の単位はキロ塩基対である。
地図であり、図中符号は制限酵素を表わし、Ｅは
EcoR、ＢはBamH、ＨはHind、ＰはPst
、ＡはAva、PvはPvuを示す。また、数字
の単位はキロ塩基対である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 約5.3キロ塩基対よりなり、宿主にアンピシ
リン耐性及びトリメトプリム耐性を与えることが
でき、かつ下図に記載される制限酵素切断地図を
有し、トリメトプリム耐性を与える能力が減少す
るか否かで、挿入したDNA中にターミネーター
が存在するか否かを判断するという特徴を有する
ターミネーター・クローニング用プラスミド
pTP19−１（下記図中、ＥはEcoR、Ｂは
BamH、ＨはHind、ＰはPst、ＡはAva
、PvはPvuを示す。また、数字の単位はキ
ロ塩基対である）。 ２ プロモータ・クローニング用プラスミド
pTP18−４のBamH及びPst切断によつて得
られる２本のDNA断片のうち約4.2キロ塩基対の
大きさのDNA断片と、プラスミドベクター
pBR322のBamH及びPst切断によつて得ら
れる２本のDNA断片のうち約1.1キロ塩基対の大
きさのDNA断片とを結合することを特徴とする
ターミネーター・クローニング用プラスミド
pTP19−１の製造方法。 ３ ターミネーター・クローニング用プラスミド
pTP19−１を含有するEscherichia coli
K12C600株。 ４ ターミネーター・クローニング用プラスミド
pTP19−１のBamH部位に転写の減弱シグナ
ルを含有する異種DNAを挿入して得られる組換
えプラスミドを宿主菌であるEscherichia coliに
導入し、アンピシリン耐性に形質転換した
Escherichia coliのうちトリメトプリム耐性を示
さない形質転換株を分離し、分離した形質転換株
が含有する組換えプラスミドから挿入した異種
DNAを分離することを特徴とする転写の減弱シ
グナルを含有するDNA断片の分離方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59040185A JPS60184388A (ja) | 1984-03-01 | 1984-03-01 | タ−ミネ−タ−・クロ−ニング用プラスミドｐＴＰ１９−１ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59040185A JPS60184388A (ja) | 1984-03-01 | 1984-03-01 | タ−ミネ−タ−・クロ−ニング用プラスミドｐＴＰ１９−１ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60184388A JPS60184388A (ja) | 1985-09-19 |
| JPH0211233B2 true JPH0211233B2 (ja) | 1990-03-13 |
Family
ID=12573719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59040185A Granted JPS60184388A (ja) | 1984-03-01 | 1984-03-01 | タ−ミネ−タ−・クロ−ニング用プラスミドｐＴＰ１９−１ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60184388A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005089012A1 (ja) | 2004-03-11 | 2005-09-22 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | スピーカおよびこれを用いたモジュール、電子機器および装置 |
-
1984
- 1984-03-01 JP JP59040185A patent/JPS60184388A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60184388A (ja) | 1985-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2530801B2 (ja) | 組換えｄｎａ分子 | |
| US5300431A (en) | Positive selection vector for the bacteriophage P1 cloning system | |
| Aagaard et al. | Intercellular mobility and homing of an archaeal rDNA intron confers a selective advantage over intron-cells of Sulfolobus acidocaldarius. | |
| JPH06500006A (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| EP0158940A2 (en) | Transducible composite plasmid | |
| US4477571A (en) | Chimeric plasmids that replicate in bacteria and yeast and microorganisms transformed therewith | |
| JPH06225776A (ja) | リボフラビンの製造法 | |
| JPH06189776A (ja) | ＡａｔＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼのクローニング及び産生方法並びに制限エンドヌクレアーゼの過剰発現関連方法 | |
| WO2021258580A1 (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a的体外大片段DNA克隆方法及其应用 | |
| JPH0211233B2 (ja) | ||
| JPS6296082A (ja) | 生育の速いリゾビウム・ジヤポニカムのｎｉｆプロモ−タ− | |
| JPH07107976A (ja) | 挿入配列 | |
| CN117660524A (zh) | 利用基因编辑技术创制甜玉米种质的方法 | |
| JP3910248B2 (ja) | トランスポゼースを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ反応によるＤＮＡ入れ子型欠失の作製方法 | |
| JP2948265B2 (ja) | ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 | |
| JP4275383B2 (ja) | 新規プラスミド及び当該プラスミドを含むシャトルベクター | |
| EP0115936A1 (en) | Chimeric plasmids | |
| JP2007259787A (ja) | 遺伝子発現制御ポリヌクレオチド | |
| JP3014717B2 (ja) | プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片 | |
| JP3520322B2 (ja) | 低温細菌由来の新規なプラスミドｐＰＳ１Ｍ２及びその誘導体 | |
| JP3836168B2 (ja) | ＢａｌＩ制限・修飾系酵素遺伝子 | |
| JP3495379B2 (ja) | 接合によりベクタープラスミドを直接伝達する方法及びそれに使用するベクタープラスミド | |
| JPH0665307B2 (ja) | バチルスズブチリスのグルコン酸オペロンおよびプロモ−タ− | |
| US20020123100A1 (en) | Binary BAC vector and uses thereof | |
| JPH0679556B2 (ja) | プラスミド |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |