JPH0212557B2 - - Google Patents
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- JPH0212557B2 JPH0212557B2 JP14168381A JP14168381A JPH0212557B2 JP H0212557 B2 JPH0212557 B2 JP H0212557B2 JP 14168381 A JP14168381 A JP 14168381A JP 14168381 A JP14168381 A JP 14168381A JP H0212557 B2 JPH0212557 B2 JP H0212557B2
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- pyranose oxidase
- glucose
- culture
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本発明は発酵法によるピラノース・オキシダー
ゼの製造法に関する。さらに詳しくは、本発明は
コリオラス属、ダエダレオプシス属、プロイロタ
ス属またはグロエオフイルム属に属しピラノー
ス・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培
地に培養し、培養物中にピラノース・オキシダー
ゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする発酵法によるピラノース・オキシダーゼの
製造法に関する。ピラノース・オキシダーゼ（酵
素番号1.1.3.10）は、グルコースをグルコソンに、
キシロースをキシロソンに、ソルボースを５−ケ
トラクトースに酸化する反応を触媒する酵素であ
り（Methods in Enzymol VolXLI，P170，
1975）、各々の物質を酸化する際に酵素を吸収し、
過酸化水素を生成する。 従来、発酵法によるピラノース・オキシダーゼ
の製法としては、ポリポラス属に属する微生物を
培養して得る方法が知られている。〔Methode in
Enzymol volXLI，P170（1975）〕。 本発明者らは発酵法によるピラノース・オキシ
ダーゼの製造法について種々検討した結果、コリ
オラス属、ダエダレオプシス属、プロイロタス属
またはグロエオフイルム属に属し、ピラノース・
オキシターゼ生産能を有する微生物を培地に培養
することにより培養物中にピラノース・オキシダ
ーゼが生成することを見い出し本発明を完成し
た。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用される微生物は、コリオラス属、
ダエダレオプシス層、プロイロタス属、グロエオ
フイルム属に属し、ピラノース・オキシダーゼを
生産する能力を有するものであればいずれの菌株
でもよい。好適な菌株の例としてはコリオラス・
ペルシカラー（Coriolus versicolor）IFO4937、
ダエダレオプシス・スチラシナ（Daedaleopsie
styracina）IFO4910、グロエオフイルム・セピ
アリウム（Gloeophyllum sepiarium）Ｚ−41
（MRRL12506）、プロイロタス・オストレアタス
（Pleuroutus ost−reatus）Ｚ−64（NRRL12507）
等があげられる。 これらの微生物の菌学的性質は次の文献に記載
されている。 コリオラス・ベルシカラー ダエダレオプシス・スチラシナ グロエオフイルム・セピアリウム 伊藤誠哉「日本菌類誌」 第二巻、第４号（1955）養賢堂 プロイロタス・オストレアタス：今関六也、本郷次雄
著「原色日本菌類図鑑」（1957）保育社 本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量栄養
素を程よく含有するものであれば合成培地、天然
培地のいずれも使用可能である。 炭素源としては、グルコース、シユクロース、
デキストリン、でんぷん、グリセリン、糖密など
の炭水化物などが用いられる。 窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸などの無機ある
いは有機の窒素化合物、ペントン、肉エキス、酵
母エキス、麦芽エキス、コーン・スチープ・リカ
ーなどの窒素含有天然物が使用できる。 無機物としては、リン酸−カリウム、リン酸二
カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄などが
使用できる。 培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行
う。 培養温度は20〜35℃、好適には25〜30℃で行な
う。培地のPHは3.0〜8.0、好適は4.5〜6.5の範囲
にあることが望ましい。培養期間は１〜７日、通
常は２〜４日間で完了する。 上記の方法で培養することにより、培養物中、
主に菌体中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄
積する。 培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採
取は例えば次のように行なう。 培養終了後、培養液を過して菌体を得、つい
でこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠
心分離等によつて上清液を得る。上清液を通常酵
素精製に用いられる方法、たとえば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマト、ゲ
ル過、凍結乾燥などの方法で処理する。以上の
ようにして精製ピラノース・オキシダーゼを採取
することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。 〔測定法〕 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.0）1.0ml、発
色液〔４−アミノアンチピリ、フエノールを各々
10ｍmol／含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）にパーオキシダーゼを該溶液100ml当り
2000単位含有させたもの〕0.2ml、1Mグルコース
溶液0.1ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液0.1
ml、0.1mMRAD0.1ml、水1.5mlより成る全量3.0
mlの酵素含有液を37℃で反応し、500nmの吸光度
の増加を記録計で自動的に記録した。この条件下
で生成するキノンイミン色素の分子吸光係数を
5.3×103とし、37℃、pH7.0において１分間に
1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を１単位と
すると、ピラノース・オキシダーゼの単位は △A500／5.3×3.0／0.1×酵素の希釈率 として表示される。 △A500：単位時間（１分間）当りの500nmの吸
光度増加量 次に、実施例１より得られたピラノース・オキ
シダーゼの性質を示す。 (1) 安定PH範囲 酵素標品を第１図に示した種々のpHを有す
るクエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ほう酸緩衝
液に100mU／0.7mlとなるように溶解し、これ
らの溶液を50℃に30分間保持した。冷却後中和
し、残存活性を測定した。第１図から本酵素の
安定pH範囲は5.0〜7.4であることがわかる。 (2) 最適pH 酵素標品を第２図に示した種々のpHを有す
るトリス緩衝液に250mU／3.7mlとなるように
溶解し酸素吸収測定用セル（給水科学研究所製
BIOXYGRAPH）入れ、1Mグルコース50μ
を添加して酸素吸収量を測定した。第２図から
本酵素の最適pHは6.2付近にあることがわか
る。 (3) 最適温度 活性測定法と同じ組成を有する反応液で
100mUのピラノース・オキシダーゼを使用し、
第３図に示した各温度で５分間反応した。第３
図より本酵素の最適温度は50℃にあることがわ
かる。 (4) 耐熱性 0.2Mトリス緩衝液pH6.0 0.6mlに本酵素を
100mU／0.7mlとなるように溶解し、第４図に
示した各温度で30分間熱処理後、残存活性を測
定した。第４図より本酵素は60℃30分間処理後
も90％の残存活性を有することがわかる。 (5) 基質特異性 活性測定法と同じ組成を有する反応液で、ピ
ラノース・オキシダーゼ2.5単位、反応の基質
として第１表に示した各種の糖溶液（100mM）
0.1mlを使用した。活性は相対活性であらわし
た。第１表より本酵素はグルコースに対する特
異性が高く、他にソルボース、キシロースに作
用した。
ゼの製造法に関する。さらに詳しくは、本発明は
コリオラス属、ダエダレオプシス属、プロイロタ
ス属またはグロエオフイルム属に属しピラノー
ス・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培
地に培養し、培養物中にピラノース・オキシダー
ゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
とする発酵法によるピラノース・オキシダーゼの
製造法に関する。ピラノース・オキシダーゼ（酵
素番号1.1.3.10）は、グルコースをグルコソンに、
キシロースをキシロソンに、ソルボースを５−ケ
トラクトースに酸化する反応を触媒する酵素であ
り（Methods in Enzymol VolXLI，P170，
1975）、各々の物質を酸化する際に酵素を吸収し、
過酸化水素を生成する。 従来、発酵法によるピラノース・オキシダーゼ
の製法としては、ポリポラス属に属する微生物を
培養して得る方法が知られている。〔Methode in
Enzymol volXLI，P170（1975）〕。 本発明者らは発酵法によるピラノース・オキシ
ダーゼの製造法について種々検討した結果、コリ
オラス属、ダエダレオプシス属、プロイロタス属
またはグロエオフイルム属に属し、ピラノース・
オキシターゼ生産能を有する微生物を培地に培養
することにより培養物中にピラノース・オキシダ
ーゼが生成することを見い出し本発明を完成し
た。 以下に本発明を詳細に説明する。 本発明に使用される微生物は、コリオラス属、
ダエダレオプシス層、プロイロタス属、グロエオ
フイルム属に属し、ピラノース・オキシダーゼを
生産する能力を有するものであればいずれの菌株
でもよい。好適な菌株の例としてはコリオラス・
ペルシカラー（Coriolus versicolor）IFO4937、
ダエダレオプシス・スチラシナ（Daedaleopsie
styracina）IFO4910、グロエオフイルム・セピ
アリウム（Gloeophyllum sepiarium）Ｚ−41
（MRRL12506）、プロイロタス・オストレアタス
（Pleuroutus ost−reatus）Ｚ−64（NRRL12507）
等があげられる。 これらの微生物の菌学的性質は次の文献に記載
されている。 コリオラス・ベルシカラー ダエダレオプシス・スチラシナ グロエオフイルム・セピアリウム 伊藤誠哉「日本菌類誌」 第二巻、第４号（1955）養賢堂 プロイロタス・オストレアタス：今関六也、本郷次雄
著「原色日本菌類図鑑」（1957）保育社 本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素
源、無機物その他使用菌株の必要とする微量栄養
素を程よく含有するものであれば合成培地、天然
培地のいずれも使用可能である。 炭素源としては、グルコース、シユクロース、
デキストリン、でんぷん、グリセリン、糖密など
の炭水化物などが用いられる。 窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、グルタミン酸などのアミノ酸などの無機ある
いは有機の窒素化合物、ペントン、肉エキス、酵
母エキス、麦芽エキス、コーン・スチープ・リカ
ーなどの窒素含有天然物が使用できる。 無機物としては、リン酸−カリウム、リン酸二
カリウム、硫酸マグネシウム、塩化第２鉄などが
使用できる。 培養は通常振盪培養あるいは通気撹拌培養で行
う。 培養温度は20〜35℃、好適には25〜30℃で行な
う。培地のPHは3.0〜8.0、好適は4.5〜6.5の範囲
にあることが望ましい。培養期間は１〜７日、通
常は２〜４日間で完了する。 上記の方法で培養することにより、培養物中、
主に菌体中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄
積する。 培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採
取は例えば次のように行なう。 培養終了後、培養液を過して菌体を得、つい
でこの菌体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠
心分離等によつて上清液を得る。上清液を通常酵
素精製に用いられる方法、たとえば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析、イオン交換カラムクロマト、ゲ
ル過、凍結乾燥などの方法で処理する。以上の
ようにして精製ピラノース・オキシダーゼを採取
することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。 〔測定法〕 0.1Mトリス−塩酸緩衝液（PH7.0）1.0ml、発
色液〔４−アミノアンチピリ、フエノールを各々
10ｍmol／含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）にパーオキシダーゼを該溶液100ml当り
2000単位含有させたもの〕0.2ml、1Mグルコース
溶液0.1ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液0.1
ml、0.1mMRAD0.1ml、水1.5mlより成る全量3.0
mlの酵素含有液を37℃で反応し、500nmの吸光度
の増加を記録計で自動的に記録した。この条件下
で生成するキノンイミン色素の分子吸光係数を
5.3×103とし、37℃、pH7.0において１分間に
1μmolの過酸化水素を生成する酵素量を１単位と
すると、ピラノース・オキシダーゼの単位は △A500／5.3×3.0／0.1×酵素の希釈率 として表示される。 △A500：単位時間（１分間）当りの500nmの吸
光度増加量 次に、実施例１より得られたピラノース・オキ
シダーゼの性質を示す。 (1) 安定PH範囲 酵素標品を第１図に示した種々のpHを有す
るクエン酸緩衝液、トリス緩衝液、ほう酸緩衝
液に100mU／0.7mlとなるように溶解し、これ
らの溶液を50℃に30分間保持した。冷却後中和
し、残存活性を測定した。第１図から本酵素の
安定pH範囲は5.0〜7.4であることがわかる。 (2) 最適pH 酵素標品を第２図に示した種々のpHを有す
るトリス緩衝液に250mU／3.7mlとなるように
溶解し酸素吸収測定用セル（給水科学研究所製
BIOXYGRAPH）入れ、1Mグルコース50μ
を添加して酸素吸収量を測定した。第２図から
本酵素の最適pHは6.2付近にあることがわか
る。 (3) 最適温度 活性測定法と同じ組成を有する反応液で
100mUのピラノース・オキシダーゼを使用し、
第３図に示した各温度で５分間反応した。第３
図より本酵素の最適温度は50℃にあることがわ
かる。 (4) 耐熱性 0.2Mトリス緩衝液pH6.0 0.6mlに本酵素を
100mU／0.7mlとなるように溶解し、第４図に
示した各温度で30分間熱処理後、残存活性を測
定した。第４図より本酵素は60℃30分間処理後
も90％の残存活性を有することがわかる。 (5) 基質特異性 活性測定法と同じ組成を有する反応液で、ピ
ラノース・オキシダーゼ2.5単位、反応の基質
として第１表に示した各種の糖溶液（100mM）
0.1mlを使用した。活性は相対活性であらわし
た。第１表より本酵素はグルコースに対する特
異性が高く、他にソルボース、キシロースに作
用した。
【表】
従来のポリポラス属の微生物から得られたピラ
ノース・オキシダーゼに比べてソルボース、キ
シロースに対する基質特異性が極めて弱い
（B.B.A.167501−510（1968）の表１参照）。 (6) 電子受容体 50mMトリス−塩酸緩衝液pH7.0 1.4ml、酵
素溶液0.1ml（250mU）、第３表に示した各濃度
を有する種々の電子受容体溶液0.5mlをツンベ
ルク管付セルに入れ、吸引して溶存酵素を除去
した後、側室の0.1Mグルコース溶液0.5mlを混
合する。混合後、30秒から90秒間の１分間の吸
光度の変化量を測定し、各電子受容体の活性を
相対活性で表わした。第２表より、本酵素の分
子状酵素を最適の電子受容体とするが、２，６
−デイクロフエノールインドフエノールおよび
チトクロームＣをも電子受容体とし得ることが
わかる。
ノース・オキシダーゼに比べてソルボース、キ
シロースに対する基質特異性が極めて弱い
（B.B.A.167501−510（1968）の表１参照）。 (6) 電子受容体 50mMトリス−塩酸緩衝液pH7.0 1.4ml、酵
素溶液0.1ml（250mU）、第３表に示した各濃度
を有する種々の電子受容体溶液0.5mlをツンベ
ルク管付セルに入れ、吸引して溶存酵素を除去
した後、側室の0.1Mグルコース溶液0.5mlを混
合する。混合後、30秒から90秒間の１分間の吸
光度の変化量を測定し、各電子受容体の活性を
相対活性で表わした。第２表より、本酵素の分
子状酵素を最適の電子受容体とするが、２，６
−デイクロフエノールインドフエノールおよび
チトクロームＣをも電子受容体とし得ることが
わかる。
【表】
(7) 阻害例
(2)の最適pH測定と同様酸素吸収測定によつ
て求めた。50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）3.4ml、酵素溶液0.1ml（280mU）、阻
害剤溶液（18.5mM）0.2mlより成る反応液を酸
素吸収測定用セルに入れ、37℃で1Mグルコー
ス50μを添加して反応を行なつた。結果を第
３表に示した。本酵素はCu2+、Ag+、Ni2+、
PCMBによつて阻害されることがわかる。
て求めた。50mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.0）3.4ml、酵素溶液0.1ml（280mU）、阻
害剤溶液（18.5mM）0.2mlより成る反応液を酸
素吸収測定用セルに入れ、37℃で1Mグルコー
ス50μを添加して反応を行なつた。結果を第
３表に示した。本酵素はCu2+、Ag+、Ni2+、
PCMBによつて阻害されることがわかる。
【表】
(8) 等電点
pH3.5〜10.0のキヤリアアンフオライトを用
いたイソエレクトリツクフオカシング法により
本酵素の等電点を求めた結果、4.2であつた。 (9) 分子量 セフアデツクスＧ−200によるゲル過法で
求めた。標準蛋白質として卵アルブミン、牛血
清アルブミン、アルコール脱水素酵素、γ−グ
ロブリン、牛乳のキサンチン・オキシダーゼを
用いた。その結果、本酵素の分子量は約220000
と求められた。 (10) Km値 ピラノース・オキシダーゼを2.5単位使用し
てラインウイバー−パーク（Lineweaver−
Burk）ブロツトによりグルコースに対する
Km値を求めた。 その結果、グルコースに対するKm値は
0.83mMであつた。 この値はグルコースオキシダーゼの場合のKm
値（10〜20mM）に比べて約1/24〜1/24である。 次に、本発明の方法によつて得られたピラノー
ス・オキシダーゼを用いるピラノース・オキシダ
ーゼの基質の測定について説明する。 ピラノース・オキシダーゼの基質にコリオラス
属、ダエダレオプシス層、プロイロタス属または
グロエオフイルム属の微生物起源のピラノース・
オキシダーゼを適当な緩衝液中で作用せしめ、生
成する過酸化水素を色素系に導いて、色素よる吸
収を測定することによつて基質を定量することが
できる。 一例として、グルコースが基質の場合のピラノ
ース・オキシダーゼの反応式が次に示される。 又、グルコースを含有する試料中のグルコース
の定量のみならず、反応、分解等によつてグルコ
ースを定量的に生成せしめうるような系における
反応にあずかる化合物、反応を触媒する酵素の活
性等の測定に応用できる。 例えばマルトース、メチルグルコシド等のグル
コース誘導体の定量に応用できる。これらのグル
コース誘導体は酸あるいは酵素によつて分解し、
グルコースに変換されるのでこれらを定量すれば
よい。 具体的なグルコース誘導体の分解酵素としてグ
ルコシダーゼ、マルトース、ホスホリラーゼ、ア
ミラーゼ等が例示される。 例えばマルトースにマルトース・ホスホリラー
ゼ作用させるとグルコースとグルコース−１−リ
ン酸が生成し、マルトースにグルコシダーゼを作
用させると２モルのグルコースが生成し、メチル
−α−Ｄ−グルコシドにグルコシダーゼを作用さ
せるとグルコースが生成し、デンプンにα−アミ
ラーゼとマルトース・ホスホリラーゼを作用させ
るとグルコースとグルコース−１−リン酸が生成
する。これらの反応における生成物のグルコース
を定量すれば元の化合物の定量、用いられた酵素
の活性が測定できる。 基質を定量するに際しては、基質を含有する試
料およびピラノース・オキシダーゼを約pH7.0〜
8.0の緩衝液に加て反応させればよい。ピラノー
ス・オキシダーゼは必要によつてマイクロカプセ
ル化、あるいは担体に固定化して用いることもで
きる。 緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液などが用いられる。酵素は通常基質の0.1〜
1μmolに対し0.5〜15Uが用いられ、反応は全量を
水で３mlとした濃度で行われる。 生成した過酸化水素を色素系に導びくについて
は公知のいずれの手段も適用できる。例えばパー
オキシダーゼおよび発色剤を加えて色素を生成せ
しめる。 発色剤としては４−アミノアンチピリンとフエ
ノール、４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン（以下MBTHと略す）とｏ−ト
ルイジン、MBTHとＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
などが例示される。 パーオキシダーゼおよび発色剤は記３mlの反応
液に２〜10Uおよび５〜20μmol存在させて反応
が行われる。反応は30〜50℃で行なわれ５〜20分
で完了する。 生成した色素による反応液の可視部における吸
収を測定する。通常400〜600nmにおける吸収が
測られる。基質の含有量と吸光度との関係をあら
かじめ標準物質について検量線として求めてお
き、試料について得られた吸光度から基質の含有
量を求めることができる。 基質の定量法としては、基質の酸化反応と、生
成した過酸化水素を色素へ導びく反応とを別々に
行なうこともできるが、好ましくはピラノース・
オキシダーゼおよび過酸化水素定量用組成物を一
緒に試料に加えて一段階反応で着色した反応液を
得、この反応液の可視部における吸収を測定する
ことによつて簡便に目的が達成される。 本発明は測定用組成物およびそれを利用するキ
ツトをも包含する。 この組成物はピラノース・オキシダーゼ、パー
オキシダーゼおよび発色剤が0.5〜15U、２〜10U
および５〜20μmolからなり、キツトはこの組成
物と緩衝液１〜３mlとの組合せからなる。 この組成物は、グルコース誘導体をグルコース
に分解できる酵素あるは分解剤を含むことができ
る。例えばα−アミラーゼ測定用組成物としてデ
ンプンを含む組成物にマルトース・ホスホリラー
ゼ１〜10Uを含んだ組成物が例示される。 以下に、本発明の実施例および参考例（実施例
１で得られたピラノース・オキシダーゼを用いる
グルコースの定量）を示す。 実施例 １ グルコース0.5ｇ／dl、酵母エキス0.4ｇ／dl、
麦芽エキス１ｇ／dl、塩化第二鉄１mg／dl
（pH6.0）より成る種培養培地を30mlを300ml容フ
ラスコに入れ、120℃で15分間殺菌する。この培
地にコリオラス・ベルシカラーIFO4937を１白金
耳接種し、30℃で５日間振盪培養する。得られる
種培養液（第一種培養液）30mlを２培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地
300mlに接種し、30℃で４日間振盪培養する。得
られる種培養液（第二種培養液）1.2を30ジ
ヤーフアーメンターに入れた種培養培地と同じ組
成の発酵培地８に接種し、30℃、250rpm、通
気量１／／minで２日間本培養を行なう。 培養物中のピラノース・オキシダーゼは発酵液
１ml当り161mUである。 培養液からのピラノース・オキシダーゼの採取
は次のごとく行なう。培養物を吸引過して湿菌
体約１Kgを得る。この菌体を50mMトリスー塩酸
緩衝液（pH7.0）（以下用いる緩衝液はすべてこ
の緩衝液である。）1.8に懸濁した後、ホモジナ
イザーで菌体を細断する。遠心分離して得た上清
1.8にアルカリを添加してpH7.0に調整した後、
緩衝液で平衡化したHPA−75（三菱化成）の１
カラムに流し緩衝液で洗浄する。次に0.1M硫安
を含む緩衝液で洗浄し、0.25M硫安を含む緩衝液
で酵素の溶出を行なう。活性画分を合わせ、硫安
80％飽和とし遠心分離によつて沈殿物を得る。沈
殿を30mlの緩衝液に溶解し、セフアロース４Ｂの
１カラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画分
を合わせ、硫安80％飽和沈殿を遠心分離によつて
集める。これを30mlの緩衝液に溶解しセフアデツ
クスＧ−100の500mlカラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキ
シダーゼの粉末815mgを得る。菌体抽出液からの
精製収率は43％、比活性9.6U／mg蛋白質である。 実施例 ２ 実施例１において、菌株をグロエオフイルムセ
ピアリウムＺ−41に代え、実施例１と同じ培地組
成を有する培地（２培養フラスコ）で６日間培
養する。培養物中のピラノース・オキシダーゼは
365mU／mlである。 実施例 ３ 実施例１において菌株をダエダレオプシス・ス
チラシナIFO4910に代えた以外は実施例１と同様
に培養する。培養物中のピラノース・オキシダー
ゼは189mU／mlである。 実施例 ４ 実施例１において、菌株をプロイロタス・オス
トレアタスＺ−64に代えた以外は実施例１と同様
に培養する。培養物中のピラノース・オキシダー
ゼは59mU／mlである。 参考例 基質としてグルコースを第５図の各測定点に示
す濃度で含有する溶液0.2mlに1.5mlの0.1Mリン酸
カリウム緩衝液pH7.5、発色液〔４−アミノアン
チピリン、フエノールを各々10ｍmol／含む
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）にパーオキ
シダーゼを該溶液100ml当り2000単位含有させた
もの〕0.2ml、0.1mMFAD0.1ml、ピラノース・オ
キシダーゼ１ml（6.7U）を加えた全量3.0mlの反
応液で37℃で10分間反応し500nmの吸光度を測定
した。結果を第５図に示した。グルコース濃度と
吸光度との間に比例関係が認められた。
いたイソエレクトリツクフオカシング法により
本酵素の等電点を求めた結果、4.2であつた。 (9) 分子量 セフアデツクスＧ−200によるゲル過法で
求めた。標準蛋白質として卵アルブミン、牛血
清アルブミン、アルコール脱水素酵素、γ−グ
ロブリン、牛乳のキサンチン・オキシダーゼを
用いた。その結果、本酵素の分子量は約220000
と求められた。 (10) Km値 ピラノース・オキシダーゼを2.5単位使用し
てラインウイバー−パーク（Lineweaver−
Burk）ブロツトによりグルコースに対する
Km値を求めた。 その結果、グルコースに対するKm値は
0.83mMであつた。 この値はグルコースオキシダーゼの場合のKm
値（10〜20mM）に比べて約1/24〜1/24である。 次に、本発明の方法によつて得られたピラノー
ス・オキシダーゼを用いるピラノース・オキシダ
ーゼの基質の測定について説明する。 ピラノース・オキシダーゼの基質にコリオラス
属、ダエダレオプシス層、プロイロタス属または
グロエオフイルム属の微生物起源のピラノース・
オキシダーゼを適当な緩衝液中で作用せしめ、生
成する過酸化水素を色素系に導いて、色素よる吸
収を測定することによつて基質を定量することが
できる。 一例として、グルコースが基質の場合のピラノ
ース・オキシダーゼの反応式が次に示される。 又、グルコースを含有する試料中のグルコース
の定量のみならず、反応、分解等によつてグルコ
ースを定量的に生成せしめうるような系における
反応にあずかる化合物、反応を触媒する酵素の活
性等の測定に応用できる。 例えばマルトース、メチルグルコシド等のグル
コース誘導体の定量に応用できる。これらのグル
コース誘導体は酸あるいは酵素によつて分解し、
グルコースに変換されるのでこれらを定量すれば
よい。 具体的なグルコース誘導体の分解酵素としてグ
ルコシダーゼ、マルトース、ホスホリラーゼ、ア
ミラーゼ等が例示される。 例えばマルトースにマルトース・ホスホリラー
ゼ作用させるとグルコースとグルコース−１−リ
ン酸が生成し、マルトースにグルコシダーゼを作
用させると２モルのグルコースが生成し、メチル
−α−Ｄ−グルコシドにグルコシダーゼを作用さ
せるとグルコースが生成し、デンプンにα−アミ
ラーゼとマルトース・ホスホリラーゼを作用させ
るとグルコースとグルコース−１−リン酸が生成
する。これらの反応における生成物のグルコース
を定量すれば元の化合物の定量、用いられた酵素
の活性が測定できる。 基質を定量するに際しては、基質を含有する試
料およびピラノース・オキシダーゼを約pH7.0〜
8.0の緩衝液に加て反応させればよい。ピラノー
ス・オキシダーゼは必要によつてマイクロカプセ
ル化、あるいは担体に固定化して用いることもで
きる。 緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝
液などが用いられる。酵素は通常基質の0.1〜
1μmolに対し0.5〜15Uが用いられ、反応は全量を
水で３mlとした濃度で行われる。 生成した過酸化水素を色素系に導びくについて
は公知のいずれの手段も適用できる。例えばパー
オキシダーゼおよび発色剤を加えて色素を生成せ
しめる。 発色剤としては４−アミノアンチピリンとフエ
ノール、４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメ
チルアニリン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン（以下MBTHと略す）とｏ−ト
ルイジン、MBTHとＮ，Ｎ−ジメチルアニリン
などが例示される。 パーオキシダーゼおよび発色剤は記３mlの反応
液に２〜10Uおよび５〜20μmol存在させて反応
が行われる。反応は30〜50℃で行なわれ５〜20分
で完了する。 生成した色素による反応液の可視部における吸
収を測定する。通常400〜600nmにおける吸収が
測られる。基質の含有量と吸光度との関係をあら
かじめ標準物質について検量線として求めてお
き、試料について得られた吸光度から基質の含有
量を求めることができる。 基質の定量法としては、基質の酸化反応と、生
成した過酸化水素を色素へ導びく反応とを別々に
行なうこともできるが、好ましくはピラノース・
オキシダーゼおよび過酸化水素定量用組成物を一
緒に試料に加えて一段階反応で着色した反応液を
得、この反応液の可視部における吸収を測定する
ことによつて簡便に目的が達成される。 本発明は測定用組成物およびそれを利用するキ
ツトをも包含する。 この組成物はピラノース・オキシダーゼ、パー
オキシダーゼおよび発色剤が0.5〜15U、２〜10U
および５〜20μmolからなり、キツトはこの組成
物と緩衝液１〜３mlとの組合せからなる。 この組成物は、グルコース誘導体をグルコース
に分解できる酵素あるは分解剤を含むことができ
る。例えばα−アミラーゼ測定用組成物としてデ
ンプンを含む組成物にマルトース・ホスホリラー
ゼ１〜10Uを含んだ組成物が例示される。 以下に、本発明の実施例および参考例（実施例
１で得られたピラノース・オキシダーゼを用いる
グルコースの定量）を示す。 実施例 １ グルコース0.5ｇ／dl、酵母エキス0.4ｇ／dl、
麦芽エキス１ｇ／dl、塩化第二鉄１mg／dl
（pH6.0）より成る種培養培地を30mlを300ml容フ
ラスコに入れ、120℃で15分間殺菌する。この培
地にコリオラス・ベルシカラーIFO4937を１白金
耳接種し、30℃で５日間振盪培養する。得られる
種培養液（第一種培養液）30mlを２培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地
300mlに接種し、30℃で４日間振盪培養する。得
られる種培養液（第二種培養液）1.2を30ジ
ヤーフアーメンターに入れた種培養培地と同じ組
成の発酵培地８に接種し、30℃、250rpm、通
気量１／／minで２日間本培養を行なう。 培養物中のピラノース・オキシダーゼは発酵液
１ml当り161mUである。 培養液からのピラノース・オキシダーゼの採取
は次のごとく行なう。培養物を吸引過して湿菌
体約１Kgを得る。この菌体を50mMトリスー塩酸
緩衝液（pH7.0）（以下用いる緩衝液はすべてこ
の緩衝液である。）1.8に懸濁した後、ホモジナ
イザーで菌体を細断する。遠心分離して得た上清
1.8にアルカリを添加してpH7.0に調整した後、
緩衝液で平衡化したHPA−75（三菱化成）の１
カラムに流し緩衝液で洗浄する。次に0.1M硫安
を含む緩衝液で洗浄し、0.25M硫安を含む緩衝液
で酵素の溶出を行なう。活性画分を合わせ、硫安
80％飽和とし遠心分離によつて沈殿物を得る。沈
殿を30mlの緩衝液に溶解し、セフアロース４Ｂの
１カラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画分
を合わせ、硫安80％飽和沈殿を遠心分離によつて
集める。これを30mlの緩衝液に溶解しセフアデツ
クスＧ−100の500mlカラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキ
シダーゼの粉末815mgを得る。菌体抽出液からの
精製収率は43％、比活性9.6U／mg蛋白質である。 実施例 ２ 実施例１において、菌株をグロエオフイルムセ
ピアリウムＺ−41に代え、実施例１と同じ培地組
成を有する培地（２培養フラスコ）で６日間培
養する。培養物中のピラノース・オキシダーゼは
365mU／mlである。 実施例 ３ 実施例１において菌株をダエダレオプシス・ス
チラシナIFO4910に代えた以外は実施例１と同様
に培養する。培養物中のピラノース・オキシダー
ゼは189mU／mlである。 実施例 ４ 実施例１において、菌株をプロイロタス・オス
トレアタスＺ−64に代えた以外は実施例１と同様
に培養する。培養物中のピラノース・オキシダー
ゼは59mU／mlである。 参考例 基質としてグルコースを第５図の各測定点に示
す濃度で含有する溶液0.2mlに1.5mlの0.1Mリン酸
カリウム緩衝液pH7.5、発色液〔４−アミノアン
チピリン、フエノールを各々10ｍmol／含む
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）にパーオキ
シダーゼを該溶液100ml当り2000単位含有させた
もの〕0.2ml、0.1mMFAD0.1ml、ピラノース・オ
キシダーゼ１ml（6.7U）を加えた全量3.0mlの反
応液で37℃で10分間反応し500nmの吸光度を測定
した。結果を第５図に示した。グルコース濃度と
吸光度との間に比例関係が認められた。
第１図はピラノース・オキシダーゼの相対活性
と安定pH範囲との関係を示す。第２図はピラノ
ース・オキシダーゼの相対活性と最適pHとの関
係を示す。第３図はピラノース・オキシダーゼの
相対活性と最適温度との関係を示す。第４図はピ
ラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性との
関係を示す。第５図は吸光度とグルコースの濃度
との関係を示す。
と安定pH範囲との関係を示す。第２図はピラノ
ース・オキシダーゼの相対活性と最適pHとの関
係を示す。第３図はピラノース・オキシダーゼの
相対活性と最適温度との関係を示す。第４図はピ
ラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性との
関係を示す。第５図は吸光度とグルコースの濃度
との関係を示す。
Claims (1)
- １ コリオラス属、ダエダレオプシス層、プロイ
ロタス属またはグロエアフイルム属に属しピラノ
ース・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養
培地に培養し、培養物中にピラノース・オキシダ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする発酵法によるピラノース・オキシダーゼ
の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14168381A JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14168381A JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5843785A JPS5843785A (ja) | 1983-03-14 |
| JPH0212557B2 true JPH0212557B2 (ja) | 1990-03-20 |
Family
ID=15297774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14168381A Granted JPS5843785A (ja) | 1981-09-10 | 1981-09-10 | 発酵法によるピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5843785A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07102154B2 (ja) * | 1992-03-02 | 1995-11-08 | 日東紡績株式会社 | １，５−アンヒドログルシトールの定量法 |
-
1981
- 1981-09-10 JP JP14168381A patent/JPS5843785A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5843785A (ja) | 1983-03-14 |
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