JPH022589B2

JPH022589B2 -

Info

Publication number: JPH022589B2
Application number: JP12815780A
Authority: JP
Inventors: Yukihiko Kameda; Satoshi Horii
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-09-16
Filing date: 1980-09-16
Publication date: 1990-01-18
Also published as: JPS5754593A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、バリエナミンの製造法に関する。

本発明者らは先にバリダマイシンＡまたはバリ
ドキシルアミンＡにシウドモナス・デニトリフイ
カンス（Pseudomonas denitrificans）の菌体を
作用させることにより、下式で表わされる物質を
天然界より初めて単離し、バリエナミンと命名
し、報告した。〔亀田ら、ジヤーナル・オブ・
ザ・ケミカル・ソサイアテイ；ケミカル・コミユ
ーニケイシヨン（J.Chem.Soc.Chem.Commun.）
1972年、746頁〕しかしながら、上記方法によるバリエナミンの
産生は、本菌株がバリダマイシンＡまたはバリド
キシルアミンＡを直接資化せず、他の炭素源、例
えばグルコースなどを含む培地で培養して得られ
る菌体を用いなければならず、またそのバリダマ
イシン分解能は微弱であり、バリエナミンの大量
生産には適していない。

一方、本発明者らは、バリダマイシンを効率よ
く分解しうる菌を検索して、石川県金沢市の水田
の土壌より、フラボバクテリウム（Flavobac−
terium）属の新菌株フラボバクテリウム・サツ
カロフイルム（Flavobacterium saccharo−
philum n.sp.、IFO 13984）を発見単離し、1979
年今井により新菌種として報告され（昭和54年
度、日本醗酵工学会講演要旨集p242）ているが、
この菌をはじめとして、フラボバクテリウム属に
は、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンを
好収率でバリエナミンに分解しうる菌が存在する
ことを知見し、本発明を完成した。

即ち、本発明は、フラボバクテリウム属に属
し、バリダマイシンまたはバリドキシルアミンに
作用してバリエナミンを生成しうる酵素を産生す
る微生物またはその処理物をバリダマイシンまた
はバリドキシルアミンに作用させることを特徴と
するバリエナミンの製造法である。

本発明方法に用いられるバリダマイシンは、農
業用抗生物質として広く用いられており、その構
造は、バリドキシルアミンとＤ−グルコースとか
ら成り立つている。バリドキシルアミンは現在Ａ
とＢが知られており、そのバリドキシルアミン
Ａ、ＢとＤ−グルコースとの組み合わせによりバ
リダマイシンはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆとして存
在することが知られている。

本発明方法においては、このような個々のバリ
ダマイシン、バリドキシルアミンあるいはその混
合物を原料として用いることができ、たとえばバ
リダマイシン生産菌の培養物あるいはその処理物
が有利に用いられる。

本発明方法で用いられる微生物は、バリダマイ
シンまたは、バリドキシルアミンをバリエナミン
に変換する能力を有するフラボバクテリウム属に
属する微生物及びその変異株であればいずれでも
良く、たとえば、フラボバクテリウム、サツカロ
フイルム（Flavobacterium saccharo−philum.
n.sp.、IFO 13984、FERM−Ｐ No.5707）など
が用いられる。このフラボバクテリウム・サツカ
ロフイルムはグラム陰性、オキシダーゼ陽性、非
運動性桿菌であり、バリダマイシンを唯一の炭素
源としても、よく生育し糖を酸化的に分解する。
そして単一炭素源として多種類の糖を利用する
が、クレブスサイクルの中間体や糖アルコールを
利用しない。また寒天平面上の滑走は認められて
いない。（日本醗酵工学会大会、昭和54年11月７
日、口頭発表、講演用旨集 242頁）本発明の方法における上記の微生物の培養に用
いられる培地は該菌株が利用し得る栄養源を含む
ものなら、液状でも固状でもよいが、大量を処理
するときには液体培養を用いるのがより適当であ
る。培地には上記の微生物が同化し得る炭素源、
消化し得る窒素源、無機物質、微量栄養素等が適
宜配合されてもよい。炭素源としては、たとえば
ブドウ糖、乳糖、シヨ糖、麦芽糖、デキストリ
ン、でん粉、グリセロール、マンニトール、ソル
ビトール等、油脂類（例、大豆油、ラード油、チ
キン油等）その他が、窒素源としては、たとえば
肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コー
ン、スチープ、リカー、ペプトン、棉実粉、癈糖
蚯、尿素、アンモニウム塩類（例、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢
酸アンモニウム等）その他が用いられる。さらに
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ムなどを含む塩類、鉄、マンガン、亜鉛、コバル
ト、ニツケルなどの金属塩類、リン酸、ホウ酸な
どの塩類や酢酸、プロピオン酸などの有機酸の塩
類が適宜用いられる。その他、アミノ酸、（例、
グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、グリ
シン、リジン、メチオニン、プロリン等）、ペプ
チド（例、ジペプチド、トリペプチド等）、ビタ
ミン類（例、B₁、B₂、ニコチン酸、B₁₂、Ｃ、Ｅ
等）、核酸類（例、プリン、ピリミジンおよびそ
の誘導体等）等を含有させてもよい。もちろん培
地のPHを調節する日的で無機または有機の酸、ア
ルカリ類、緩衝剤等を加え、あるいは消泡の目的
で油脂類、表面括性剤等の適量を添加してもよ
い。

培養の手段は静置培養でも、振盪培養あるいは
通気撹拌培養法等の手段を用いてもよい。大量の
処理には、いわゆる深部通気撹拌培養によるのが
望ましいことはいうまでもない。培養の条件は培
地の状態、組成、菌株の種類、培養の手段等によ
つて一定しないのは当然であるが、それらは通常
20℃〜45℃の温度で初発PHを中性附近に選択する
のがよい。とりわけ、培養中期の温度は24℃〜37
℃、また初発PHは6.5〜8.5の条件が望ましい。培
養時間は６〜100時間程度で良いが、とくに16〜
60時間で良好である。

本発明で用いられる「培養物」とは、上記の培
養で得られるものをいう。

本発明では、このようにして得られた菌体ある
いはその処理物を用いることができ、ここに「処
理物」とは、上記で得られる培養物を物理化学的
処理たとえばろ過、遠心分離、超音波処理、フレ
ンチプレス処理、アルミナ磨砕、溶菌酵素処理、
界面括性剤または有機溶媒処理などで得た菌体あ
るいは酵素を含む菌体破砕物をいう。また公知の
方法で精製して得られる酵素または公知の方法で
固定化した菌体または酵素も用いることが出来
る。

本発明方法は、原料化合物と上記の微生物また
はその処理物とを接触させて行なわれる。反応液
中の原料化合物の濃度は１〜５％が適当である。
反応温度は20〜45℃、PHは５〜８が適当である
が、特に温度は24〜30℃、初発PHは6.5〜7.5が良
好である。反応時間は分解反応液に加える上記の
微生物の発育状態および菌体量によつても異なる
が、24〜200時間、さらに好ましくは48〜100時間
が適当である。また反応は静止下でも振とう、通
気またはかくはんの条件下でもよいが、振とう、
通気またはかくはんする方が良好である。反応液
中には、所望により反応促進剤、酵素安定化剤、
防腐剤（ペニシリン系抗生物質、アミノグリコシ
ド系抗生物質等）などを添加してもよい。

反応液中から目的物を採取するには、通常微生
物代謝物を採取するのに用いられる手段が単独あ
るいは任意の順序に組み合わせて、または反復し
て用いられる。すなわち、例えば、濾過、遠心分
離、濃縮、乾燥、凍結乾燥、吸着、脱着、各種溶
媒に対する溶解度の差を利用する方法（例えば、
沈澱、結晶化、再結晶等）、クロマトグラフイー
などが用いられる。またバリエナミンが水に可溶
で一般の有機溶媒に難溶な塩基性物質であること
を利用して、いわゆる水溶性塩基性物質の単離精
製に用いられる方法、例えばイオン交換樹脂、活
性炭、ハイポーラスポリマー、セフアデツクス、
セフアデツクスイオン交換体、セルローズ、イオ
ン交換セルローズ、シリカゲル、アルミナ等を用
いるクロマトグラフイーや吸脱着法が有利に用い
られる。

次に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例１フラボバクテリウムサツカロフイルムNo.121
株（IFO 13984）をバリダマイシンA1％、硫酸
アンモニウム１％、リン酸一水素カリウム0.7％、
リン酸二水素カリウム0.3％、硫酸マグネシウム
0.01％（PH7.1）を含有する培地２に接種し、
27℃で４日間振盪培養を行なつた。得られた培養
液を遠心分離により菌体を除いて上清を得る。こ
の上清をアンバーライトIRC−50（アンモニウム
型、500ml）カラムに通してバリエナミンを吸着
させ、水洗後0.5Nアンモニア水でこれを溶出す
る。溶出液を減圧濃縮し、さらにダウエツクス１
×２（OH^-型、500ml）カラムに通し、つづいて
水で溶出する。ニンヒドリン陽性区分を分取し、
減圧濃縮乾固する。80％エタノール水より結晶化
して無色針状晶のバリエナミン3.5ｇを得る。

実施例２２坂口フラスコ中、トリプチカーゼ
（Trypticase 、BBL社製）15ｇを水500mlに溶
解し、減菌後フラボバクテリウムサツカロフイ
ルムNo.121株を接種し、28℃で24時間振盪培養す
る。

この培養液を50醗酵槽中の硫酸アンモニウム
300ｇ、リン酸一水素カリウム210ｇ、リン酸二水
素カリウム90ｇ、硫酸マグネシウム３ｇの水溶液
（30）にバリダマイシンＡ粗製物（バリダマイ
シンＡ約20％、バリダマイシンＢ約３％等を含む
精製中間体）３Kgを溶解し、消泡剤を加え、滅菌
した液に加える。

反応液をPH7.1に調節し、４日間、通気下に撹
拌する。

上記の反応液の20を遠心分離し、上澄液をア
ンバーライトIRC−50（NH⁺ ₄型）のカラム（10
）に通過吸着させ、カラムを水洗後、0.5Nア
ンモニア水で溶出し、溶出画分を減圧濃縮する。
残留物をダウエツクス１×２（OH^-型）のカラム
クロマトグラフイーに付しカラムを水で溶出す
る。バリエナミン溶出区分を減圧濃縮し、濃縮液
にアセトンを加えて結晶化する。収量55.5ｇ。

実施例３坂口フラスコ中、トリプチカーゼ15ｇを水500
c.c.に溶解し、滅菌後、フラボバクテリウム・サツ
カロフイルムNo.121株を接種し、27℃で24時間振
盪培養する。培養液を遠心分離して菌体を集め、
0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）で一回洗浄して湿菌
体約2.5ｇを得る。この菌体をバリドキシルアミ
ンＡ（5.0ｇ）の0.1Mリン酸緩衝液溶液（PH7.0、
３）に加え、振盪下27℃で72時間反応を行な
い、反応液を遠心分離して菌体を除去する。得ら
れた上澄液を実施例１と同様の方法で処理してバ
リエナミン1.0ｇを得る。

実施例４硫酸アンモニウム１％、リン酸一水素カリウム
0.7％、リン酸二水素カリウム0.3％、硫酸マグネ
シウム0.01％を含む水溶液（100ml）にバリダマ
イシンＥおよびＦの混合物（約３：２の混合物）
1.0ｇを溶解し（PH7.1）、フラボバクテリウム・
サツカロフイルムNo.121株を接種し、27℃で４日
間振盪培養を行なう。培養液を遠心分離により菌
体を除き、上澄液を実施例１と同様の方法で処理
してバリエナミン0.11ｇを得る。

Claims

【特許請求の範囲】

１フラボバクテリウム属に属し、バリダマイシ
ンまたはバリドキシルアミンに作用してバリエナ
ミンを生成しうる酵素を産生する微生物またはそ
の処理物を、バリダマイシンまたはバリドキシル
アミンに作用させることを特徴とするバリエナミ
ンの製造法。