JPH0229185B2

JPH0229185B2 -

Info

Publication number: JPH0229185B2
Application number: JP57190059A
Authority: JP
Inventors: Mitsuo Watanabe; Masao Yamazaki; Hiroshi Masago; Shigeyuki Kimura
Original assignee: Nihon Bunko Kogyo KK
Current assignee: Jasco Corp
Priority date: 1982-10-29
Filing date: 1982-10-29
Publication date: 1990-06-28
Also published as: JPS5979835A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は微小粒子分析装置に関するもので、特
に連続的に通過する試料懸濁液中の微小粒子試料
の数、形状、性質等を自動的に測定して微小粒子
試料の性状に応じて試料粒子を分析測定するため
の微小粒子分析装置に関する。

この種の機能を備えた装置はフローサイトメー
タとして知られるものが一般的であり、分析の結
果判明した細胞の性状に基いて高速で判断ができ
るため病状診断や遺伝子生物学の分野等で需要が
増加しつつある現状である。フローサイトメータ
は毎秒5000個あるいはそれ以上の速さで細胞を分
析測定した上でその分析結果を出力するもので、
一般に次のような部分、即ち不活性液体を加圧し
て層流として毛管内を通過させその中へ細胞懸濁
液等の被検液を流し込む部分、被検液がこの毛管
ノズルを流出した直後にレーザ光を照射する部
分、レーザ光照射による試料粒子からの散乱光を
検出する散乱光検出部、螢光を検出する螢光検出
部、螢光偏光解消度を検出する螢光偏光解消度検
出部等を有する光検出部分、光検出部からの出力
パルスの高さ、パルスの面積、パルスの時間幅を
検出する回路のアナログ演算部分、アナログ演算
部出力をＡ／Ｄ変換しマイクロコンピユータに入
力するインターフエイス部分、及びパルスの高さ
の度数分布、パルスの面積の度数分布、パルスの
時間幅の度数分布等を計算表示するマイクロコン
ピユータ部分からなるもので、ジエツトノズルか
らの流出速度は毎秒約10ｍに達し、予め螢光染色
された被検液中の細胞が照射レーザ光によつて生
ずる散乱光を光電増倍管等で検出することによつ
て細胞の数や大きさを測定する。

フローサイトメータは細胞の計数と性状の簡単
な解析を行うのみでなく、レーザ光を例えばシリ
ンドリカルレンズで整形して細胞の最大径と細小
径や、細胞内の核の位置、あるいは細胞径と核径
との比を求めたり、レーザ光に対する細胞の配位
方向の変化に由来する誤判定の防止などの機能を
付加することもできる。またジエツトノズル先端
からの僅かに離れた位置で、レーザ照射方向と異
る角度で細胞からの螢光を検出する場合には螢光
染色された細胞内のDNAがレーザによつて励起
されて基底状態への移行の過程で螢光を放射する
ため細胞から放射される螢光を、例えばダイクロ
ミツクミラーで赤と緑の二波長域に分解してそれ
ぞれの波長での螢光強度を光電増倍管等で検出し
その信号を波高解析器などで分析し出力し、螢光
強度からは細胞内のDNAの量が主として計測さ
れる。螢光現象は複雑で螢光染料が付着した細胞
内の場所とその周辺の状態に関する情報も含んで
いるため、螢光の偏光や螢光偏光解消度を測定す
ることにより細胞内分子間のエネルギー伝達を解
析する等、詳細な細胞の構造、性質の解明が行わ
れる。

このようにして得られる複数個の測定情報はそ
れぞれ検知器で電気信号に変換され増幅された後
に、信号処理回路を経て波高解析器やオシロスコ
ープで信号強度を測定されたり、デジタル変換し
てミニコンピユータ等でデータ処理される。信号
処理回路は散乱光による細胞数の計測を行うシン
グル・パラメータ分析、複数の螢光波長域信号比
演算、螢光偏光解消度の演算、細胞の振り分け採
取制御、同一液滴に関する散乱光検出と螢光また
は螢光偏光解消検出との時間的ずれに対する遅延
動作制御、散乱光と各種螢光信号間の相関性処
理、各種光信号の積分等の機能を有している。

一般に波高解析等のフローサイトメータによる
分析情報はアナログ信号よりもデジタル化してマ
イクロプロセツサやコンピユータを用いるほうが
高度なデータ処理ができるが、マイクロプロセツ
サでデータ処理を行うには短かい時間間隔で発生
する複数の信号とマイクロプロセツサに取り込む
時間特性との間にずれがあつてＡ／Ｄ変換した信
号を直接扱うことができないためにフローサイト
メータに使用されていない。従来からのコンピユ
ータ或はミニ・コンピユータは時間特性の整合は
可能であり、またデータ・レコーダにＡ／Ｄ変換
した信号を収録しオフ・ラインで処理してもよい
が、ミニ・コンピユータであつても操作が複雑な
上に装置が大型となり高価であるためこの問題の
解決が強く望まれてきていることは周知の通りで
ある。アナログ信号をオシロスコープで観測した
り、マルチチヤンネル波高解析器を用いることに
よりリアルタイムで測定結果の表示はできるが複
数種類の測定に限界があることも知られていると
ころである。

従つて本発明の目的はこれらの問題を解決する
ことであり、市販の量産型マイクロコンピユータ
を用いて高度のデータ処理ができるフローサイト
メータ及びそのためのインターフエイスを提供す
ることである。本発明によるインターフエイスは
一枚のボードに組立てることが可能であつて市販
のフローサイトメータの内装も可能となるためフ
ローサイトメータ筐体からバス・ラインでマイク
ロコンピユータと直結することができる。また本
発明で使用されるマイクロコンピユータは最も小
型化された所謂ハンド・ヘルド型のものでよくこ
れによつて普及型の小型かつ操作性の優れた微小
粒子分離装置の提供を可能ならしめたものであ
る。

既に述べたように本発明の微小粒子分析装置は
生物細胞粒子の数や、大きさ、性質等の分析や分
離採取を目的とするフローサイトメータとして好
適に使用されるがそれ以外のセルロースや各種の
生物細胞以外の微小粒子の分離装置としても有効
に使用し得ることは当然のことである。

以下フローサイトメータを例として本発明を図
面に沿つてさらに詳細に説明する。

第１図はインターフエイスを内装してマイク
ロ・コンピユータと直結したセル・ソーテイング
装置のブロツク・ダイアグラムである。すなわち
図面で、１は被検液送出および圧力調整部、２はフロ
ー・セル、３はドレーン系統、５はレーザ光源、
６は光源レンズ系、７，７′，７″はレンズ系、８
はダイクロミツク・ミラー、９は散乱光学系、１
０は螢光光学系、１１は螢光光学系、１２は
螢光偏光光学系、１３は散乱光検出器、１４は
螢光検出器２、１５は螢光検出器３、１６は
螢光偏光検出器４、１７は前置増幅器、１８は
前置増幅器２、１９は前置増幅器３、２０は前置
増幅器４、２１はマルチ・パラメタ信号処理回路
（アナログ演算部）、２２はインターフエイス、２
３はマイクロコンピユータ、２４は表示系であ
る。

第２図は上記のインターフエイス２２にかかわ
る部分のブロツク・ダイアグラムの１例を示す。

２１は第１図におけるマルチ・パラメタ信号処
理回路であつて、インタフエイスへの入力信号を
予め散乱光系からのシングル・パラメタ、あるい
は散乱光学系信号と螢光関係信号の内の任意の１
信号、または螢光関係信号の内の任意の２信号に
選別する。これらの信号はいずれの細胞１個に対
応したパルス出力であつて、２１はそのパルス高
さ、パルス幅、パルス面積を電圧に変換するアナ
ログ演算部である。つまり、４個の検出器からの
出力を測定の目的に従つて１種または２種の信号
の送別、利得制御、積分、ピーク・ホールドなど
を行う。２１からのパルス出力Ａ、パルス出力Ｂ
は、それぞれインタフエイス内のＡ／Ｄ変換器、
３１および３２でデイジタル化される。３５およ
び３６はシフトレジスタで、そのいずれかに信号
Ａと信号Ｂが交互に蓄えられそのシフトレジスタ
の容量が満たされると、他方のシフトレジスタが
信号Ａと信号Ｂが同様に蓄積を始める。シフトレ
ジスタの動作制御はシフトレジスタ制御器３９が
行う。容量が満たされたシフトレジスタは、割り
込み制御器の動作によつて入出力バス・インタフ
エイス４１を経てマイクロ・コンピユータへデー
タを転送する。２系列のシフトレジスタへの信号
Ａ，Ｂの流れの開閉はゲート回路３３，３４，３
７，３８が行う。４１からの出力はマイクロ・コ
ンピユータ内でデータ処理が行われ、プリンタや
プロツタなどの表示系に出力する。コンピユータ
への割り込み処理のように高速を要するソフトウ
エアはアセンブリ言語で、その他の部分は
BASIC言語でプログラムされ、マイクロ・コン
ピユータがバス・ライン４２、入出力バス・イン
タフエイス４１を経てインタフエイスの動作を統
括する。

以下第３図にインタフエイスの更に詳細な実施
例を、第４図に動作タイム・チヤートを示す。

各検出器からの出力のうち、第２図に示すマル
チ・パラメタ信号処理回路２１で散乱光信号が第
３図入力Ａとして、螢光信号が第３図入力Ｂと
して選択され入力するものとする。信号Ａおよび
信号ＢはそれぞれＡ／Ｄ変換器５１および５２で
デイジタル化される。Ａ／Ｄ変換器が12ビツトで
あれば、デイジタル信号ＡおよびＢはそれぞれ12
本のバス・ラインを経てバツフア増幅器など次の
回路を通り、処理された後にマイクロ・コンピユ
ータへの出力ケーブル端７０へ送られる。第３図
ではこれらバス・ラインを模式的に表した。

ところでＡ／Ｄ変換器はそれぞれＡ／Ｄ変換が
終る度にその信号EOC（End of Conversion）を
出す。それぞれのＡ／Ｄ変換器EOC信号が
NAND回路５３で反転され、ワン・シヨツト回
路５６へ入力する。５６は入力信号の立上りで反
転出力を出す。この信号が次いで、NOR回路
５７を経てワン・シヨツト回路５８へ入力し、５
８は信号の立下りでパルス信号Ｑを発生する。
ここでワン・シヨツト回路５６および５８のパル
ス幅はそれぞれのワン・シヨツト回路の時定数で
定めるが、ワン・シヨツト回路５８のパルス幅τ₁
はワン・シヨツト回路５６の時定数τ₂より大きく
する。これらの時間関係は第４図タイム・チヤー
トに示す通りである。ワン・シヨツト回路５８の
時定数τ₂で定められた時間を経過すると、パルス
は立ち下りこの信号がカウンタ６３へ入力しカウ
ンタQ_Aを動作させて１個計数する。

カウンタQ_Aは反転してワン・シヨツト回路５
８にフイード・バツクし５８を元の状態へ戻す。
これによつて５８はτ₂の時間幅のパルスを発生す
る。５８で生じたパルスはカウンタ６３を動作さ
せて桁上げを行う。一方、カウンタ６３の出力は
インバークを経てバツフア増幅器５４と５５へ入
る。即ち、６３の出力はバツフア増幅器５４と５
５を交互に開閉するゲート動作をさせる。つま
り、カウンタ６３の出力が正のときバツフア増幅
器５０を反転信号のときバツフア増幅器５２を開
く。この結果シフトレジスタ６０はＡ／Ｄ変換器
からの信号Ａと信号Ｂとを交互に読み込む。

実施例のカウンタ１６進のものを用いており、
よつてＡ，Ｂの組で８ビツトをカウントする。カ
ウンタ６３の最大桁の出力で、シフトレジスタ５
９と６０の動作を切り換える。

更に、ワン・シヨツト回路５８の出力は分岐し
てワン・シヨツト回路６４へ入り、６４は予め定
められた時定数τ₃で定められたパルスを発生す
る。τ₃の遅延時間を経て、６４の出力はワン・シ
ヨツト回路６５を動作させ、同様に６５は時定数
τ₄で定められたパルスを発生する。ワン・シヨツ
ト回路６５の出力はANDとORで組合された論理
回路６６を経てシフトレジスタ５９と６０へそれ
ぞれ入力し、シフトレジスタに読み込まれたデー
タをシフトさせる。これらシフトレジスタ５９と
６０は、カウンタ６３の最大桁の出力を論理回路
６６へ導いて、そのいずれを動作させるかを決め
る。

シフトレジスタに蓄えられたデータは、マイク
ロ・コンピユータからの指令が６９から入つてバ
ス・ライン７０を通り、マイクロ・コンピユータ
へ出力する。二つのシフトレジスタのいずれから
マイクロ・コンピユータへ読み込むかは、これら
シフトレジスタの動作順序とデータシフト指令の
信号によつて判定され、カウンタ６３の最大桁の
状態によつて定まる。

フリツプフロツプ６７′および６７″は、シフト
レジスタ５９と６０が交互に動作してデータの蓄
積が終つたとき、マイクロ・コンピユータへそれ
を送り込むために、割り込む動作指令を発生す
る。割り込み指令は、OR回路６８を経て割り込
み指令出力端７２からマイクロ・コンピユータへ
送られる。フリツプフロツプ６７′および６７″は
論理回路６６とバツフア増幅器６１および６２を
介して、シフトレジスタへ接続している。本実施
例ではシフトレジスタを用いてデータの一時蓄積
を行つたが、ランダム・アクセス・メモリ
（RAN）を用いることもできる。

第５図はRAMを用いた場合のブロツク・ダイ
アグラムを示す。シフトレジスタに比べ、データ
の蓄積量が増加でき、かつデータを交互に配列さ
せる必要がない。

AD変換器８１と８２でデイジタル化された信
号はそれぞれバツフア増幅器８３と８４を経て
RAM８７へ入るがカウンタで構成される。
RAM制御器８５からの指令で指定された番地に
データ読み込む。RAMは複数のデータ記憶部を
有し、その一つにデータを読み込み、他から読み
込んだデータをマイクロ・コンピユータへ送り出
す。RAMからのデータ読み出しはRAM制御器
８５からの指令で読み出す、番地を指定して行
う。マイクロ・コンピユータへの出力は、割り込
み制御器８６の動作によつて出力端４２へ表れ
る。

本発明のインターフエイスはフローサイトメー
タからの分析データをシフトレジスタまたはラン
ダム・アクセス・メモリへ読み込んでいる一方
で、マイクロ・コンピユータへすでに読み込んだ
データを送り出している。従つて、高速で発生す
るデータをまとめてコンピユータへ送り出すこと
ができ、かつ割り込み動作を行うことによつて市
販のマイクロ・コンピユータの使用が可能にな
り、同時にマイクロ・コンピユータの負担を少く
することができる。

次に本発明の装置を適した光学系統の構成につ
いて述べる。

第６図は主に本装置の光学系を示した図で、被
検出液送出・圧力調整部１から試料と不活性液体
がフローセル２へ圧送され、フローセル中の毛細
ノズルから前述のように層流状態を保ちながら流
出される。一方、レーザ光源５からの照射光は、
光源レンズ系６を経て層流状態の試料に照射さ
れ、試料からの散乱光、螢光がそれぞれ散乱光学
系９、螢光光学系１０，１１、螢光偏光学系１２
へ導かれ、既述の通りの分析が行われる。

本発明の好ましい実施例では、第７図に解り易
く示したように、散乱光学系９にオプテイカルフ
アイバー１７１を用いる。オプテイカルフアイバ
ーの束の一方端を複数の細束に分け、その端面を
図示のような１〜５の区域に分画する。そして、
各分画部分に対応したフアイバー細束をそれぞれ
の検知器１７２前面に位置させる。このようにす
れば、散乱光を任意の角度成分に分けて測光で
き、図示例では５次元のベクトルとして細胞識別
処理を行える。又、分画部分のうち必要な区画だ
けを取り出すようにしてもよい。

第８図は、螢光光学系における集光部分を示し
ており、１８１は照射レーザ光の光軸、１８２は
試料から発せられる螢光の光軸である。一般に、
照射レーザ光がフローセル２を通過する際毛管壁
で生じる散乱光は、水平にドーナツツ状に散乱す
る。従つて、この散乱光が測定光学系に入るのを
防ぐため、本発明では照射光の光軸１８１を含む
水平面に対してθの角度をつけて螢光を集光して
いる。θの大きさとしては、螢光の集光角度（半
角）をとすると、θであるのが望ましい。

第９図ａ，ｂは照射レーザ光を試料へ導くため
の光源レンズ系６を示している。第９図ａ中１９
１はレーザ光源５からの円形光束、１９２は２枚
で一対のシリンドリカルレンズ、１９３はシリン
ドリカルレンズ透過後の楕円形光束である。２枚
のシリンドリカルレンズ１９２は、図示のように
十字に組合せて配置してある。このようにすれ
ば、試料への照射光を任意の楕円形状に収束でき
るため、測定すべき細胞の大きさに合せて最適な
レーザ照射光が得られる。

但し、シリンドリカルレンズ１９３を用いる
と、第９図ｂ中ａ，ｂ，ｃ，ｄで示したように、
シリンドリカルレンズ１９３の入出射面で散乱光
が発生する。この散乱光が測定光学系へ侵入する
のを防ぐため、本発明のさらに好ましい実施例で
は、シリンドリカルレンズとフローセル２の間に
ピンホールマスク１９４が配置される。

又本発明の好ましい実施例では、第６図中１６
１で示したように、フローセル２内の毛管ノズル
先端に温度調節用の熱交換ブロツクが取付けら
れ、フローセルに入る直前にシース液とサンプル
液を温調する。両液は毛管ノズルを通つてフロー
セル２中へ流出されるため、高い流路抵抗によつ
て温度変化を生じ易いが、本実施のようにすれば
両液の温度は常に一定に保たれ、測定の安定度が
高まる。

さらに本発明の好ましい実施例では、特に図示
しなかつたが、測定系中に粒子計数器が設けられ
る。この粒子計数器は、目的の粒子が一定時間当
りいくつ測定にかかつているかをモニターするメ
ータである。この粒子数モニターによつて、サン
プル流量が処理能力の限界を越えないように制御
できる。第１０図はシフトレジスタを用いたイン
タフエイスを使用して得た結果の一例で、マウス
の赤血球とリンパ球の混合試料の前方散乱ヒスト
グラムである。第１１図は螢光ヒストグラム、第
１２図は血液についての２次元分布図の例であ
る。

以上述べたように本発明によれば、マイクロコ
ンピユータと接続して高速処理が可能なインター
フエイスを有する微小粒子分析装置が得られる。
又、このような装置での測定に適した光学系を始
めとする構成が得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本装置のブロツク・ダイアグラム、第
２図は本発明によるインタフエイスのブロツク・
ダイアグラム、第３図はシフトレジスタによるイ
ンタフエイス回路模式図、第４図はインタフエイ
ス動作のタイム・チヤート、第５図はRAMを用
いたインタフエイスブロツク・ダイアグラム、第
６図は主に本装置の光学系を示した図、第７図は
散乱光学系を示した図、第８図は螢光光学系の集
光部分を示す図、第９図ａ，ｂはそれぞれ光源レ
ンズ系を示す図、第１０図は前方散乱強度ヒスト
グラムの例を示す図、第１１図は螢光強度ヒスト
グラムの例を示す図、第１２図は２次元分布図出
力例を示す図である。１……被検液選出・圧力調整部、２……フロー
セル、３……ドレン系、５……レーザ光源、６…
…光源レンズ系、９……散乱光学系、１０，１１
……螢光光学系、１２……螢光偏光光学系、１３
〜１６……検出器、２１……アナログ演算部（マ
ルチパラメタ信号処理回路）、２２……インタフ
エイス、２３……マイクロコンピユータ、２４…
…表示系、１６１……熱交換ブロツク、１７１…
…オプテイカルフアイバー、１８１……照射レー
ザ光の光軸、１８２……螢光の光軸、１９１……
円形光束、１９２……シリンドリカルレンズ、１
９３……楕円形光束、１９４……ピンホールマス
ク。

Claims

【特許請求の範囲】１微小粒子懸濁液と該懸濁液に不活性な流体を
流すフロー管部、該フロー管部の途中で微小粒子
懸濁液を不活性流体のフローの中心軸として注入
し該懸濁液と不活性流体との合流体を層流状態に
保持し層流状態のまま検知領域を通過させるジエ
ツトノズル部、該検知領域に照射するレーザ光
部、レーザ光照射による試料からの散乱光、螢
光、螢光偏光度等の光情報を検出する光検出部、
光検出部からのパルス状出力信号の高さ、時間
幅、面積とパルス状信号の１個乃至複数個の情報
の比、差、和、対数あるいはそれらの組合わせの
値を求めるアナログ演算部、該アナログ演算部出
力をＡ／Ｄ変換してマイクロコンピユータに入力
するインタフエイス部、該インタフエイス部の入
力情報の出力からパルス状信号の高さの度数分
布、パルス状信号の面積度数分布、パルス状信号
の時間幅の度数分布を計算表示するマイクロコン
ピユータ部からなる装置において、該Ａ／Ｄ変換
器出力信号を順次読取り記録しそれが満了すると
隣りへその情報を移動させ、その動作を順次繰り
返す複数列からなる信号読取り移動列部の一連の
情報読取り部を複数群備え、信号読取り移動列部
が読取り満了後、別の信号読取り移動列部が信号
読取りを同様に行うと共に、既に信号を読取り記
憶した信号読取り移動列から読取り記憶情報をマ
イクロコンピユータに入力する制御論理回路を有
することを特徴とする微小粒子分析装置。２微小粒子懸濁液と該懸濁液に不活性な流体を
流すフロー管部、該フロー管部の途中で微小粒子
懸濁液を不活性流体のフローの中心軸として注入
し該懸濁液と不活性流体との合流体を層流状態に
保持し層流状態のまま検知領域を通過させるジエ
ツトノズル部、該検知領域に照射するレーザ光
部、レーザ光照射による試料からの散乱光、螢
光、螢光偏光度等の光情報を検出する光検出部、
光検出部からのパルス状出力信号の高さ、時間
幅、面積とパルス状信号の１個乃至複数個の情報
の比、差、和、対数あるいはそれらの組合わせの
値を求めるアナログ演算部、該アナログ演算部出
力をＡ／Ｄ変換してマイクロコンピユータに入力
するインタフエイス部、該インタフエイス部の入
力情報の出力からパルス状信号の高さの度数分
布、パルス状信号の面積度数分布、パルス状信号
の時間幅の度数分布を計算表示するマイクロコン
ピユータ部からなる装置において、Ａ／Ｄ変換器
出力信号を記憶する動作がそれに要する時間と記
憶位置に無関係に行われ、かつ読取りのできる記
憶部を備え、信号読取りと既に信号を読取り記憶
した情報をマイクロコンピユータに入力する制御
論理回路部を有することを特徴とする微小粒子分
析装置。３レーザ光照射による試料からの散乱光を検出
する散乱光検出部がオプテイカルフアイバー束の
端面の一端を複数の細束に分画し、各分画部分の
フアイバー細束を複数の検知器の前面に設置した
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項及び第２
項記載の微小粒子分析装置。４レーザ光照射による試料からの螢光を検出す
る螢光検出部が入射光軸面に対しある選択された
角度をもつて螢光を集光することを特徴とする特
許請求の範囲第１項及び第２項記載の微小粒子分
析装置。５試料にレーザ光を照射するレーザ照射光学部
にレーザ光束を任意の楕円形状に収束する二枚の
シリンドリカルレンズを十字に組合わせたことを
特徴とする特許請求の範囲第１項及び第２項記載
の微小粒子分析装置。６試料前にピンホールマスクを設置したことを
特徴とする特許請求の範囲第５項記載の微小粒子
分離装置。７試料と不活性液体をノズルから流出させる直
前に、温度調節手段を設けたことを特徴とする特
許請求の範囲第１項及び第２項記載の微小粒子分
析装置。８粒子計数器を備えたことを特徴とする特許請
求の範囲第１項及び第２項記載の微小粒子分析装
置。