JPH0235260B2 - - Google Patents
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- JPH0235260B2 JPH0235260B2 JP59223130A JP22313084A JPH0235260B2 JP H0235260 B2 JPH0235260 B2 JP H0235260B2 JP 59223130 A JP59223130 A JP 59223130A JP 22313084 A JP22313084 A JP 22313084A JP H0235260 B2 JPH0235260 B2 JP H0235260B2
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
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- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
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Description
産業上の利用分野
本発明は、低密度のリポ蛋白質（LDL）を測
定する方法及び試薬に関する。 従来の技術 LDL−フラクシヨン（低密度のリポ蛋白質）
（β−リポ蛋白質フラクシヨンとも呼ばれる）の
測定は、リピドの物質代謝障害の差別診断に重要
性を有する。 過コレステリン血症及び過トリグリセリド血症
によつて、アテローム性動脈硬化症及び心ぞう硬
塞の発生が促進される。それ故、血清中のコレス
テリン及びトリグリセリドの測定は、臨床化学上
の日常の実験室で最も屡々行われる試験に所属す
る。 脂肪の物質代謝に対する多くの検査は、トリグ
リセリド及びコレステリンの含量の変化を測定す
るだけでなく、リポ蛋白質の根底となる病理学的
変位も測定する場合に、個々の冠状弱体を十分に
とらえることができると結論される〔ミユンヘナ
ー・メデイチニツシエ・ボツヘンシユリフト
（Mu¨nchener Medizinische Wochenschrift）121
巻（1979年、1639頁〕。 公知血漿リポ蛋白質は種々の高成分の蛋白質
（アポリポ蛋白質）、ホスホリピド、コレステリン
及びトリグリセリドを含有する。これらは、その
挙動（異なる密度）に基づいて分析用の超遠心分
離機で及びその移動速度に基づいてゲルの電気泳
動で４つの異なる群に分けることができる： 乳糜脂粒 プリ−β−リポ蛋白質＝VLDL（著しい低密度の
リポ蛋白質） β−リポ蛋白質＝LDL（低密度のリポ蛋白質） α−リポ蛋白質＝HDL（高密度のリポ蛋白質） リポ蛋白質の作用の試験により、リポ蛋白質中
のLDLは決定的なアテローム成分であり、血液
中でそれが増加する場合には冠状心ぞう病の増大
した危険が存在することが判明した。この状態の
早期の発見及び処置は極めて重要である。それ
故、血清及び血漿中のLDL−濃度を定量的に測
定する実際的方法の必要が存在する。 従来LDL−コレステリン値を測定するために
は主として３つの方法が使用されたが、これらは
欠点を有する： (1) 超遠心分離 この方法は日常の実験室には不適当である。
それというのもこのためには特別の装置を必要
とし、その実施は超遠心分離で極めて慎重な操
作技術及び著しく長い時間（数日間の遠心分
離）を要する。それ故、従来この分析法は学術
医学用の実験室に保留されたのに過ぎない。 (2) 続くポリアニオンの沈殿によるリポ蛋白質バ
ンドの視覚化を有する電気泳動による分離及び
コレステリン値の混濁単位の換算。 しかしながらこの方法は時間がかかり、特別
の電気泳動装置並びに測定するための密度計を
必要とする〔ラボラトワル・メデイカル
（Laboratoire Medical）第１巻（1977年）、第
145頁〕。 (3) フリーデバルド（Friedewald）の式による
LDL−コレステリン値の測定〔クリニカル・
ケミストリー（Clinical Chemistry）第18巻
（1972年）、第499頁〕。 フリーデバルド（Friedewald）の式により
LDL−コレステリン値を計算するためには、
３つのパラメータの測定が必要である：試料の
コレステリン値、HDL−コレステリン値及び
トリグリセリド値。それ故この方法は全く実際
的ではない。更にこの式は、乳糜脂粒を含まな
い試料及びトリグリセリド値400mg／dl以下を
有する試料にあてはまるのに過ぎない。 (4) 沈殿反応 LDLをレクチンを用いて沈殿させる方法は、
ドイツ公開特許明細書第2857710号に記載され
ている。しかしながらこの方法では、LDL−
コレステリンの値は沈殿物を再び溶解した後に
初めてか又は沈殿前後のコレステリン値の差異
によつて測定することができるのに過ぎない。
これは著しい欠点である。 LDLが沈殿の上澄み中に存在するリポ蛋白質
の沈殿法は、ドイツ特許明細書第2600664号に記
載されている。しかしこの方法は、日常の測定法
としての使用には実際に使用することができな
い。それというのもリポ蛋白質の沈殿には、２工
程が必要だからである（２つの異なる因子−ポリ
エチレンイミン及びカチオン交換剤の添加は、間
にある培養相をともなう）。 発明が解決しようとする問題点 それ故、LDL−リポ蛋白質を測定するために、
大きい確実性及び分離性を有する簡単な方法及び
試薬による必要が存在する。ドイツ特許願
P3215310.4によれば、この問題は体液中の低密度
のリポ蛋白質（LDL）を測定する方法によつて
解決される。この方法は、検査すべき試料に高密
度のリポ蛋白質（HDL）−抗体を添加し、形成し
た不溶物を分離し、上澄みでLDL又はその成分
を測定することを特徴とする。 特に過リピド血症の、即ちVLDLを多く含む血
精で免疫沈殿物の形成を促進し、免疫錯体をなお
簡単で完全に遠心分離によつて除くことができる
場合に好ましいことが判明した。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、この目的は抗体にポリアニオ
ンと２価のカチオンとからなる混合物を添加する
ことによつて解決される。 本発明はポリアニオンと２価のカチオンとの混
合物の添加によつて抗体の性質は不利に影響され
ない驚異的な確認に基づく。更に従来はポリアミ
ンの添加によつて、VLDL及び他のリポ蛋白質フ
ラクシヨンの所望の沈殿だけではなく、測定すべ
きLDLの沈殿も惹起されることが恐れられてい
た。しかしながら、意外なことにも約150ｍモ
ル／よりも大きい塩の濃度で、迅速かつ完全な
リポ蛋白質−抗体−錯体の集合が、ポリアニオン
及び２価のカチオンの存在によつてLDLの共沈
殿が生じないで促進され、その遠心分離性が高め
られる。ポリアニオン、例えばテキストランサル
フエート、ヘパリン、燐タングステン酸及びポリ
ビニルサルフエート及び２価のカチオンの塩化
物、例えば塩化カルシウム、−マグネシウム及び
−マンガンの使用が有利なことが判明した。デキ
ストランサルフエートは高分子（分子量５×104
〜２×106）か又は短連鎖（分子量5000〜50000）
であつてもよい。抗体が共有結合によつてデキス
トランサルフエート又はヘパリンに結合している
のが特に好ましく、その際結合は常法によつて行
われ、こうして得られた共軛根は塩化カルシウ
ム、−マグネシウム又は−マンガンと一緒に試験
に使用する。 反応混合物中のポリアニオンの好ましい濃度範
囲は、高分子のデキストランサルフエートでは
0.1〜８ｇ／、短連鎖のデキストランサルフエ
ート及びヘプランでは１〜15ｇ／、ポリビニル
サルフエートでは0.2〜５ｇ／及び燐タングス
テン酸では0.3〜６ｇ／である。使用すべき２
価の金属イオンの濃度は、反応混合物中で好まし
くは10〜250ｍモル／である。更に反応混合物
は、好ましくは塩化ナトリウムを濃度0.1〜１モ
ル／で含有する。使用すべき緩衝剤としては、
PH範囲約6.5〜8.5の常用の緩衝液、常えばMES
（モルホリンエタンスルホン酸）、トリエタノール
アミン、MOPS（モルホリノプロパンスルホン
酸）、トリス−緩衝剤がこれに該当する。 抗体は、γ−グロブリン１〜100mg／mlに相応
する濃度で存在する。 試薬の上澄み中に残留するLDLーフラクシヨ
ンは、常法によつて測定することができる。好ま
しくはこの中に含まれた結合コレステリンの測定
は、公知方法を使用して行なう。このようにして
測定は、例えばアルコール性苛性カリでのけん化
及びリ−ベルマン・ブルチヤード（Liebermann
−Burchard）による化学的測定によつて行なう
ことができる。しかしながら好ましくは酵素によ
る測定を、コレステリンオキシダーゼ及びコレス
テリンエステルを分離する酵素及び酵素系、殊に
コレステリンエステラーゼを使用して行なう。最
後の方法を使用する場合には、消費した酵素、生
成したコレステノン又は最も好ましくは生成した
H2O2を公知方法によつて測定することができる。
結合したコレステリンの測定は公知であるので、
この点で詳説することは不必要である。しかしな
がら本発明方法の範囲内では、VLDL及び乳糜脂
粒のフラクシヨンを除去して、コレステノン又は
H2O2の光学的測定が色反応の範囲でさまたげら
れる。混濁の生成を阻止する。それ故この方法
は、特に比色によるコレステリンの測定法と連結
するのが適当である。 しかしながら、LDL−フラクシヨン中に含ま
れたコレステリン又は他のLDL−成分、例えば
アポリポ蛋白質Ｂ、ホスホリピド及びトリグリセ
リドの代りにLDL−フラクシヨンそれ自体を測
定することもでき、その際同じようにして公知方
法を使用することができる。例えば比濁法による
測定又はドイツ公開特許明細書第3007764号に記
載の混濁法による測定が挙げられる。 HDL−抗体は、本発明の範囲内では好ましく
は脱脂HDL−抗血清の形か又はこれから精製し
たHDL−抗体フラクシヨンの形で使用する。
HDL−抗体フラグメント、例えばFab−、Fab2
−及びFab′−フラグメントを使用することもで
きる。同じようにしてHDLのアポリポ蛋白質Ａ、
Ｃ又は／及びＥに対する抗体又はそのフラグメン
トを使用することができる。最後に、モノクロナ
ルHDL−抗体を使用することもできる。 本発明によつて使用した抗体の製造は、免疫原
として純粋のHDL又は前記アポリポ蛋白質の１
種を用いて行なう。このようにして得られた抗血
清はエーロジルで処理して脱リピドする；場合に
より続いて硫酸アンモニウムの分別によつてγ−
グロブリン−フラクシヨンを単離する。 抗体を得るためには、通常使用される動物を使
用することができる。好ましくは羊及び家うさぎ
を使用する。しかしながら抗体を得るためには、
既に挙げた動物又は比較される生物の外に細胞培
養物を使用することもできる。 HDL−抗体の添加で生成した免疫集合体の分
離は、同じようにして常法で行なうことができ
る。 溶解したHDL−抗体を使用する場合には、分
離は好ましくは遠心分離によつて行なう。担体に
結合した固定HDL−抗体を使用する場合には、
免疫集合体は緊密な固相、例えば抗体が被覆され
た固体から液相を簡単に分離することによつて分
離することができる。アポリポ蛋白質と共に免疫
原として得られた抗体を使用する場合には、好ま
しくは免疫原として使用したアポリポ蛋白質がリ
ピド被覆物を有するものを使用する。これは、例
えばアポリポ蛋白質の常用の脱リピド及び続く分
別の後に、選んだアポリポ蛋白質Ａ−、Ｃ−又
は／及びＥ−フラクシヨンを再びリピド化して得
ることができる。しかし好ましくは免疫原として
は、精製した完全なHDL−フラクシヨンを使用
する。精製は、好ましくは公知方法で遠心分離で
の単離によつて行なう。付加的に場合により更に
精製は、例えば固定コンカナバリン
（Concanavalin）Ａにより親和クロマトグラフイ
−又は電気泳動の方法によつて行なうことができ
る。これらの方法は公知であり、詳説は不必要で
ある。 本発明のもう１つの課題は、体液のLDL−フ
ラクシヨンを測定する試薬であり、これはHDL
−抗体を含有することを特徴とする。好ましい実
施形式では本発明による試薬は、既に挙げた
HDL−抗体又は前記方法で詳説したフラグメン
ト又は抗体又はHDL−成分のフラグメントと共
に、なおコレステリンを測定する試薬を含有す
る。 前種の好ましい試薬は、コレステリンオキシダ
ーゼ、コレステリンエステルを分解する酵素又は
酵素系、H2O2を測定する系及び界面活性剤を含
有する。 前記試薬の特に好ましい実施形式によれば、こ
れは主としてHDL−抗体、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、３，４−ジクロルフエノール、フエノー
ル、４−アミノフエナゾン、非イオン性清浄剤、
アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤（PH７〜
8.5）からなる。 本発明による試薬は、抗体を、測定液に対して
好ましくは10-7〜10-3モル／（又は固体1k）の
濃度範囲内で含有する。抗体は固体形（好ましく
は親液化）か又は溶液形で存在していてもよい。
溶剤としては、血清環境、緩衝剤、例えば0.01〜
0.5ｍのトリス緩衝剤（PH７〜8.5）又は0.01〜0.5
ｍのモルホリノプロパンスルホン酸（PH6.5〜
7.5）を、それぞれ0.15〜１ｍの食塩を添加して
使用することができる。抗体を固定形で使用する
場合には、適当な担体の例は、ポリサツカライ
ド、例えばセルロース、デキストラン、澱粉及び
その誘導体、珪酸塩、ポリアミド、コラーゲン、
ラテツクス、酸化アルミニウム、牛の血清アルブ
ミンその他である。抗体は試験容器、例えばプラ
スチツクの試薬ガラスの表面に結合して存在して
いてもよい。 本発明方法の重要な利点は、単独試薬の添加後
に試料からリポ蛋白質群−LDLを除く−を除去
することができ、続いて診断上重要なLDL−含
量又はLDL−フラクシヨンのコレステリン含量
を、他に試料の予処理をしないで直後に測定に使
えることである。更に好ましいのは、試料中で混
濁を惹起するトリグリセリドを多く含んだリポ蛋
白質群が除去されるので、続いてLDL又はコレ
ステリンを測定するために透明な試料を使用する
ことである。 実施例 例 １ (A) 精製HDLの製造。 VLDL及びLDLを超遠心分離機で分離した
後に、超遠心分離機中のHDL−フラクシヨン
（密度1.080〜1.210）を単離する〔スキプスキ
（V.P.Skipski）著：リピド・コンポジシヨ
ン・オブ・リポプロテインズ・イン・ノルマ
ル・アンド・デイジーズド・ステーツ：ブラ
ド・リピズ・アンド・リポプロテインズ：クア
ンテイテーシヨン・コンポジシヨン・アンド・
メタボリズム（Lipid composition of
lipoproteins in normal and diseased
states、：Blood Lipids and Lipoproteins：
Quantitation、Composition and
Metabolism）出版社：ネルソン（Nelson）、
ウイレイ（Wiley）、ニユーヨーク在、1972年、
471〜583頁のようにして〕。続いてフラクシヨ
ンをなお密度1.080〜1.210で２回沈殿又は浮遊
させる。 HDL−フラクシヨンを、固定コンカナバリ
ン（Concanavalin）Ａ〔フエブス・レター
（FebsLett.）91巻（1974年）174〜198頁〕を介
して親和クロマトグラフイ−によるか又はゲオ
ン・ペビコン・ブロツク（Geon−Pevicon−
Block）の電気泳動〔マレイ（R.W.Mahley）、
ホルコンベ（K.S.Holcombe）（1977年）、ジヤ
ーナル・オブ・リピド・リサーチ（Journal of
Lipid Research）18巻、314〜324頁による〕
を用いて電気泳動によつて精製する。 (B) 抗血清の製造。 動物の種類：羊及び家うさぎ。 (A)によつて得られた免疫原を用いて、次の免
疫図式を使用する：
定する方法及び試薬に関する。 従来の技術 LDL−フラクシヨン（低密度のリポ蛋白質）
（β−リポ蛋白質フラクシヨンとも呼ばれる）の
測定は、リピドの物質代謝障害の差別診断に重要
性を有する。 過コレステリン血症及び過トリグリセリド血症
によつて、アテローム性動脈硬化症及び心ぞう硬
塞の発生が促進される。それ故、血清中のコレス
テリン及びトリグリセリドの測定は、臨床化学上
の日常の実験室で最も屡々行われる試験に所属す
る。 脂肪の物質代謝に対する多くの検査は、トリグ
リセリド及びコレステリンの含量の変化を測定す
るだけでなく、リポ蛋白質の根底となる病理学的
変位も測定する場合に、個々の冠状弱体を十分に
とらえることができると結論される〔ミユンヘナ
ー・メデイチニツシエ・ボツヘンシユリフト
（Mu¨nchener Medizinische Wochenschrift）121
巻（1979年、1639頁〕。 公知血漿リポ蛋白質は種々の高成分の蛋白質
（アポリポ蛋白質）、ホスホリピド、コレステリン
及びトリグリセリドを含有する。これらは、その
挙動（異なる密度）に基づいて分析用の超遠心分
離機で及びその移動速度に基づいてゲルの電気泳
動で４つの異なる群に分けることができる： 乳糜脂粒 プリ−β−リポ蛋白質＝VLDL（著しい低密度の
リポ蛋白質） β−リポ蛋白質＝LDL（低密度のリポ蛋白質） α−リポ蛋白質＝HDL（高密度のリポ蛋白質） リポ蛋白質の作用の試験により、リポ蛋白質中
のLDLは決定的なアテローム成分であり、血液
中でそれが増加する場合には冠状心ぞう病の増大
した危険が存在することが判明した。この状態の
早期の発見及び処置は極めて重要である。それ
故、血清及び血漿中のLDL−濃度を定量的に測
定する実際的方法の必要が存在する。 従来LDL−コレステリン値を測定するために
は主として３つの方法が使用されたが、これらは
欠点を有する： (1) 超遠心分離 この方法は日常の実験室には不適当である。
それというのもこのためには特別の装置を必要
とし、その実施は超遠心分離で極めて慎重な操
作技術及び著しく長い時間（数日間の遠心分
離）を要する。それ故、従来この分析法は学術
医学用の実験室に保留されたのに過ぎない。 (2) 続くポリアニオンの沈殿によるリポ蛋白質バ
ンドの視覚化を有する電気泳動による分離及び
コレステリン値の混濁単位の換算。 しかしながらこの方法は時間がかかり、特別
の電気泳動装置並びに測定するための密度計を
必要とする〔ラボラトワル・メデイカル
（Laboratoire Medical）第１巻（1977年）、第
145頁〕。 (3) フリーデバルド（Friedewald）の式による
LDL−コレステリン値の測定〔クリニカル・
ケミストリー（Clinical Chemistry）第18巻
（1972年）、第499頁〕。 フリーデバルド（Friedewald）の式により
LDL−コレステリン値を計算するためには、
３つのパラメータの測定が必要である：試料の
コレステリン値、HDL−コレステリン値及び
トリグリセリド値。それ故この方法は全く実際
的ではない。更にこの式は、乳糜脂粒を含まな
い試料及びトリグリセリド値400mg／dl以下を
有する試料にあてはまるのに過ぎない。 (4) 沈殿反応 LDLをレクチンを用いて沈殿させる方法は、
ドイツ公開特許明細書第2857710号に記載され
ている。しかしながらこの方法では、LDL−
コレステリンの値は沈殿物を再び溶解した後に
初めてか又は沈殿前後のコレステリン値の差異
によつて測定することができるのに過ぎない。
これは著しい欠点である。 LDLが沈殿の上澄み中に存在するリポ蛋白質
の沈殿法は、ドイツ特許明細書第2600664号に記
載されている。しかしこの方法は、日常の測定法
としての使用には実際に使用することができな
い。それというのもリポ蛋白質の沈殿には、２工
程が必要だからである（２つの異なる因子−ポリ
エチレンイミン及びカチオン交換剤の添加は、間
にある培養相をともなう）。 発明が解決しようとする問題点 それ故、LDL−リポ蛋白質を測定するために、
大きい確実性及び分離性を有する簡単な方法及び
試薬による必要が存在する。ドイツ特許願
P3215310.4によれば、この問題は体液中の低密度
のリポ蛋白質（LDL）を測定する方法によつて
解決される。この方法は、検査すべき試料に高密
度のリポ蛋白質（HDL）−抗体を添加し、形成し
た不溶物を分離し、上澄みでLDL又はその成分
を測定することを特徴とする。 特に過リピド血症の、即ちVLDLを多く含む血
精で免疫沈殿物の形成を促進し、免疫錯体をなお
簡単で完全に遠心分離によつて除くことができる
場合に好ましいことが判明した。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、この目的は抗体にポリアニオ
ンと２価のカチオンとからなる混合物を添加する
ことによつて解決される。 本発明はポリアニオンと２価のカチオンとの混
合物の添加によつて抗体の性質は不利に影響され
ない驚異的な確認に基づく。更に従来はポリアミ
ンの添加によつて、VLDL及び他のリポ蛋白質フ
ラクシヨンの所望の沈殿だけではなく、測定すべ
きLDLの沈殿も惹起されることが恐れられてい
た。しかしながら、意外なことにも約150ｍモ
ル／よりも大きい塩の濃度で、迅速かつ完全な
リポ蛋白質−抗体−錯体の集合が、ポリアニオン
及び２価のカチオンの存在によつてLDLの共沈
殿が生じないで促進され、その遠心分離性が高め
られる。ポリアニオン、例えばテキストランサル
フエート、ヘパリン、燐タングステン酸及びポリ
ビニルサルフエート及び２価のカチオンの塩化
物、例えば塩化カルシウム、−マグネシウム及び
−マンガンの使用が有利なことが判明した。デキ
ストランサルフエートは高分子（分子量５×104
〜２×106）か又は短連鎖（分子量5000〜50000）
であつてもよい。抗体が共有結合によつてデキス
トランサルフエート又はヘパリンに結合している
のが特に好ましく、その際結合は常法によつて行
われ、こうして得られた共軛根は塩化カルシウ
ム、−マグネシウム又は−マンガンと一緒に試験
に使用する。 反応混合物中のポリアニオンの好ましい濃度範
囲は、高分子のデキストランサルフエートでは
0.1〜８ｇ／、短連鎖のデキストランサルフエ
ート及びヘプランでは１〜15ｇ／、ポリビニル
サルフエートでは0.2〜５ｇ／及び燐タングス
テン酸では0.3〜６ｇ／である。使用すべき２
価の金属イオンの濃度は、反応混合物中で好まし
くは10〜250ｍモル／である。更に反応混合物
は、好ましくは塩化ナトリウムを濃度0.1〜１モ
ル／で含有する。使用すべき緩衝剤としては、
PH範囲約6.5〜8.5の常用の緩衝液、常えばMES
（モルホリンエタンスルホン酸）、トリエタノール
アミン、MOPS（モルホリノプロパンスルホン
酸）、トリス−緩衝剤がこれに該当する。 抗体は、γ−グロブリン１〜100mg／mlに相応
する濃度で存在する。 試薬の上澄み中に残留するLDLーフラクシヨ
ンは、常法によつて測定することができる。好ま
しくはこの中に含まれた結合コレステリンの測定
は、公知方法を使用して行なう。このようにして
測定は、例えばアルコール性苛性カリでのけん化
及びリ−ベルマン・ブルチヤード（Liebermann
−Burchard）による化学的測定によつて行なう
ことができる。しかしながら好ましくは酵素によ
る測定を、コレステリンオキシダーゼ及びコレス
テリンエステルを分離する酵素及び酵素系、殊に
コレステリンエステラーゼを使用して行なう。最
後の方法を使用する場合には、消費した酵素、生
成したコレステノン又は最も好ましくは生成した
H2O2を公知方法によつて測定することができる。
結合したコレステリンの測定は公知であるので、
この点で詳説することは不必要である。しかしな
がら本発明方法の範囲内では、VLDL及び乳糜脂
粒のフラクシヨンを除去して、コレステノン又は
H2O2の光学的測定が色反応の範囲でさまたげら
れる。混濁の生成を阻止する。それ故この方法
は、特に比色によるコレステリンの測定法と連結
するのが適当である。 しかしながら、LDL−フラクシヨン中に含ま
れたコレステリン又は他のLDL−成分、例えば
アポリポ蛋白質Ｂ、ホスホリピド及びトリグリセ
リドの代りにLDL−フラクシヨンそれ自体を測
定することもでき、その際同じようにして公知方
法を使用することができる。例えば比濁法による
測定又はドイツ公開特許明細書第3007764号に記
載の混濁法による測定が挙げられる。 HDL−抗体は、本発明の範囲内では好ましく
は脱脂HDL−抗血清の形か又はこれから精製し
たHDL−抗体フラクシヨンの形で使用する。
HDL−抗体フラグメント、例えばFab−、Fab2
−及びFab′−フラグメントを使用することもで
きる。同じようにしてHDLのアポリポ蛋白質Ａ、
Ｃ又は／及びＥに対する抗体又はそのフラグメン
トを使用することができる。最後に、モノクロナ
ルHDL−抗体を使用することもできる。 本発明によつて使用した抗体の製造は、免疫原
として純粋のHDL又は前記アポリポ蛋白質の１
種を用いて行なう。このようにして得られた抗血
清はエーロジルで処理して脱リピドする；場合に
より続いて硫酸アンモニウムの分別によつてγ−
グロブリン−フラクシヨンを単離する。 抗体を得るためには、通常使用される動物を使
用することができる。好ましくは羊及び家うさぎ
を使用する。しかしながら抗体を得るためには、
既に挙げた動物又は比較される生物の外に細胞培
養物を使用することもできる。 HDL−抗体の添加で生成した免疫集合体の分
離は、同じようにして常法で行なうことができ
る。 溶解したHDL−抗体を使用する場合には、分
離は好ましくは遠心分離によつて行なう。担体に
結合した固定HDL−抗体を使用する場合には、
免疫集合体は緊密な固相、例えば抗体が被覆され
た固体から液相を簡単に分離することによつて分
離することができる。アポリポ蛋白質と共に免疫
原として得られた抗体を使用する場合には、好ま
しくは免疫原として使用したアポリポ蛋白質がリ
ピド被覆物を有するものを使用する。これは、例
えばアポリポ蛋白質の常用の脱リピド及び続く分
別の後に、選んだアポリポ蛋白質Ａ−、Ｃ−又
は／及びＥ−フラクシヨンを再びリピド化して得
ることができる。しかし好ましくは免疫原として
は、精製した完全なHDL−フラクシヨンを使用
する。精製は、好ましくは公知方法で遠心分離で
の単離によつて行なう。付加的に場合により更に
精製は、例えば固定コンカナバリン
（Concanavalin）Ａにより親和クロマトグラフイ
−又は電気泳動の方法によつて行なうことができ
る。これらの方法は公知であり、詳説は不必要で
ある。 本発明のもう１つの課題は、体液のLDL−フ
ラクシヨンを測定する試薬であり、これはHDL
−抗体を含有することを特徴とする。好ましい実
施形式では本発明による試薬は、既に挙げた
HDL−抗体又は前記方法で詳説したフラグメン
ト又は抗体又はHDL−成分のフラグメントと共
に、なおコレステリンを測定する試薬を含有す
る。 前種の好ましい試薬は、コレステリンオキシダ
ーゼ、コレステリンエステルを分解する酵素又は
酵素系、H2O2を測定する系及び界面活性剤を含
有する。 前記試薬の特に好ましい実施形式によれば、こ
れは主としてHDL−抗体、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、３，４−ジクロルフエノール、フエノー
ル、４−アミノフエナゾン、非イオン性清浄剤、
アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤（PH７〜
8.5）からなる。 本発明による試薬は、抗体を、測定液に対して
好ましくは10-7〜10-3モル／（又は固体1k）の
濃度範囲内で含有する。抗体は固体形（好ましく
は親液化）か又は溶液形で存在していてもよい。
溶剤としては、血清環境、緩衝剤、例えば0.01〜
0.5ｍのトリス緩衝剤（PH７〜8.5）又は0.01〜0.5
ｍのモルホリノプロパンスルホン酸（PH6.5〜
7.5）を、それぞれ0.15〜１ｍの食塩を添加して
使用することができる。抗体を固定形で使用する
場合には、適当な担体の例は、ポリサツカライ
ド、例えばセルロース、デキストラン、澱粉及び
その誘導体、珪酸塩、ポリアミド、コラーゲン、
ラテツクス、酸化アルミニウム、牛の血清アルブ
ミンその他である。抗体は試験容器、例えばプラ
スチツクの試薬ガラスの表面に結合して存在して
いてもよい。 本発明方法の重要な利点は、単独試薬の添加後
に試料からリポ蛋白質群−LDLを除く−を除去
することができ、続いて診断上重要なLDL−含
量又はLDL−フラクシヨンのコレステリン含量
を、他に試料の予処理をしないで直後に測定に使
えることである。更に好ましいのは、試料中で混
濁を惹起するトリグリセリドを多く含んだリポ蛋
白質群が除去されるので、続いてLDL又はコレ
ステリンを測定するために透明な試料を使用する
ことである。 実施例 例 １ (A) 精製HDLの製造。 VLDL及びLDLを超遠心分離機で分離した
後に、超遠心分離機中のHDL−フラクシヨン
（密度1.080〜1.210）を単離する〔スキプスキ
（V.P.Skipski）著：リピド・コンポジシヨ
ン・オブ・リポプロテインズ・イン・ノルマ
ル・アンド・デイジーズド・ステーツ：ブラ
ド・リピズ・アンド・リポプロテインズ：クア
ンテイテーシヨン・コンポジシヨン・アンド・
メタボリズム（Lipid composition of
lipoproteins in normal and diseased
states、：Blood Lipids and Lipoproteins：
Quantitation、Composition and
Metabolism）出版社：ネルソン（Nelson）、
ウイレイ（Wiley）、ニユーヨーク在、1972年、
471〜583頁のようにして〕。続いてフラクシヨ
ンをなお密度1.080〜1.210で２回沈殿又は浮遊
させる。 HDL−フラクシヨンを、固定コンカナバリ
ン（Concanavalin）Ａ〔フエブス・レター
（FebsLett.）91巻（1974年）174〜198頁〕を介
して親和クロマトグラフイ−によるか又はゲオ
ン・ペビコン・ブロツク（Geon−Pevicon−
Block）の電気泳動〔マレイ（R.W.Mahley）、
ホルコンベ（K.S.Holcombe）（1977年）、ジヤ
ーナル・オブ・リピド・リサーチ（Journal of
Lipid Research）18巻、314〜324頁による〕
を用いて電気泳動によつて精製する。 (B) 抗血清の製造。 動物の種類：羊及び家うさぎ。 (A)によつて得られた免疫原を用いて、次の免
疫図式を使用する：
【表】
(C) 抗−HDL−γ−グロブリン（脱リピド）の
製造。 粗血清１を、エーロジル380（デグツサ社
製）15ｇと室温で１時間撹拌し、続いて5000ｇ
で20分間遠心分離する。上澄みを、最終濃度
1.7モル／が得られるまで硫酸アンモニウム
を加え、２時間撹拌する。20000ｇで30分間遠
心分離した後に、沈殿物を、燐酸塩で緩衝（PH
7.4）した生理学的食塩水200mlに溶解し、透析
によつて硫酸アンモニウムを完全に分離する。
50000ｇで２時間遠心分離することによつて、
このようにして得られたγ−グロブリン−フラ
クシヨンから不溶の蛋白質を除去する。 例 ２ デキストランサルフエート（平均分子量
500000）１ｇ／、塩化ナトリウム0.3モル／、
塩化カルシウム50ｍモル／及び例１のようにし
て得られた抗−HDL−γ−グロブリン（脱リピ
ド）15mgを、トリス／HCL緩衝剤（PH8.0）0.1モ
ル／にとかした混合物0.4mlに、血清試料30μ
を添加する。室温で30分間培養後に、10000ｇで
２分間遠心分離する。デキストランサルフエート
及び塩化カルシウムを除いた相応する対照試験
を、相応する条件下に平行して行なつた。 透明な沈殿の上澄み300μに、トリス−緩衝
液（PH＝7.7）0.1モル／、アスパラギン酸マグ
ネシウム0.05モル／、アミノフエナゾン１ｍモ
ル／、フエノール６ｍモル／、３，４−ジク
ロルフエノール４ｍモル／、脂肪アルコールポ
リグリコールエーテル0.3％、コレステリンエス
テラーゼ400U／、コレステリンオキシダーゼ
250U／及びペルオキシダーゼ200U／を含有
する試薬２mlを加える。 室温で20分間培養後に、試薬の空試験値に対す
る試料の吸光を測定する。（試薬の空試験値は、
抗血清50μを含有し、抗血清のコレステリン含
量を考えに入れる）。 △Ｅ＝△E試料−△E試薬の空試験値 LDL−コレステリン（mg／dl）＝894×△Ｅ 次の結果が得られた：
製造。 粗血清１を、エーロジル380（デグツサ社
製）15ｇと室温で１時間撹拌し、続いて5000ｇ
で20分間遠心分離する。上澄みを、最終濃度
1.7モル／が得られるまで硫酸アンモニウム
を加え、２時間撹拌する。20000ｇで30分間遠
心分離した後に、沈殿物を、燐酸塩で緩衝（PH
7.4）した生理学的食塩水200mlに溶解し、透析
によつて硫酸アンモニウムを完全に分離する。
50000ｇで２時間遠心分離することによつて、
このようにして得られたγ−グロブリン−フラ
クシヨンから不溶の蛋白質を除去する。 例 ２ デキストランサルフエート（平均分子量
500000）１ｇ／、塩化ナトリウム0.3モル／、
塩化カルシウム50ｍモル／及び例１のようにし
て得られた抗−HDL−γ−グロブリン（脱リピ
ド）15mgを、トリス／HCL緩衝剤（PH8.0）0.1モ
ル／にとかした混合物0.4mlに、血清試料30μ
を添加する。室温で30分間培養後に、10000ｇで
２分間遠心分離する。デキストランサルフエート
及び塩化カルシウムを除いた相応する対照試験
を、相応する条件下に平行して行なつた。 透明な沈殿の上澄み300μに、トリス−緩衝
液（PH＝7.7）0.1モル／、アスパラギン酸マグ
ネシウム0.05モル／、アミノフエナゾン１ｍモ
ル／、フエノール６ｍモル／、３，４−ジク
ロルフエノール４ｍモル／、脂肪アルコールポ
リグリコールエーテル0.3％、コレステリンエス
テラーゼ400U／、コレステリンオキシダーゼ
250U／及びペルオキシダーゼ200U／を含有
する試薬２mlを加える。 室温で20分間培養後に、試薬の空試験値に対す
る試料の吸光を測定する。（試薬の空試験値は、
抗血清50μを含有し、抗血清のコレステリン含
量を考えに入れる）。 △Ｅ＝△E試料−△E試薬の空試験値 LDL−コレステリン（mg／dl）＝894×△Ｅ 次の結果が得られた：
【表】
比較し得る結果が、デキストランサルフエート
（分子量2000000）１ｇ／を用いて得られる。カ
ルシウムイオンの代りに、マグネシウムイオン又
はマンガンイオンを同濃度で使用することができ
る。好ましいのは、次の濃度範囲である：高分子
のデキストランサルフエート0.1〜８ｇ／、２
価のカチオン10〜25ｍモル／、塩化ナトリウム
0.2〜１モル／。 ＊対照法としては、NIH法が役立つ（VLDL
及び乳糜脂粒を超遠心分離機で分離した後に、
LDLを沈殿させる。沈殿前後のコレステリン値
の差異からLDL−コレステリンの値が得られ
る）。 マニユアル・オブ・ラボラトリー・オパレーシ
ヨンズ、リピド・リサーチ・クリニツクス・プロ
グラム、リピド・アンド・リポプロテイン・アナ
リシス（Manual of Laboratory Operations、
Lipid Research Clinics Program、Lipid and
Lipoprotein Analysis）DHEW出版、No.65〜
628。 例 ３ 短連鎖のデキストランサルフエート（平均分子
量5000）５ｇ／、塩化ナトリウム0.25モル／
、塩化カルシウム0.15モル／及び抗−HDL
−γ−グロブリン（脱リピド）15mgを、トリス／
HC緩衝剤（PH8.0）0.1モル／にとかした混
合物0.4mlに、血清試料30μを添加する。室温で
30分間培養後に、10000ｇで２分間遠心分離し、
上澄み中のコレステリン並びにトリグリセリドを
測定する。相応する対照試験を、平行して相応す
る条件下にデキストランサルフエート及びカルシ
ウムイオンを除いて行なつた。次の結果が得られ
た：
（分子量2000000）１ｇ／を用いて得られる。カ
ルシウムイオンの代りに、マグネシウムイオン又
はマンガンイオンを同濃度で使用することができ
る。好ましいのは、次の濃度範囲である：高分子
のデキストランサルフエート0.1〜８ｇ／、２
価のカチオン10〜25ｍモル／、塩化ナトリウム
0.2〜１モル／。 ＊対照法としては、NIH法が役立つ（VLDL
及び乳糜脂粒を超遠心分離機で分離した後に、
LDLを沈殿させる。沈殿前後のコレステリン値
の差異からLDL−コレステリンの値が得られ
る）。 マニユアル・オブ・ラボラトリー・オパレーシ
ヨンズ、リピド・リサーチ・クリニツクス・プロ
グラム、リピド・アンド・リポプロテイン・アナ
リシス（Manual of Laboratory Operations、
Lipid Research Clinics Program、Lipid and
Lipoprotein Analysis）DHEW出版、No.65〜
628。 例 ３ 短連鎖のデキストランサルフエート（平均分子
量5000）５ｇ／、塩化ナトリウム0.25モル／
、塩化カルシウム0.15モル／及び抗−HDL
−γ−グロブリン（脱リピド）15mgを、トリス／
HC緩衝剤（PH8.0）0.1モル／にとかした混
合物0.4mlに、血清試料30μを添加する。室温で
30分間培養後に、10000ｇで２分間遠心分離し、
上澄み中のコレステリン並びにトリグリセリドを
測定する。相応する対照試験を、平行して相応す
る条件下にデキストランサルフエート及びカルシ
ウムイオンを除いて行なつた。次の結果が得られ
た：
【表】
比較し得る結果が、デキストランサルフエート
（分子量15000）0.5ｇ／、ヘパリン0.8ｇ／は
ポリビニルサルフエート0.2ｇ／を用いて得ら
れる。カルシウムイオンの代りに、マグネシウム
イオン又はマンガンイオンを相応する濃度で使用
することもできる。好ましい濃度範囲は、次のも
のである：短連鎖のデキストランサルフエート又
はヘパリン１〜15ｇ／、ポリビニルサルフエー
ト0.2〜５ｇ／、２価のカチオン20〜250ｍモ
ル／、塩化ナトリウム0.15〜0.8モル／。 例 ４ 燐タングステン酸1.15ｇ／、塩化マグネシウ
ム20ｍモル／、塩化ナトリウム0.3モル／及
び抗−HDL−γ−グロブリン（脱リピド）15mg
の混合物0.4mlに、血清試料30μを添加する。室
温で30分間培養後に10000ｇで２分間遠心分離し、
上澄み中のコレステリン並びにトリグリセリドを
測定する。平行して対照試験を、デキストランサ
ルフエート及び塩化カルシウムを除いて行なつ
た。次の結果が得られた：
（分子量15000）0.5ｇ／、ヘパリン0.8ｇ／は
ポリビニルサルフエート0.2ｇ／を用いて得ら
れる。カルシウムイオンの代りに、マグネシウム
イオン又はマンガンイオンを相応する濃度で使用
することもできる。好ましい濃度範囲は、次のも
のである：短連鎖のデキストランサルフエート又
はヘパリン１〜15ｇ／、ポリビニルサルフエー
ト0.2〜５ｇ／、２価のカチオン20〜250ｍモ
ル／、塩化ナトリウム0.15〜0.8モル／。 例 ４ 燐タングステン酸1.15ｇ／、塩化マグネシウ
ム20ｍモル／、塩化ナトリウム0.3モル／及
び抗−HDL−γ−グロブリン（脱リピド）15mg
の混合物0.4mlに、血清試料30μを添加する。室
温で30分間培養後に10000ｇで２分間遠心分離し、
上澄み中のコレステリン並びにトリグリセリドを
測定する。平行して対照試験を、デキストランサ
ルフエート及び塩化カルシウムを除いて行なつ
た。次の結果が得られた：
【表】
好ましい濃度範囲は、次のものである：
燐タングステン酸0.3〜６ｇ／、マグネシウ
ムイオン10〜200ｍモル／。
ムイオン10〜200ｍモル／。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検査すべき試料に高密度のリポ蛋白質
（HDL）−抗体を添加し、形成した不溶物を分離
し、上澄みで低密度のリポ蛋白質（LDL）又は
その成分を測定して体液中の低密度のリポ蛋白質
（LDL）を測定する方法において、抗体にポリア
ニオンと２価のカチオンとからなる混合物を添加
することを特徴とする低密度のリポ蛋白質
（LDL）の測定法。 ２ ポリアニオンとしてデキストランサルフエー
ト、ヘパリン、燐タングステン酸又はポリビニル
サルフエート及び２価のカチオンとしてカルシウ
ム−、マグネシウム又はマンガンイオンを添加す
る、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ポリアニオンは反応混合物中に濃度0.1〜15
ｇ／で、２価のカチオンは濃度10〜250ｍモ
ル／で存在する、特許請求の範囲第１項又は第
２項記載の方法。 ４ 反応混合物中で濃度は、高分子のデキストラ
ンサルフエートでは0.1〜８ｇ／、短連鎖のデ
キストランサルフエートでは１〜15ｇ／、ヘパ
リンでは１〜15ｇ／、ポリビニルサルフエート
では0.2〜５ｇ／、燐タングステン酸では0.3〜
６ｇ／、２価のカチオンでは10〜250ｍモル／
である、特許請求の範囲第２項又は第３項記載
の方法。 ５ LDL−成分としてコレステリンを測定する、
特許請求の範囲第１項から第４項までのいずれか
１項記載の方法。 ６ 抗体は、脱脂HDL−抗血清の形でか又は精
製抗体フラクシヨンとして存在する、特許請求の
範囲第１項から第５項までのいずれか１項記載の
方法。 ７ HDL−抗体のフラグメントを使用する、特
許請求の範囲第１項から第６項までのいずれか１
項記載の方法。 ８ 免疫原として精製HDLと一緒に場合により
再リピド化アポリポ蛋白質Ａ、Ｃ又は／及びＥを
含有する抗体を使用する、特許請求の範囲第６項
又は第７項記載の方法。 ９ 羊又は家うさぎの抗体を使用する、特許請求
の範囲第１項から第８項までのいずれか１項記載
の方法。 １０ 抗体は共有結合によつてポリアニオンに結
合している、特許請求の範囲第１項から第９項ま
でのいずれか１項記載の方法。 １１ 高密度のリポ蛋白質（HDL）−抗体が、ポ
リアニオンと２価のカチオンとからなる混合物を
含有する、体液中の低密度のリポ蛋白質（IDL）
−フラクシヨンを測定する試薬。 １２ HDL−抗体をグロブリン１〜100mg／mlに
相応する濃度で、ポリアニオンを濃度0.1〜15
ｇ／で及び２価のカチオンを濃度10〜250ｍモ
ル／で含有する、特許請求の範囲第１１項記載
の試薬。 １３ コレステリンを測定する試薬を含有する、
特許請求の範囲第１１項又は第１２項記載の試
薬。 １４ コレステリンを測定するのにコレステリン
オキシダーゼ、コレステリンエステルを分解する
酵素又は酵素系、H2O2を測定する系及び界面活
性剤を含有する、特許請求の範囲第１３項記載の
試薬。 １５ 主としてHDL抗体、コレステリンオキシ
ダーゼ、コレステリンエステラーゼ、ペルオキシ
ダーゼ、３，４−ジクロルフエノール、フエノー
ル、４−アミノフエナゾン、非イオン性清浄剤、
アスパラギン酸マグネシウム及び緩衝剤（PH７〜
8.5）からなる、特許請求の範囲第１４項記載の
試薬。 １６ HDL−抗体を固定形で含有する、特許請
求の範囲第１１項から第１５項までのいずれか１
項記載の試薬。 １７ ポリアニオンと共有結合によつて結合して
いるHDL−抗体を含有する、特許請求の範囲第
１１項から第１６項までのいずれか１項記載の試
薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833338836 DE3338836A1 (de) | 1983-10-26 | 1983-10-26 | Verfahren zur bestimmung der low density lipoproteine (ldl) und reagenz zu seiner durchfuehrung |
| DE3338836.9 | 1983-10-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60173470A JPS60173470A (ja) | 1985-09-06 |
| JPH0235260B2 true JPH0235260B2 (ja) | 1990-08-09 |
Family
ID=6212769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59223130A Granted JPS60173470A (ja) | 1983-10-26 | 1984-10-25 | 低密度のリポ蛋白質を測定する方法及び試薬 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4746605A (ja) |
| EP (1) | EP0141343B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60173470A (ja) |
| AT (1) | ATE34848T1 (ja) |
| DE (2) | DE3338836A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62211554A (ja) * | 1986-03-12 | 1987-09-17 | Teijin Ltd | ヒトの肺表面活性物質の測定方法 |
| JPH0614041B2 (ja) * | 1985-09-18 | 1994-02-23 | 帝人株式会社 | 肺表面活性物質の検出方法及びそれに用いる試薬キツト |
| SE448324B (sv) * | 1985-09-27 | 1987-02-09 | Pharmacia Ab | Sett vid immunkemisk bestemning av lipoproteiner och apolipoproteiner |
| DE3751182T2 (de) * | 1986-08-06 | 1995-10-26 | Scripps Clinic Res | Monoklonale Antikörper, B-spezifisch für Apolipoprotein, die von zwei Hybridomen erzeugt werden. |
| DE3636851A1 (de) * | 1986-10-29 | 1988-05-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und reagenz zur spezifischen bestimmung des cholesterins der hdl-fraktion |
| NL8602869A (nl) * | 1986-11-12 | 1988-06-01 | Univ Utrecht | Werkwijze voor het aantonen, identificeren en/of kwantificeren van circulerende immuuncomplexen in bloedserum. |
| US5057226A (en) * | 1988-05-18 | 1991-10-15 | Cobe Laboratories, Inc. | Treatment of liquid including blood components |
| US4968432A (en) * | 1988-05-18 | 1990-11-06 | Cobe Laboratories, Inc. | Treatment of liquid including blood components |
| DE3817747A1 (de) * | 1988-05-25 | 1989-11-30 | Johannes Dr Med Aufenanger | Verfahren zum bestimmen der relativen mengen aller cholesterinhaltigen lipoproteine in koerperfluessigkeiten |
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