JPH0212484B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（技術分野） 本発明は、免疫血清学的診断試薬に有効なラテ
ツクスに関する。 （従来技術） 免疫血清学の進歩に伴い、臨床検査における技
術の向上はめざましい。免疫血清学検査は、試験
管を用いて行われ、血清希釈にはメスピペツトが
使用される。このような試験管やピペツトによる
作業の繁雑さと、検査件数の増加に伴う大量の検
体処理とが免疫血清学検査の精度を低くしている
原因でもある。しかし、臨床検査の自動化導入に
よつて、免疫血清学検査の領域においても患者か
らの採血量を少なくし、微量の検査材料で正確な
検査データが得られる微量検査法（マイクロタイ
ター法）が実施されるに至つている。このマイク
ロタイター法は1955年ハンガリーのTakatsyによ
つて考案され、さらに、1962年に、アメリカの
Severによつて改良された。1963年にアメリカで
マイクロタイターキツトが市販されて以来、これ
が免疫血清学的検査に採用され、世界中で使用さ
れるようになつた。1967年、アメリカのCDC
（Center for Disease Control）がこれを補体結
合反応の標準検査法として採用した。Public
Health Serviceのトレーニングマニユアルにマ
イクロタイター法の手法が使用されている。我国
では、ウイルス学の研究者によつて比較的はやく
紹介され、輸入品によつてウイルスの血清学的検
査（血球凝集反応、血球凝集阻止反応、補体結合
反応など）や細胞・組織などの培養が行なわれて
いる。これらのマイクロタイター法の特徴は、
微量の血清で多項目の検査ができること；操作
が簡便で多数の検体を短時間で迅速に希釈するこ
とができること；抗原、抗血清、試薬などが現
行法にくらべ少量ですみ経済的であること；１
枚のプレートで全体の反応がみられ、凝集像や溶
血が鮮明で判定しやすいこと；現行法との反応
の感度や精度が変わらず、再現性もよいことなど
である。これらマイクロタイター法に用いられる
血球の主流はヒツジ赤血球およびニワトリの血球
である。これら動物血球を用いた場合には血球の
腐敗および変性が激しく、長期の保存性に欠ける
こと、および個体差が大きいために検査値のバラ
ツキ幅が広く正確なデータがなかなか得られない
こと等の問題点がある。そのうえ、血球そのもの
自体に抗原を含んでいるため、これが検査を受け
る血清中の種々の抗体と反応し、その結果、まぎ
らわしい反応を起こしやすい。これら血球の代替
品として近年、合成ラテツクスが用いられつつあ
る。例えば、特開昭51−9716号公報には合成ラテ
ツクス試薬が開示されている。この合成ラテツク
スは界面活性剤（乳化剤）を用いて製造される。
この他にも界面活性剤を用いた合成ラテツクス試
薬が知られている。その製法は、例えば、水中に
アニオン系、ノニオン系またはカチオン系の乳化
剤を混合したものにスチレンモノマーや水溶性ラ
ジカル開始剤等を共存させて、好ましくは酸素を
除いた雰囲気で、適当な温度に適当な時間保つと
いうものである。合成されたこれらラテツクス
は、一般には、重合の際に用いた乳化剤の一部が
ポリスチレンラテツクス粒子の表面に吸着される
か化学的に結合され、残りはラテツクス中に遊離
の状態で存在する。これらの状態の間には乳化剤
のポリスチレンラテツクス粒子表面に対する吸着
脱着平衡が成立している。このように通常の方法
で製造されるポリスチレンラテツクスにおいては
乳化剤は安定なラテツクスの形成に不可欠である
が、その反面、遊離の乳化剤は前述の抗原または
抗体によるラテツクスの凝集反応に対して好まし
くない影響を与える。診断試薬を製造するには、
まず、既述のようにポリスチレンラテツクスに抗
原または抗体を感作させる。しかし、遊離の乳化
剤を含むラテツクスを用いるとこの段階ですでに
凝集してしまう。次に、抗原または抗体を感作さ
せたラテツクスを用いてこの抗原または抗体に反
応する抗体または抗原をラテツクスの凝集反応に
よつて検出する際には、検出されるべき抗体また
は抗原を含む血清と接触すれば感作ラテツクスは
凝集し、かかる抗体または抗原を含まない血清と
接触しても感作ラテツクスは凝集しないことが必
須要件である。しかし、これら遊離の乳化剤を含
む感作ラテツクスの場合には陰性血清と接触して
も凝集してしまい、いわゆる非特異的凝集反応と
なることが多い。これら乳化剤をラテツクスから
イオン交換法や透析法の技術を用いて除くことは
可能ではあるが、これら遊離の乳化剤をラテツク
スから除いてしまうと、前述の如く遊離の乳化剤
とラテツクス粒子表面に吸着された乳化剤との間
の吸着脱着平衡の成立によるラテツクス安定化が
くずれてしまい、ラテツクスの安定性は極端に悪
くなり実際上は使用不可能となつてしまう。特開
昭57−14610号公報には、スチレンを乳化剤の不
存在下に過硫酸塩を重合開始剤として水中で重合
させた後、アルカリ性条件下で加熱して得られる
ラテツクスの開示がある。このようにして得られ
たラテツクスを試薬化すると乳化剤を使用してい
ないため自己凝集反応や非特異的凝集反応が起こ
らない。かつラテツクスの安定性にも優れてい
る。しかし、このようなラテツクスの比重は1.03
〜1.05と小さく、これはポリスチレンと同程度で
ある。そのため、ラテツクスを試薬化して、検体
との凝集性を調べる場合には長い時間を必要とす
る。 高比重のラテツクスを得るために例えばビニル
トルエン、クロロスチレン、メタクリル酸メチ
ル、塩化ビニル、塩化ビニリデンなどを重合もし
くは共重合させることも行われている。しかし、
例えばクロロスチレンは非常に反応性に富むた
め、重合反応の制御が困難である。得られたラテ
ツクスも残存モノマーが存在するため不快臭があ
る。 （発明の目的） 本発明の目的は、ロツト間のバラツキがなく長
期間安定に保持しうる診断試薬用ラテツクスを提
供することにある。本発明の他の目的は、自己凝
集および非特異凝集が少なく誰もが簡単にしかも
短時間で評価できる、マイクロタイター法に最適
なソープフリー系ラテツクスを提供することにあ
る。本発明のさらに他の目的は、高精度で検査値
を得ることのできるラテツクスを提供することに
ある。本発明のさらに他の目的は、所望の粒径お
よび比重のラテツクスを提供することにある。 （発明の構成） 本発明の診断試薬用ラテツクスは、スチレンを
乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開始剤として弱ア
ルカリ性条件下で重合させポリスチレン粒子の懸
濁液を得、該懸濁液を中性〜酸性の条件下で加熱
処理し架橋ポリスチレンを含むポリスチレン粒子
を得、そして架橋ポリスチレンを含むポリスチレ
ン粒子を塩素化処理して得られ、そのことにより
上記目的が達成される。 本発明において開始剤として用いられる過硫酸
塩としては、例えば、過硫酸アンモニウム、過硫
酸カリウム、過硫酸ナトリウムなどがある。これ
らの過硫酸塩のスチレンに対する割合は８重量％
以下、好ましくは0.09〜６重量％、さらに好まし
くは0.1〜５重量％である。 本発明では、水の仕込まれた反応器にスチレン
と開始剤とを加えて撹拌しながら弱アルカリ性条
件下で加熱して重合反応を行いポリスチレンの懸
濁液を得る。重合反応の温度は50〜100℃、好ま
しくは60〜85℃である。反応時間はスチレンの濃
度、開始剤の種類および濃度により異なる。通常
５〜35時間の範囲で行われ、反応時のPHは7.1〜
7.8が好ましい。反応時のPHをこのような範囲に
設定するため、反応液にはアルカリ土類金属の水
酸化物、酸化物、炭酸塩、重炭酸塩などが加えら
れる。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、炭酸ナトリウムなどが用いられる。このよう
にして得られたポリスチレンの懸濁液を次いで中
性もしくは酸性条件下で加熱する。その反応条件
は所望するポリスチレンの架橋の度合により異な
るが、通常、反応温度は50〜100℃、好ましくは
60〜85℃；反応時間は５〜30時間；そしてPHは
2.4〜7.0、好ましくはPH3.0〜6.8である。中性も
しくは酸性条件下で加熱されるとポリスチレン間
に一部架橋反応が起こる。得られた架橋ポリスチ
レンを含むポリスチレンは、次いで、塩素化処理
に供される。そのときの温度は、懸濁液の仕込み
量および処理条件により異なるが、通常、５〜65
℃好ましくは10〜60℃である。最終塩素化量はラ
テツクスの架橋度および粒径により異なるが、通
常、５〜40％好ましくは10〜30％である。塩素化
処理時間は10〜500分、好ましくは30〜400分であ
り、より好ましくは60〜360分である。ラテツク
スの比重は、塩素化の条件を適宜選択することに
より、1.06〜1.50の範囲、好ましくは1.10〜1.50
の範囲に調整される。 上記処理条件を外れて過度に塩素化されると、
得られるラテツクスの表面の損傷が激しく自己凝
集の原因となる。かりにうまく処理できても今度
はラテツクス自体の比重が大きすぎてマイクロタ
イター法等で評価したとき早く沈降しすぎ、±〜
＋付近の凝集がすべて逆転してしまい正確なデー
タが得られない。 本発明においては、上記のように一部架橋構造
を有するポリスチレンが塩素化処理に供される。
このようなポリスチレンは粒子表面の電荷密度が
高いため塩素化反応を行う際、反応の制御が容易
になされうる。そのため、所望の比重のラテツク
スが容易に得られうる。塩素化が過度に進みその
結果ラテツクス表面が損傷を受けるということも
ない。得られたラテツクスは一部架橋構造を有す
るため凍結乾燥を行つても、凍結時や再分散時に
ラテツクス表面が損傷を受けたり破壊されること
がない。そのため、自己凝集や非特異的凝集反応
が起こらない。例えば、溶連菌などを用いて調製
された、力価が下がりやすく不安定なラテツクス
試薬も凍結乾燥により長期間保存することが可能
になる。 本発明によれば、重合および塩素化の反応条件
をコントロールすることにより所望の粒径と比重
とを有する、粒径の揃つたラテツクスが得られ
る。このようにして得られたラテツクスは、非特
異的凝集反応を起こさないためマイクロタイター
法に用いられるラテツクスとして特に好適であ
る。 （実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。 実施例 １ (A) ラテツクスの調製：スチレンモノマー90ｇ、
過硫酸カリウム0.48ｇおよびイオン交換水470
ｇを反応容器に仕込んだ。そして、容器を窒素
ガスで置換し反応温度を70℃〜72℃の範囲にお
さまるようコントロールしながら24時間単独重
合させた。このときのPHは7.5であつた。重合
終了後、ポリスチレン懸濁液のPHを6.3に調節
した。これを、次いで、70℃で24時間PH6.3に
保ちながら反応させた。反応器を停止し容器か
ら架橋ポリスチレンを含むポリスチレンラテツ
クスを取り出し東洋濾紙No.２（直径12.5cm）を
用いて濾過精製処理を行なつた。次いで、70℃
乾燥機を用いてこのラテツクスを乾燥し、得ら
れた精製固型分を秤量したところ、12.6（Ｗ／
Ｗ）％であつた。次に、３反応容器に水2000
ｇと、精製ラテツクスを蒸留水で7.0％に希釈
したラテツクス500ｇとを投入したのち、自然
光下において反応温度を13〜15℃に保ちながら
270分間塩素ガスを吹きこみ塩素化処理した。
窒素ガスで容器内を180分間置換した後、得ら
れた塩素処理ラテツクスを取り出し東洋濾紙No.
２を用いて濾過精製処理した。このラテツクス
を超音波発生装置を用いて30秒間処理し、水中
に分散させた。さらに、ラテツクスを透析膜を
用いて蒸留水にて24時間精製処理した。塩素化
処理後のラテツクス中の塩素量は14.7％であつ
た。塩素処理後のラテツクスを電子顕微鏡で観
察した結果、平均粒径は0.48μｍそして粒径の
バラツキは変動係数（粒径の標準偏差／平均粒
径）で表して0.005であつた。このラテツクス
の比重は1.31であつた。塩素化処理前の架橋ポ
リスチレンを含むポリスチレンラテツクスの一
部をビーカに取り出し秤量後70℃で５時間乾燥
した。これを試験管に入れ、メチルエチルケト
ン（MEK）を加えて試験管を密封した。これ
をシリコンバスで90℃に加熱し、48時間抽出を
行つた。MEK不溶部分を取り出し70℃で８時
間乾燥し、その重量を測定した。ゲル分率は
8.1％であつた。 (B) Ｒ−PHA法凝集反応によるラテツクス評
価：(A)項で得られたポリスチレンラテツクスを
PH7.4のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％と
したもの１容と、モルモツトの産生したHBs
モノスペシフイツクス抗体（セフアローズ4B
に固定したHBs抗原のカラムに２回通液した
アフイニテイークロマトグラフイーによる精製
品）を同じくリン酸緩衝液中に40μｇ／mlの濃
度に溶解したもの１容とを混合し、37℃で60分
間インキユベートしてラテツクスに抗体を結合
させた。次に、この感作ラテツクスを
15000rpmにて15分間遠心分離し、未吸着の抗
体を除去した。この上澄中の抗体価はPHA（受
身赤血球凝集反応）法により測定され少なくと
も99.5％以上の抗体がラテツクスに吸着してい
ることがわかつた。この沈降したラテツクスを
18000rpmで８分間遠心分離し、上澄み液を捨
て、沈降した処理後の感作ラテツクスをPH7.0
のリン酸緩衝液に再分散してラテツクス試薬の
調製を終了した。このようにして調製されたラ
テツクスを用い現在市販されているリバーセル
（山の内製薬製）のうちの感作赤血球を該ラテ
ツクスにおきかえてＲ−PHA（逆受身血球凝集
反応）試験法を試みた。 マイクロタイターにマイクロドロツパーを用
い緩衝液50μを各管に分注した。そして、1μ
ｇのHBs抗原を含む検体50μを取り出し、す
みやかにダイリユーターで倍々希釈した。そし
て、上記方法で得られたラテツクスを50μ各
管に分注したのちミキサーで30秒間振盪した。
これを270分間・420分間静置後凝集像を判定し
た。比較のために、ラテツクスの代わりにあら
かじめヒツジ赤血球に抗HBs抗体を吸着させ
たＲ−PHAセルを同時に用いラテツクス凝集
との比較として評価した。その結果を第１表お
よび第２表に示す。第１表および第２表は、そ
れぞれ270分間静置後および420分間静置後の凝
集像の判定結果である。なお以下の表における
符号の意味は次の通りである。 −：凝集が認められない ±：ゆるやかな凝集が認められる ＋：明瞭な凝集が認められる ：完全な凝集が顕著に認められる 実施例 ２ (A) ラテツクスの調製：スチレンモノマー75ｇ、
過硫酸カリウム0.40ｇおよびイオン交換水450
ｇを反応容器に仕込んだ。そして、容器を窒素
ガスで置換し反応温度を70℃〜72℃の範囲にお
さまるようコントロールしながら30時間単独重
合させた。このときのPHは7.3であつた。重合
終了後、ラテツクス懸濁液のPHを6.0に調節し
た。これを、次いで、70℃で28時間PH6.0に保
ちながら反応させた。反応器を停止し容器から
架橋ポリスチレンを含むポリスチレンラテツク
スを取り出し東洋濾紙No.２を用いて濾過精製処
理を行なつた。次いで、70℃乾燥機を用いてこ
のラテツクスを乾燥し、得られた精製固型分を
秤量したところ、12.3（Ｗ／Ｗ）％であつた。
次に、３反応容器に水1800ｇと、精製ラテツ
クスを蒸留水で10.0％に希釈したラテツクス
400ｇとを投入したのち、100Wの水銀灯下にお
いて反応温度を25〜27℃に保ちながら160分間
塩素ガスを吹きこみ塩素化処理した。窒素ガス
で容器内を140分間置換した後、得られた塩素
処理ラテツクスを取り出し東洋濾紙No.２を用い
て濾過精製処理した。このラテツクスを超音波
発生装置を用いて１分間処理し、水中に分散さ
せた。さらに、ラテツクスを透析膜を用いて蒸
留水にて24時間精製処理した。塩素化処理後の
ラテツクス中の塩素量は反応溶液中のHCl分析
を行つた結果25.5％であつた。塩素処理後のラ
テツクスを電子顕微鏡で観察した結果、平均粒
径は0.50μｍそして粒径のバラツキは変動係数
（粒径の標準偏差／平均粒径）で表して0.008で
あつた。このラテツクスの比重は1.43であつ
た。塩素化処理前の架橋ポリスチレンを含むポ
リスチレンラテツクスの一部をビーカに取り出
し秤量後70℃で５時間乾燥した。これを試験管
に入れ、MEKを加えて試験管を密封した。こ
れをシリコンバスで90℃に加熱し、48時間抽出
を行つた。MEK不溶部分を取り出し70℃で８
時間乾燥し、その重量を測定した。ゲル分率は
7.02％であつた。 (B) Ｒ−PHA法凝集反応によるラテツクス評
価：本実施例(A)項で得られたポリスチレンラテ
ツクスを用い、実施例１(B)項の方法に準じてラ
テツクスの評価を行つた。その結果を第１表お
よび第２表に示す。

【表】

【表】

【表】 以上の試験結果から、本発明によるラテツク
スは、乳化剤が使用されていないため、また、
その組成に一部架橋構造を有するため自己凝集
および非特異凝集が少なく、保存性に優れロツ
ト間のバラツキもないことがわかる。粒子がよ
く揃いかつ比重が比較的大きいため凝集反応
を、だれもが簡単に、しかも短時間で評価でき
る。しかも検査値への影響が少なくマイクロタ
イター法等にもつとも適したラテツクスである
ことが明らかである。 比較例 (A) ラテツクスの調製：スチレンモノマー90ｇ、
ノニオン乳化剤（第一工業製薬社製、エマルジ
ツト49）２ｇ、過硫酸カリウム0.6ｇおよびイ
オン交換水450ｇを反応容器に仕込み、容器を
窒素ガスで置換し反応温度を70〜72℃の範囲に
おさまるようコントロールしながら24時間重合
した。得られたラテツクスを電子顕微鏡で観察
した結果、平均粒径は0.75μｍそして粒径のバ
ラツキは変動係数で表して0.127であつた。こ
のラテツクスの比重は1.04であつた。 (B) Ｒ−PHA法凝集反応によるラテツクス評
価：(A)項で得られたポリスチレンラテツクスを
PH7.4のリン酸緩衝液に分散させ固型分１％と
したもの１容と、モルモツトの産生したHBs
モノスペシフイツクス抗体（セフアローズ4B
に固定したHBs抗原のカラムに２回通液した
アフイニテイークロマトグラフイーによる精製
品）を同じくリン酸緩衝液中に40μｇ／mlの濃
度に溶解したもの１容とを混合し、37℃で60分
間インキユベートしてラテツクスに抗体を結合
させた。次に、この感作ラテツクスを
15000rpmにて15分間遠心分離し、未吸着の抗
体を除去した。この沈降したラテツクスを
15000rpmで15分間遠心分離し、上澄み液を捨
て、沈降した処理後の感作ラテツクスをPH7.0
のリン酸緩衝液に再分散してラテツクス試薬の
調製を終了した。このようにして調製されたラ
テツクスを用いリバーセイア（HBs抗原検出
EIAキツト 山の内製薬製）を用いてＲ−
PHA試験法を試みた。試験法は実施例１と同
様である。270分間・420分間後の判定では静置
前に比べて凝集像の変化は全く認められなかつ
た。比較例(A)項で得られたラテツクスを用い実
施例１に準じてラテツクス試薬を調製しこれを
用いて種々の濃度のHBs抗原を含むヒト血清
に対する凝集の強さを測定した。使用したラテ
ツクス試薬は25μ、HBs抗原を含むヒト血清
検体は100μである。その結果を第３表に示
す。

【表】 次に、リバーセイア（HBs抗原検出EIAキツト
山の内製薬製）を用いて、血清中のHBs抗原
が0.4nｇ／ml以下であることが判明している158
人の正常なヒト血清について同様のテストを行つ
た。158検体中、陽性が20件そして偽陽性が27件
であつた。 以上の試験結果より、比較例のラテツクスを使
用し試薬化したラテツクスは非特異的凝集反応を
起こすことが明らかである。 （発明の効果） 本発明によれば、このように、乳化剤を全く含
まないにもかかわらず、常時は安定で抗原抗体反
応に鋭敏に感応して高凝集性が得られるラテツク
スが製造される。このラテツクスはしかも粒径が
よく揃つている。このラテツクスは、乳化剤を全
く含まないために免疫血清学的診断試薬として用
いると、非特異的凝集反応による検査値のバラツ
キがない。ラテツクスの調製時に反応条件をコン
トロールすることにより所望の粒径および比重の
ラテツクスを得ることができる。ラテツクスはそ
の一部が架橋構造を有するため、凍結乾燥保存を
行つてもラテツクス表面が損傷を受けたり破壊さ
れることがない。そのため、不安定なラテツクス
試薬も凍結乾燥により長期間保存することができ
る。本発明によるラテツクスはマイクロタイター
法等に偉力を発揮しうる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スチレンを乳化剤の不存在下で過硫酸塩を開
   始剤として弱アルカリ性条件下で重合させポリス
   チレン粒子の懸濁液を得、該懸濁液を中性〜酸性
   の条件下で加熱処理し架橋ポリスチレンを含むポ
   リスチレン粒子を得、そして架橋ポリスチレンを
   含むポリスチレン粒子を塩素化処理して得られる
   診断試薬用ラテツクス。 ２ 前記弱アルカリ性条件下での重合反応がPH
   7.1〜7.8、50〜100℃にて５〜35時間行われる特
   許請求の範囲第１項に記載のラテツクス。 ３ 前記加熱処理がPH2.4〜7.0、50〜100℃にて
   ５〜30時間行われる特許請求の範囲第１項に記載
   のラテツクス。 ４ 前記塩素化処理が10〜65℃にて0.3〜50.0時
   間行われる特許請求の範囲第１項に記載のラテツ
   クス。 ５ 比重が1.10〜1.50である特許請求の範囲第１
   項に記載のラテツクス。 ６ 粒径が0.1〜10.0μｍである特許請求の範囲第
   １項に記載のラテツクス。