JPH0223157B2 - - Google Patents
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- JPH0223157B2 JPH0223157B2 JP55127008A JP12700880A JPH0223157B2 JP H0223157 B2 JPH0223157 B2 JP H0223157B2 JP 55127008 A JP55127008 A JP 55127008A JP 12700880 A JP12700880 A JP 12700880A JP H0223157 B2 JPH0223157 B2 JP H0223157B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセンダイウイルス（Sendai virus）小
集団（subpopulation）の調製方法に関する。 ベアード氏等はマウスの胸腺リンパ腫細胞によ
るネズミの白血病ウイルスから調製された放射性
物質で標識付けされたウイルスのリガンド
（ligand）、すなわちウイルスラジオリガンド、の
結合分析について報告している〔Int.J.Cancer、
19、403−417（1977）参照〕。受容体（receptor）
陽性であると考えられる細胞へのラジオリガンド
の結合のパーセントは低く（10％）、充分な捕
捉を得るために加えられたラジオリガンドの量は
多かつた（＞100000cpm）。ウイルスラジオリガ
ンド−受容体細胞結合の研究において得られるこ
のタイプの結果は、一般にリガンドの結合活性度
すなわち感応性がより高い抗原性に基づく放射線
免疫分析法（radioimmunoassay）において、ウ
イルスラジオリガンドを使用することによつて得
られる結果とは全く異なるものである。 上記のウイルスラジオリガンド−受容体細胞結
合の研究と同様に、フオウラー氏等はネズミの白
血病ウイルスの表面糖タンパク質を放射性物質で
標識付けしたものを細胞結合性リガンドとして使
用する研究を報告している〔J.Vurol.、24、729
−735（1977）参照〕。抗原的に作用する放射性物
質で標識付けされた糖タンパク質の一部（15−40
％）だけが敏感なネズミの細胞列と結合した。 上記から明らかなように、有用な抗原物質であ
るのみならず細胞受容体を定性および定量分析す
るのにも使用することができる有効な細胞結合性
ウイルスラジオリガンドを調製することは従来不
可能であつた。 本発明の目的は同定および測定を容易にするた
めに標識付けした後、細胞膜受容体を調べるため
の有効な材料として使用することができるセンダ
イウイルス小集団を提供することにある。 本発明の別の目的は同定および測定を容易にす
るために標識付けした後、細胞膜受容体を調べる
ための有効な材料として使用することができるセ
ンダイウイルス小集団の調製方法を提供すること
にある。 本発明のさらに別の目的は免疫分析法のような
通常の補完法（すなわち選択結合法）における抗
原物質として有用なセンダイウイルス小集団を提
供することにある。 特定の具体例においては、本発明の目的は人間
およびヒツジの赤血球中並びに多くの哺乳動物の
白血球中に見られるシアリン酸受容体、特にＮ−
あるいはＯ−アセチルノイラミン酸受容体、と選
択的に結合するセンダイウイルス小集団を提供す
ることにある。 より好ましい本発明の目的は標識付けした後シ
アリン酸タイプの細胞受容体を調べるのに有効に
使用することができるシアリン酸含有表面タンパ
ク質結合性のセンダイウイルス小集団、を提供す
ることにある。 タンパク質（好ましくは固定されている）、あ
るいはウイルスとの反応に通常関与する細胞膜の
結合性タンパク質を補充するような受容体サイト
を有する細胞もしくは細胞誘導物を使用すること
によつて、補完関係にある細胞受容体に対する良
好な感応性によつて特徴づけられる濃縮されたウ
イルス小集団を調製することができることが見出
された。より詳細には、まずウイルスが該ウイル
スとコンプレツクス（complex）を形成し得る固
定された基質と接触せしめられ、その後解放され
る。コンプレツクスが存在している間にそのコン
プレツクスは洗浄され、非コンプレツクス物質が
除去される。非コンプレツクス物質は優れた抗原
特性を有しているかもしれないが、細胞受容体結
合活性度は実質的にコンプレツクス部分に存在す
ることが見出された。 コンプレツクス化−解放工程を行なうのに、用
いられるウイルスおよび基質に応じて種々の方法
を採用することができる。例えば、一定の状況の
下では、酸、塩基、温度等あるいはそれらの組合
せが有効であることがわかる。 濃縮されたウイルス小集団は使用前に通常の方
法によつてラジオリガンドに変換されるのが好ま
しい。 特定の具体例においては、フエチユイン
（fetuin）のようなＮ−アセチルノイラミン酸部
分を有する固定されたタンパク質基質が用いられ
てセンダイウイルスが濃縮される。この場合、コ
ンプレツクス化−解放工程は温度を変化させるこ
とによつて行なわれ、温度変化によつて迅速に濃
縮された小集団を調製し、その集団から不要な粒
子を分離することができる。濃縮されたセンダイ
ウイルスをラジオリガンドに変換することによつ
て有効な抗原物質を得ることができる。 種々の理由から、ウイルス−ホスト細胞相互作
用に関するメカニズムの研究が増加してきてい
る。ウイルスによつて引き起こされる伝染病の分
野に加えて、遺伝学、細胞代謝、免疫学等の分野
においてウイルス−ホスト細胞相互作用に非常に
大きな興味が持たれている。あるタイプのウイル
スに対する受容性は既往感染、感染に対する感応
性等を示す。しかしながら、これら発達しつつあ
る研究分野をさらに前進させるためには、受容体
細胞を定性的にまた定量的に分析するのに有効な
ウイルス材料が必要である。 研究所で使用されるウイルス集団はその研究所
で培養されるかあるいはウイルス培養業者から購
入されている。しかしながら下記の実施例１で説
明するように、多くの場合そのようなウイルス集
団は高い抗原性を有しているとは言うもののホス
ト細胞受容体に対する感応性は低いものである。 実施例 １ マイクロバイオロジカルアソシエイツ社
（Microbiological Associates Walkersville、
MD）から入手された紫外線によつて不活性化さ
れたセンダイウイルスがイワンソーバル社
（Ivan Sorvall Co.、Norwich、Conn.）製RC−
2Bソーバル冷凍遠心分離機中での38000×ｇ、90
分間のペレツト化によつて、あるいはフアーマチ
アフアインケミカル社（Pharmacia Fine
Chemicals、Uppsala、Sweden）製セフアロー
ズ4B（Sepharose4B）を用いるクロマトグラフイ
ーによつて生化学的に精製された。ウイルスのゲ
ル濾過は燐酸塩緩衝塩水によつて平衡が保たれた
PH7.3のセフアローズ4Bのカラム（50×１cm）を
用いて４℃で行なわれた。フラクシヨンは280nm
における吸着によつて検査された。その後、I125
による標識付けが標準クロラミン−Ｔ法あるいは
ペルオキシダーゼ法によつて行なわれ、次いで未
反応I125の分離がセフアローズ4Bカラムによる濾
過によつて行なわれてセンダイウイルスラジオリ
ガンドが得られた。 固定された基質が用いられる場合には、その固
定はアリルアミン誘導体が付けられた制御された
気孔を有するガラスを用いて行なわれた。この固
定についてはニユーヨークのアカデミツクプレス
社から1974年に出版されたヤコブおよびウイルチ
エツク氏共編「酵素学における方法」の34Bに記
載されているウイータル氏等の論文を参照された
い。 ラジオリガンドの結合は以下のようにして測定
された。まずリガンドと細胞あるいは固定された
抗血清（IMA）との結合が0.5％のBSA（ウシの
血清アルブミン）が加えられたグランドアイラン
ドバイオロジカル社（Grand Island Biological
Co.、Grand Island、New York）製RPMI1640
中で行なわれた。予め緩衝液中で洗浄された細胞
あるいはIMAはプラスチツクチユーブ（11cm×
１cm）に入れられた。このサンプルは緩衝液によ
つて全容量0.9mlとされ、その後予め緩衝液によ
つて希釈された10000乃至100000カウントの0.1ml
のリガンドが加えられた。反応系は４℃で培養さ
れ、その後チユーブが遠心分離機にかけられて
2000×ｇで10分間遠心分離が行なわれた。上澄み
液を除去した後、得られたペレツトをパツカード
モデル3000ガンマシンチレーシヨンスペクトロフ
オトメーター中でカウントした。結果を下記第１
表に示す。 【表】 【表】 CCL−119細胞列は５％CO2雰囲気中で36℃で
培養され、20％のウシの胎児の血清が加えられた
RPMI−1640中を連続的に通過させることによつ
て維持され、スケリング社（Schering Corp.、
Kenilworth、New Jersey）製グルタミンおよび
ゲンタミシンが補われた。細胞は結合のために再
懸濁される前に緩衝液中で２回洗浄された。 ヒツジの赤血球およびCCL−119はセンダイウ
イルスに対して受容体陽性であるが、センダイウ
イルス集団はこの細胞受容体に対してわずかの感
応性しか示さない。この結果は先に説明した先行
技術に一致している。一方、ウサギの普通の血清
との結合と比較して示されるように、センダイウ
イルス集団はウサギのセンダイウイルス抗血清と
の結合において著しい抗原性を示す。 上記実験においては単一種のウイルスのみが用
いられているが、同様に入手可能なその他のウイ
ルス集団およびそのウイルスと補完関係にある細
胞、普通の血清および抗血清が用いられる上記と
同様の実験においても、上記と同様の結果が得ら
れる。 本発明はウイルスをそのウイルスに対応する細
胞受容体サイトによく似たサイトを有する固定さ
れた不活性基質とコンプレツクス化することによ
つて、元のウイルス集団に比較して細胞受容体結
合活性度が著しく増加したウイルス小集団が得ら
れるという発見に基づくものである。従つて本発
明においては、ウイルス−不活性基質コンプレツ
クスが形成される。本明細書において用いられる
「コンプレツクス」という用語は、培養およびそ
の後の緩衝液洗浄の間のウイルス外皮の細胞結合
性サイトと上記不活性基質の受容体サイトとの相
互作用によつて起こるウイルスとこのウイルスを
保持する上記不活性基質とのいかなる結合をも意
味するものであり、共有結合、物理的引力、イオ
ン結合等あるいはそれらの組合せが含まれる。 上記不活性基質はウイルスとコンプレツクスを
形成する適当な反応性受容体残基を有するタンパ
ク質あるいは糖タンパク質である。このタンパク
質あるいは糖タンパク質は必要に応じて直接にあ
るいは１種もしくは２種以上のスペーサー部分を
介して不溶性担体に結合される。反応性受容体残
基はホスト細胞受容体サイトによく似た残基であ
るシアリン酸残基である。 下記の実施例はホスト細胞受容体サイトに対す
るセンダイウイルスの濃縮を説明するものであ
る。 実施例 ２ Ｎ−アセチルノイラミン酸を含有する糖タンパ
ク質であるグランドアイランドバイオロジカル社
製フエチユインが、従来の活性化およびカツプリ
ング法によつて、ガラス100mg当りフエチユイン
25mgの割合でアリルアミンが設けられた制御され
た気孔を有するガラス上に固定された。固定され
たフエチユインは燐酸塩緩衝塩水中に20mgガラ
ス／mlの割合で懸濁され、ゆるく付着しているタ
ンパク質を除去するために0.5％のBSAを含有す
るRPMI1640媒体中で37℃で30分間培養され、そ
の後上記緩衝液２ml中で洗浄された。紫外線によ
つて不活性化されたウイルス約５ml（約5000乃至
15000血球凝集単位のウイルス活性度に相当する）
が固定されたフエチユインに加えられ、
RPMI1640媒体（1.5％のBSAを含有する）中で
４℃で45分間培養された。その後、得られたガラ
ス−フエチユイン−ウイルスコンプレツクスが冷
たい（４℃）RPMI1640媒体（BSAを含有して
いない）中で洗浄され、同じ媒体少量中に再懸濁
された。温度が37℃に上げられ、30分間保たれ
た。遠心分離の後、精製されたウイルスを含有す
る上澄み液は４℃で貯蔵された。 標準クロラミン−Ｔ法によつて上記精製された
ウイルスがI125で標識付けされ、ラジオリガンド
が得られた。標準クロラミン−Ｔ法については
Nature、194、495（1962）に記載されているハン
ター氏等の論文を参照されたい。ここでもまた未
反応I125は上述と同様にして除去された。I125で
標識付けされたウイルスは４℃で貯蔵され、使用
前に再びセフアローズ4Bに通された。 上記フエチユイン受容体によつて精製されたウ
イルスを用いて実施例１と同様の実験を行なつ
た。結果を下記第２表に示す。 【表】 【表】 センダイウイルスの細胞結合は主としてシアリ
ン酸受容体によつて起こることを確めるために、
SRBCがノイラミニダーゼで処理され、その後受
容体精製されたセンダイウイルスに接触せしめら
れた。結合％はブランクの値付近まで落ちた。 実施例 ３ この実施例は上記受容体精製されたセンダイウ
イルスが用いられるウイルス−細胞結合反応の特
異性を調べるために行なわれた。この特異性試験
はリガンドの添加の前に細胞あるいはIMAに阻
害物質（inhibitor）を混合すること以外は実施
例１および２と同様にして行なわれた。置換％
（％Ｄ）は下記の式を用いて計算された。下記の
式においてＢは阻害物質が用いられた場合の結合
％、Boは阻害物質が用いられない場合の結合％
を表わし、ＢおよびBoの値はブランクの値に対
して補正された。 ％Ｄ＝Bp−Ｂ／Bo×100 【表】 第３表は上記受容体精製されたセンダイウイル
スのウイルス−細胞結合反応の特異性を調べるた
めに行なわれた上記拮抗的阻害実験の結果を示す
ものである。標識付けされたセンダイウイルスと
固定された抗体（SV−IMA）あるいはヒツジの
赤血球（SRBC）との反応はセンダイウイルスあ
るいはセンダイウイルス抗体によつて著しく阻害
されたが、ネズミの白血球ウイルス、Ｔ−２コリ
フア−ジあるいはヤギの普通の血清によつては阻
害されなかつた。 ホスト細胞受容体との結合のために濃縮された
上記ウイルス集団は生化学的に精製されたウイル
スとは異なつたゲル特性を有している。この相違
（ウイルス外皮タンパク質の量比の変化を含む）
によつて細胞受容体に対する感応性の増加の理由
が少なくとも部分的に説明されるものと思われ
る。 実施例 ４ センダイウイルスラジオリガンドのゲル分析 センダイウイルスが生化学的方法と固定された
フエチユインへの吸収および該フエチユインから
の溶離の２通りの方法で精製された。前者の生化
学的精製は37000×ｇ、75分間の冷凍遠心分離に
よるペレツト化によつて、あるいはセフアローズ
4Bによるクロマトグラフイーによつて、あるい
はその両方によつて行なわれた。２つの精製され
たセンダイウイルスはI125で標識付けされ、0.1％
ドデシル硫酸ナトリウム溶液中のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によつて分析された（それぞ
れ第１図および第２図）。この電気泳動法につい
てはニユーヨークのアカデミツクプレス社から
1971年に出版されたモラモローシエおよびコプロ
ウスキー氏共編「ウイルス学における方法」、第
５巻、179−246頁に記載されているマイゼル氏の
論文を参照されたい。アクリルアミドの濃度は
7.5％であり、電気泳動の後ゲルは着色され、脱
色され、冷凍されそして薄切りにされ、得られた
各薄片の放射能がカウントされた。結果を第１図
および第２図に示す。２つのゲルはいずれも膜タ
ンパク質（Ｍ、68000MW）、融合要素（fusion
factor）（Ｆ−１、51000MW）および赤血球凝集
素−ノイラミニダーゼ（HN、68000MW）と一
般に呼ばれる３種類の主要な膜タンパク質を含ん
でいる〔シエイドおよびチヨピン氏による
Virology、57、470−495、（1974）参照〕。しか
しながら、２つのゲルは以下に述べる２つの点で
異なつている。すなわち、(1)HNタンパク質は受
容体精製されたウイルスにおいてより顕著であ
り、また(2)生化学的に精製されたウイルスについ
ては、ゲルの高分子量領域（薄片１乃至10）はそ
の他のピークよりも多量のタンパク質を含んでい
るが、受容体精製されたウイルスについてはそう
ではない。 ゲル分布（gelprofile）は厳密な電気泳動条件、
サンプルの標識付けおよびウイルスの精製の程度
によつて変わるが、上記結果は受容体精製によつ
て得られたウイルスラジオリガンドは複雑であ
り、センダイウイルス中に見出される膜タンパク
質からなることを示している。さらに第２図に示
されるように、細胞と有効に結合するセンダイウ
イルスラジオリガンドはHNピークが顕著である
ような、またゲルの高分子量領域のタンパク質が
その他のピークよりも少ないようなゲル分布を示
す。 先に述べたように基質は固定されるが、上記実
施例で述べた制御された気孔を有するガラスが必
ずしも用いられる必要はない。例えば、補完サイ
ト含有物質を固定するのにセフアローズ、アクリ
ルアミドあるいはプラスチツクを用いることがで
きる。 基質から濃縮されたウイルス集団を解放するの
に用いられる手段はコンプレツクス化メカニズム
に応じて異なる。特定のコンプレツクスについて
は２つ以上の手段が考えられる。例えば、センダ
イウイルス−シアリン酸タンパク質受容体コンプ
レツクスについては、温度変化の代りにシアリン
酸含有拮抗生物質（ハプテン、誘導体あるいは相
似体）による溶離が考えられる。免疫分析法にお
いて用いられるその他の日常的な方法、すなわち
PH、高濃度の塩あるいはイオンのような解離剤の
使用等あるいはそれらの組合せが考えられる。 濃縮されたウイルスリガンドは必ずしも放射性
物質で標識付けされる必要はなく、酵素標識付け
および螢光標識付けのようなその他の既知の方法
で標識付けされてもよい。勿論、放射性トレーサ
ーが用いられる場合には、そのトレーサーは必ず
しもI125である必要はない。 標識付けされたウイルスリガンドは免疫分析法
における抗原のように、ウイルスリガンドが使用
されるいかなるタイプの拮抗結合法にも用いるこ
とができる。受容体陽性の細胞、組織、糖タンパ
ク質、体液、滲出物等の定量、あるいは抗原結合
の研究を行なうことができる。例えば、センダイ
ウイルスラジオリガンドは適当なシアリン酸受容
体の定量、グリコリルノイラミン酸酸含有タンパ
ク質とアセチルノイラミン酸酸含有タンパク質の
分離等に用いることができる。
集団（subpopulation）の調製方法に関する。 ベアード氏等はマウスの胸腺リンパ腫細胞によ
るネズミの白血病ウイルスから調製された放射性
物質で標識付けされたウイルスのリガンド
（ligand）、すなわちウイルスラジオリガンド、の
結合分析について報告している〔Int.J.Cancer、
19、403−417（1977）参照〕。受容体（receptor）
陽性であると考えられる細胞へのラジオリガンド
の結合のパーセントは低く（10％）、充分な捕
捉を得るために加えられたラジオリガンドの量は
多かつた（＞100000cpm）。ウイルスラジオリガ
ンド−受容体細胞結合の研究において得られるこ
のタイプの結果は、一般にリガンドの結合活性度
すなわち感応性がより高い抗原性に基づく放射線
免疫分析法（radioimmunoassay）において、ウ
イルスラジオリガンドを使用することによつて得
られる結果とは全く異なるものである。 上記のウイルスラジオリガンド−受容体細胞結
合の研究と同様に、フオウラー氏等はネズミの白
血病ウイルスの表面糖タンパク質を放射性物質で
標識付けしたものを細胞結合性リガンドとして使
用する研究を報告している〔J.Vurol.、24、729
−735（1977）参照〕。抗原的に作用する放射性物
質で標識付けされた糖タンパク質の一部（15−40
％）だけが敏感なネズミの細胞列と結合した。 上記から明らかなように、有用な抗原物質であ
るのみならず細胞受容体を定性および定量分析す
るのにも使用することができる有効な細胞結合性
ウイルスラジオリガンドを調製することは従来不
可能であつた。 本発明の目的は同定および測定を容易にするた
めに標識付けした後、細胞膜受容体を調べるため
の有効な材料として使用することができるセンダ
イウイルス小集団を提供することにある。 本発明の別の目的は同定および測定を容易にす
るために標識付けした後、細胞膜受容体を調べる
ための有効な材料として使用することができるセ
ンダイウイルス小集団の調製方法を提供すること
にある。 本発明のさらに別の目的は免疫分析法のような
通常の補完法（すなわち選択結合法）における抗
原物質として有用なセンダイウイルス小集団を提
供することにある。 特定の具体例においては、本発明の目的は人間
およびヒツジの赤血球中並びに多くの哺乳動物の
白血球中に見られるシアリン酸受容体、特にＮ−
あるいはＯ−アセチルノイラミン酸受容体、と選
択的に結合するセンダイウイルス小集団を提供す
ることにある。 より好ましい本発明の目的は標識付けした後シ
アリン酸タイプの細胞受容体を調べるのに有効に
使用することができるシアリン酸含有表面タンパ
ク質結合性のセンダイウイルス小集団、を提供す
ることにある。 タンパク質（好ましくは固定されている）、あ
るいはウイルスとの反応に通常関与する細胞膜の
結合性タンパク質を補充するような受容体サイト
を有する細胞もしくは細胞誘導物を使用すること
によつて、補完関係にある細胞受容体に対する良
好な感応性によつて特徴づけられる濃縮されたウ
イルス小集団を調製することができることが見出
された。より詳細には、まずウイルスが該ウイル
スとコンプレツクス（complex）を形成し得る固
定された基質と接触せしめられ、その後解放され
る。コンプレツクスが存在している間にそのコン
プレツクスは洗浄され、非コンプレツクス物質が
除去される。非コンプレツクス物質は優れた抗原
特性を有しているかもしれないが、細胞受容体結
合活性度は実質的にコンプレツクス部分に存在す
ることが見出された。 コンプレツクス化−解放工程を行なうのに、用
いられるウイルスおよび基質に応じて種々の方法
を採用することができる。例えば、一定の状況の
下では、酸、塩基、温度等あるいはそれらの組合
せが有効であることがわかる。 濃縮されたウイルス小集団は使用前に通常の方
法によつてラジオリガンドに変換されるのが好ま
しい。 特定の具体例においては、フエチユイン
（fetuin）のようなＮ−アセチルノイラミン酸部
分を有する固定されたタンパク質基質が用いられ
てセンダイウイルスが濃縮される。この場合、コ
ンプレツクス化−解放工程は温度を変化させるこ
とによつて行なわれ、温度変化によつて迅速に濃
縮された小集団を調製し、その集団から不要な粒
子を分離することができる。濃縮されたセンダイ
ウイルスをラジオリガンドに変換することによつ
て有効な抗原物質を得ることができる。 種々の理由から、ウイルス−ホスト細胞相互作
用に関するメカニズムの研究が増加してきてい
る。ウイルスによつて引き起こされる伝染病の分
野に加えて、遺伝学、細胞代謝、免疫学等の分野
においてウイルス−ホスト細胞相互作用に非常に
大きな興味が持たれている。あるタイプのウイル
スに対する受容性は既往感染、感染に対する感応
性等を示す。しかしながら、これら発達しつつあ
る研究分野をさらに前進させるためには、受容体
細胞を定性的にまた定量的に分析するのに有効な
ウイルス材料が必要である。 研究所で使用されるウイルス集団はその研究所
で培養されるかあるいはウイルス培養業者から購
入されている。しかしながら下記の実施例１で説
明するように、多くの場合そのようなウイルス集
団は高い抗原性を有しているとは言うもののホス
ト細胞受容体に対する感応性は低いものである。 実施例 １ マイクロバイオロジカルアソシエイツ社
（Microbiological Associates Walkersville、
MD）から入手された紫外線によつて不活性化さ
れたセンダイウイルスがイワンソーバル社
（Ivan Sorvall Co.、Norwich、Conn.）製RC−
2Bソーバル冷凍遠心分離機中での38000×ｇ、90
分間のペレツト化によつて、あるいはフアーマチ
アフアインケミカル社（Pharmacia Fine
Chemicals、Uppsala、Sweden）製セフアロー
ズ4B（Sepharose4B）を用いるクロマトグラフイ
ーによつて生化学的に精製された。ウイルスのゲ
ル濾過は燐酸塩緩衝塩水によつて平衡が保たれた
PH7.3のセフアローズ4Bのカラム（50×１cm）を
用いて４℃で行なわれた。フラクシヨンは280nm
における吸着によつて検査された。その後、I125
による標識付けが標準クロラミン−Ｔ法あるいは
ペルオキシダーゼ法によつて行なわれ、次いで未
反応I125の分離がセフアローズ4Bカラムによる濾
過によつて行なわれてセンダイウイルスラジオリ
ガンドが得られた。 固定された基質が用いられる場合には、その固
定はアリルアミン誘導体が付けられた制御された
気孔を有するガラスを用いて行なわれた。この固
定についてはニユーヨークのアカデミツクプレス
社から1974年に出版されたヤコブおよびウイルチ
エツク氏共編「酵素学における方法」の34Bに記
載されているウイータル氏等の論文を参照された
い。 ラジオリガンドの結合は以下のようにして測定
された。まずリガンドと細胞あるいは固定された
抗血清（IMA）との結合が0.5％のBSA（ウシの
血清アルブミン）が加えられたグランドアイラン
ドバイオロジカル社（Grand Island Biological
Co.、Grand Island、New York）製RPMI1640
中で行なわれた。予め緩衝液中で洗浄された細胞
あるいはIMAはプラスチツクチユーブ（11cm×
１cm）に入れられた。このサンプルは緩衝液によ
つて全容量0.9mlとされ、その後予め緩衝液によ
つて希釈された10000乃至100000カウントの0.1ml
のリガンドが加えられた。反応系は４℃で培養さ
れ、その後チユーブが遠心分離機にかけられて
2000×ｇで10分間遠心分離が行なわれた。上澄み
液を除去した後、得られたペレツトをパツカード
モデル3000ガンマシンチレーシヨンスペクトロフ
オトメーター中でカウントした。結果を下記第１
表に示す。 【表】 【表】 CCL−119細胞列は５％CO2雰囲気中で36℃で
培養され、20％のウシの胎児の血清が加えられた
RPMI−1640中を連続的に通過させることによつ
て維持され、スケリング社（Schering Corp.、
Kenilworth、New Jersey）製グルタミンおよび
ゲンタミシンが補われた。細胞は結合のために再
懸濁される前に緩衝液中で２回洗浄された。 ヒツジの赤血球およびCCL−119はセンダイウ
イルスに対して受容体陽性であるが、センダイウ
イルス集団はこの細胞受容体に対してわずかの感
応性しか示さない。この結果は先に説明した先行
技術に一致している。一方、ウサギの普通の血清
との結合と比較して示されるように、センダイウ
イルス集団はウサギのセンダイウイルス抗血清と
の結合において著しい抗原性を示す。 上記実験においては単一種のウイルスのみが用
いられているが、同様に入手可能なその他のウイ
ルス集団およびそのウイルスと補完関係にある細
胞、普通の血清および抗血清が用いられる上記と
同様の実験においても、上記と同様の結果が得ら
れる。 本発明はウイルスをそのウイルスに対応する細
胞受容体サイトによく似たサイトを有する固定さ
れた不活性基質とコンプレツクス化することによ
つて、元のウイルス集団に比較して細胞受容体結
合活性度が著しく増加したウイルス小集団が得ら
れるという発見に基づくものである。従つて本発
明においては、ウイルス−不活性基質コンプレツ
クスが形成される。本明細書において用いられる
「コンプレツクス」という用語は、培養およびそ
の後の緩衝液洗浄の間のウイルス外皮の細胞結合
性サイトと上記不活性基質の受容体サイトとの相
互作用によつて起こるウイルスとこのウイルスを
保持する上記不活性基質とのいかなる結合をも意
味するものであり、共有結合、物理的引力、イオ
ン結合等あるいはそれらの組合せが含まれる。 上記不活性基質はウイルスとコンプレツクスを
形成する適当な反応性受容体残基を有するタンパ
ク質あるいは糖タンパク質である。このタンパク
質あるいは糖タンパク質は必要に応じて直接にあ
るいは１種もしくは２種以上のスペーサー部分を
介して不溶性担体に結合される。反応性受容体残
基はホスト細胞受容体サイトによく似た残基であ
るシアリン酸残基である。 下記の実施例はホスト細胞受容体サイトに対す
るセンダイウイルスの濃縮を説明するものであ
る。 実施例 ２ Ｎ−アセチルノイラミン酸を含有する糖タンパ
ク質であるグランドアイランドバイオロジカル社
製フエチユインが、従来の活性化およびカツプリ
ング法によつて、ガラス100mg当りフエチユイン
25mgの割合でアリルアミンが設けられた制御され
た気孔を有するガラス上に固定された。固定され
たフエチユインは燐酸塩緩衝塩水中に20mgガラ
ス／mlの割合で懸濁され、ゆるく付着しているタ
ンパク質を除去するために0.5％のBSAを含有す
るRPMI1640媒体中で37℃で30分間培養され、そ
の後上記緩衝液２ml中で洗浄された。紫外線によ
つて不活性化されたウイルス約５ml（約5000乃至
15000血球凝集単位のウイルス活性度に相当する）
が固定されたフエチユインに加えられ、
RPMI1640媒体（1.5％のBSAを含有する）中で
４℃で45分間培養された。その後、得られたガラ
ス−フエチユイン−ウイルスコンプレツクスが冷
たい（４℃）RPMI1640媒体（BSAを含有して
いない）中で洗浄され、同じ媒体少量中に再懸濁
された。温度が37℃に上げられ、30分間保たれ
た。遠心分離の後、精製されたウイルスを含有す
る上澄み液は４℃で貯蔵された。 標準クロラミン−Ｔ法によつて上記精製された
ウイルスがI125で標識付けされ、ラジオリガンド
が得られた。標準クロラミン−Ｔ法については
Nature、194、495（1962）に記載されているハン
ター氏等の論文を参照されたい。ここでもまた未
反応I125は上述と同様にして除去された。I125で
標識付けされたウイルスは４℃で貯蔵され、使用
前に再びセフアローズ4Bに通された。 上記フエチユイン受容体によつて精製されたウ
イルスを用いて実施例１と同様の実験を行なつ
た。結果を下記第２表に示す。 【表】 【表】 センダイウイルスの細胞結合は主としてシアリ
ン酸受容体によつて起こることを確めるために、
SRBCがノイラミニダーゼで処理され、その後受
容体精製されたセンダイウイルスに接触せしめら
れた。結合％はブランクの値付近まで落ちた。 実施例 ３ この実施例は上記受容体精製されたセンダイウ
イルスが用いられるウイルス−細胞結合反応の特
異性を調べるために行なわれた。この特異性試験
はリガンドの添加の前に細胞あるいはIMAに阻
害物質（inhibitor）を混合すること以外は実施
例１および２と同様にして行なわれた。置換％
（％Ｄ）は下記の式を用いて計算された。下記の
式においてＢは阻害物質が用いられた場合の結合
％、Boは阻害物質が用いられない場合の結合％
を表わし、ＢおよびBoの値はブランクの値に対
して補正された。 ％Ｄ＝Bp−Ｂ／Bo×100 【表】 第３表は上記受容体精製されたセンダイウイル
スのウイルス−細胞結合反応の特異性を調べるた
めに行なわれた上記拮抗的阻害実験の結果を示す
ものである。標識付けされたセンダイウイルスと
固定された抗体（SV−IMA）あるいはヒツジの
赤血球（SRBC）との反応はセンダイウイルスあ
るいはセンダイウイルス抗体によつて著しく阻害
されたが、ネズミの白血球ウイルス、Ｔ−２コリ
フア−ジあるいはヤギの普通の血清によつては阻
害されなかつた。 ホスト細胞受容体との結合のために濃縮された
上記ウイルス集団は生化学的に精製されたウイル
スとは異なつたゲル特性を有している。この相違
（ウイルス外皮タンパク質の量比の変化を含む）
によつて細胞受容体に対する感応性の増加の理由
が少なくとも部分的に説明されるものと思われ
る。 実施例 ４ センダイウイルスラジオリガンドのゲル分析 センダイウイルスが生化学的方法と固定された
フエチユインへの吸収および該フエチユインから
の溶離の２通りの方法で精製された。前者の生化
学的精製は37000×ｇ、75分間の冷凍遠心分離に
よるペレツト化によつて、あるいはセフアローズ
4Bによるクロマトグラフイーによつて、あるい
はその両方によつて行なわれた。２つの精製され
たセンダイウイルスはI125で標識付けされ、0.1％
ドデシル硫酸ナトリウム溶液中のポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によつて分析された（それぞ
れ第１図および第２図）。この電気泳動法につい
てはニユーヨークのアカデミツクプレス社から
1971年に出版されたモラモローシエおよびコプロ
ウスキー氏共編「ウイルス学における方法」、第
５巻、179−246頁に記載されているマイゼル氏の
論文を参照されたい。アクリルアミドの濃度は
7.5％であり、電気泳動の後ゲルは着色され、脱
色され、冷凍されそして薄切りにされ、得られた
各薄片の放射能がカウントされた。結果を第１図
および第２図に示す。２つのゲルはいずれも膜タ
ンパク質（Ｍ、68000MW）、融合要素（fusion
factor）（Ｆ−１、51000MW）および赤血球凝集
素−ノイラミニダーゼ（HN、68000MW）と一
般に呼ばれる３種類の主要な膜タンパク質を含ん
でいる〔シエイドおよびチヨピン氏による
Virology、57、470−495、（1974）参照〕。しか
しながら、２つのゲルは以下に述べる２つの点で
異なつている。すなわち、(1)HNタンパク質は受
容体精製されたウイルスにおいてより顕著であ
り、また(2)生化学的に精製されたウイルスについ
ては、ゲルの高分子量領域（薄片１乃至10）はそ
の他のピークよりも多量のタンパク質を含んでい
るが、受容体精製されたウイルスについてはそう
ではない。 ゲル分布（gelprofile）は厳密な電気泳動条件、
サンプルの標識付けおよびウイルスの精製の程度
によつて変わるが、上記結果は受容体精製によつ
て得られたウイルスラジオリガンドは複雑であ
り、センダイウイルス中に見出される膜タンパク
質からなることを示している。さらに第２図に示
されるように、細胞と有効に結合するセンダイウ
イルスラジオリガンドはHNピークが顕著である
ような、またゲルの高分子量領域のタンパク質が
その他のピークよりも少ないようなゲル分布を示
す。 先に述べたように基質は固定されるが、上記実
施例で述べた制御された気孔を有するガラスが必
ずしも用いられる必要はない。例えば、補完サイ
ト含有物質を固定するのにセフアローズ、アクリ
ルアミドあるいはプラスチツクを用いることがで
きる。 基質から濃縮されたウイルス集団を解放するの
に用いられる手段はコンプレツクス化メカニズム
に応じて異なる。特定のコンプレツクスについて
は２つ以上の手段が考えられる。例えば、センダ
イウイルス−シアリン酸タンパク質受容体コンプ
レツクスについては、温度変化の代りにシアリン
酸含有拮抗生物質（ハプテン、誘導体あるいは相
似体）による溶離が考えられる。免疫分析法にお
いて用いられるその他の日常的な方法、すなわち
PH、高濃度の塩あるいはイオンのような解離剤の
使用等あるいはそれらの組合せが考えられる。 濃縮されたウイルスリガンドは必ずしも放射性
物質で標識付けされる必要はなく、酵素標識付け
および螢光標識付けのようなその他の既知の方法
で標識付けされてもよい。勿論、放射性トレーサ
ーが用いられる場合には、そのトレーサーは必ず
しもI125である必要はない。 標識付けされたウイルスリガンドは免疫分析法
における抗原のように、ウイルスリガンドが使用
されるいかなるタイプの拮抗結合法にも用いるこ
とができる。受容体陽性の細胞、組織、糖タンパ
ク質、体液、滲出物等の定量、あるいは抗原結合
の研究を行なうことができる。例えば、センダイ
ウイルスラジオリガンドは適当なシアリン酸受容
体の定量、グリコリルノイラミン酸酸含有タンパ
ク質とアセチルノイラミン酸酸含有タンパク質の
分離等に用いることができる。
第１図および第２図はI125で標識付けされたセ
ンダイウイルスの電気泳動分布を示すものであ
り、第１図は生化学的に精製されたセンダイウイ
ルス、第２図は固定されたフエチユインへの吸着
および該フエチユインからの溶離によつて精製さ
れたセンダイウイルスの場合である。第１図およ
び第２図においてNP，HN，Ｆ−１およびＭは
ウイルスタンパク質を表わすものであり、それぞ
れ核タンパク質、赤血球凝集素−ノイラミニダー
ゼ、融合要素および膜タンパク質である。
ンダイウイルスの電気泳動分布を示すものであ
り、第１図は生化学的に精製されたセンダイウイ
ルス、第２図は固定されたフエチユインへの吸着
および該フエチユインからの溶離によつて精製さ
れたセンダイウイルスの場合である。第１図およ
び第２図においてNP，HN，Ｆ−１およびＭは
ウイルスタンパク質を表わすものであり、それぞ
れ核タンパク質、赤血球凝集素−ノイラミニダー
ゼ、融合要素および膜タンパク質である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ホスト細胞に対する結合感応性が高められた
センダイウイルス小集団の調製方法であつて、 センダイウイルス集団を、該ウイルスのホスト
細胞受容体サイトに類似したシアリン酸部分を有
する固定化不活性基質と接触させ、 該ウイルス集団の少なくとも一部を該基質とコ
ンプレツクス化し、 コンプレツクス化されていないウイルスを除去
し、 上記コンプレツクスを解離して上記基質からコ
ンプレツクス化ウイルスを上記ウイルス小集団と
して回収することを特徴とする調製方法。 ２ 上記コンプレツクスの解離を温度変化によつ
て行うことを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の調製方法。 ３ ホスト細胞に対する結合感応性が高められた
センダイウイルス小集団の調製方法であつて、 センダイウイルス集団を、該ウイルスのホスト
細胞受容体サイトに類似したシアリン酸部分を有
する固定化不活性基質と接触させ、 該ウイルス集団の少なくとも一部を該基質とコ
ンプレツクス化し、 コンプレツクス化されていないウイルスを除去
し、 上記コンプレツクスを解離して上記基質からコ
ンプレツクス化ウイルスを上記ウイルス小集団と
して回収し、 該ウイルス小集団を標識付けすることを特徴と
する調製方法。 ４ 上記コンプレツクスの解離を温度変化によつ
て行うことを特徴とする特許請求の範囲第３項記
載の調製方法。 ５ 上記標識付けを放射性物質、酵素および螢光
物質からなる群より選ばれた少なくとも１種の物
質によつて行うことを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の調製方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/074,918 US4282315A (en) | 1979-09-13 | 1979-09-13 | Preparation of enriched whole virus radioligand |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS56102786A JPS56102786A (en) | 1981-08-17 |
| JPH0223157B2 true JPH0223157B2 (ja) | 1990-05-23 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPS56102786A (ja) |
| CA (1) | CA1153308A (ja) |
| DE (1) | DE3034142A1 (ja) |
| FR (1) | FR2464995A1 (ja) |
| GB (1) | GB2060690B (ja) |
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- 1980-09-12 JP JP12700880A patent/JPS56102786A/ja active Granted
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