JPH0241313B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、特殊な結合手段を用いることなく、
直接吸着剤に吸着させた固定化プロテアーゼを用
いてきわめて容易にカードを調製する方法に関す
るものである。 一般に、チーズの製造にあたり、牛乳やヤギ乳
等の獣乳中のタンパク質を凝固（すなわち、凝
乳）させて、凝固タンパク質（カード）を得るこ
とは重要な工程のひとつであり、その凝乳には、
本来レンニン（生後１〜４週間の仔牛の第４胃よ
り分必される凝乳酵素）を必要としている。とこ
ろが、近年、チーズの生産量が大幅に増大する一
方で、肉牛の世界的な不足から、肉用牛の需要が
増大して、レンニン採取用の仔牛が著しく減少し
て、深刻なレンニン不足になつてきている。 そこで、仔牛レンニンに代り得る凝乳酵素（レ
ンネツト）が広く探索されてムコール・レンネツ
トなどの微生物の生産した、いわゆる微生物レン
ネツトが登場し、現在では、この微生物レンネツ
トあるいは、微生物レンネツトとペプシンなどの
プロテアーゼ混合物が、実用されている凝乳酵素
の大半を占めるようになつている。 しかし、仔牛レンニンは凝乳の鍵となるカツパ
ーカゼイン（ｋ−カゼイン）に対して極めて基質
特異性の高いプロテアーゼであり、他のカゼイン
成分（αs−，β−カゼイン）に対してはほとん
ど分解力を持たない特徴を有している。 これに対し、微生物レンネツトや他の代用酵素
では、ｋ−カゼイン以外のカゼインについても、
多少の分解力を持つため、これらの代用酵素を使
用した場合には、カードの回収率が低く、でき上
がつたチーズの風味が劣る（β−カゼインの分解
によつて、苦味が発生したり、テクスチヤーが変
化する）などの点で、仔牛レンニンよりも劣ると
いう欠点がある。この点が、他の多くのプロテア
ーゼが凝乳活性は持つものの同時に持つ強い加水
分解活性のために凝乳酵素となり得ない理由であ
り、そのため、現在、遺伝子工業的技術を駆使し
て仔牛レンニンのクローン化などの試みが盛んに
成されているのである。 換言するならば、レンニン以外の多くのプロテ
アーゼ類も、凝乳の引き金になるｋ−カゼインの
分解を比較的速かに行い、ミルクを凝乳させるこ
とはできる。しかし、他の多くのプロテアーゼは
仔牛レンニンに比較して、広い基質特異性を持つ
ものがほとんどであるから、カードの主成分であ
る他のカゼイン（αs−，β−カゼイン）をも加
水分解してしまい、カードの回収率を低下させ、
でき上がつたチーズを劣化させてしまう。即ち、
β−カゼイン量がカードの固さを支配しており、
β−カゼインが分解されると柔弱なチーズとな
り、β−カゼインの分解産物である一部のペプタ
イドに苦味を呈し、カードの品質を劣化させてし
まうのである。 また別の方向として、仔牛レンニンをくり返し
て、あるいは連続して使用して、コストの低減化
や作業の合理化をしようとする試みも為されてい
る。それは、仔牛レンニンを適当な担体に固定化
する固定化レンニンの試みである。この場合、多
くの固定化法のうち、共有結合法やイオン吸着法
と架橋法との併用法が用いられているが、固定化
の際に操作が繁雑であつたり、食品への応用とし
て不適当な試薬を使用したり酵素の失活を招き易
いものであり、加えて、使用中での失活などいく
つかの欠点があり、未だ実用的な段階には至つて
いない状態である。 また、他の凝集性タンパク質の代表的な例とし
て豆乳がある。豆乳を凝固させれば、豆腐が得ら
れるわけだが、これも、固定化プロテアーゼによ
つて製造できる。 従来豆腐は熱い豆乳に凝固剤であるニガリ（カ
ルシウム塩など）を加えたり、一度冷却後の豆乳
にグルコノデルタラクトンを加えて加熱したりし
て凝固させている。 これに対して固定化プロテアーゼを使用するな
らば、先の様な凝固剤の入らない豆腐ができる。 本発明者らは、すぐれた固定化プロテアーゼを
作成することができるなら、レンニンをくり返し
て使用できるばかりでなく、仔牛レンニンの代用
として、ムコールレンネツトばかりでなく、多く
の加水分解力の強いプロテアーゼでも凝乳酵素と
して使用できるのではないかとの想定のもとに鋭
意研究した結果、プロテアーゼを水性溶媒中で多
孔性の吸着剤に直接接触させ、吸着させることに
よつてすぐれた固定化プロテアーゼを得ることに
成功したのである。 本発明は、この知見をもとに完成されたもの
で、疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤に水
性溶媒中でプロテアーゼを接触させ、吸着させて
なる固定化プロテアーゼの獣乳、脱脂獣乳、もし
くは凝集性蛋白性物質を接触させることにより、
凝固させてカードを得ることを特徴とするカード
の調製法である。 本発明で用いる固定化プロテアーゼのための吸
着剤は、疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤
であるが、その例としてスチレン系合成吸着剤で
あるHP−10、20、21、30、40、50（三菱化成工
業(株)製）やメタクリル酸エステル系合成吸着剤
HP−2MG（三菱化成工業(株)製）もしくは多孔性
ガラスビーズ（コーニング、グラス、ワーカー
社、フジ、デヴイソン、ケミカルズ社）などがあ
げられる。 吸着させるプロテアーゼは、所謂プロテアーゼ
系酵素であればいずれでもよいが、例えば、レン
ニン、ペプシン、トリプシン、パパイン、麹菌ア
ルカリプロテアーゼ、放線菌プロテアーゼ等があ
げられる。 吸着に際しては、各酵素を水性溶媒中で、吸着
剤に吸着させる。一般的には、レンニン、ペプシ
ン、トリプシン、パパイン、麹菌アルカリプロテ
アーゼ、放線菌プロテアーゼなどを水に溶解し、
吸着剤に接触させる。また、これら酵素は優先的
に吸着剤に吸着させる傾向があるので、各酵素含
有液であれば、そのまま吸着処理することができ
る。例えば、生醤油は麹菌アルカリプロテアーゼ
を多量に含んでいるので、この生醤油をそのまま
吸着剤と接触させて、麹菌アルカリプロテアーゼ
を吸着した吸着剤すなわち固定化酵素を得ること
ができる。レンニンの場合は、仔牛から得た粗レ
ンニン含有液を吸着剤と接触させれば、固定化レ
ンニンが得られる。 これら酵素は単一でもよいが、複合させても吸
着させることができる。例えば、凝乳酵素群とし
て、レンニンとムコールレンネツトを適宜混合し
て水溶液とし、これに吸着剤を接触させ、同時に
レンネツトとムコールレンネツトを吸着した吸着
剤すなわち複合固定化酵素を得ることができる。
更に、より速く凝乳させる場合は、これらに酸性
プロテアーゼを加え、三つの酵素を同時に吸着さ
せることも可能である。 プロテアーゼを吸着させるには、プロテアーゼ
含有水性溶媒と吸着剤を接触させるだけでよい。
この吸着の方式は主に物理的な吸着力に基くもの
と考えられ、固定化法としては最も温和な条件で
あり、かつ、まつたく簡単な操作、すなわち、単
に酵素溶液と合成吸着剤とを接触させてやりさえ
すればよいものである。具体的には、吸着剤をつ
めたカラムにプロテアーゼ溶液を通液させたり、
プロテアーゼ溶液を入れた容器に吸着剤を投入
し、ゆつくり攪拌したりして、固定化プロテアー
ゼを得ることができる。 吸着剤へのプロテアーゼの吸着は、各酵素の失
活が起らない温度、例えば45℃以下で行なわれ、
かつ広いPHの範囲、例えばPH４〜10で行なわれ、
しかもイオン強度に関係なく行なうことができ
る。そして得られた固定化プロテアーゼは使用し
ても容易に脱離することのない、きわめて安定な
ものである。 本発明においては、ここに得られる固定化プロ
テアーゼと獣乳、脱脂獣乳、もしくは凝集性蛋白
性物質とを接触させることにより凝集カードがき
わめて容易に、しかもきわめて高品質で得られる
ものである。カードの回収率は、たとえばレンニ
ンを用いる従来法によるのと同等もしくはそれ以
上のものとすることができ、またカードの蛋白質
の状態もレンニンを使用したものとほぼ同等の品
質のものとすることができる。 凝集させるものは、獣乳例えば牛乳、ヤギ乳、
ヒツジ乳やこれらから脱脂した各脱脂乳、更にこ
れらから分離された各種カゼイン、これらから再
生された再生乳、再生脱脂乳、更には豆乳などの
植物性蛋白質含有乳状物等など凝集する蛋白性物
であればいずれでも使用することができる。 凝集処理に際しては、これら獣乳等をそのま
ま、もしくは希釈して、固定化プロテアーゼと接
触させられる。接触は、獣乳等を入れた容器に、
固定化プロテアーゼを入れた金網カゴなどを短時
間浸漬したり、固定化プロテアーゼを入れた容器
に短時間獣乳等を注入し、取り出すバツチ式によ
るのもよく、また、固定化プロテアーゼをつめた
カラムに連続的に獣乳等を通液させる連続式によ
るものでもよい。 接触条件は、常温、加温、冷却のいずれでもよ
く、また接触時間は酵素量によつて異なつてくる
ので、あらかじめ求めるカードの質によつて酵素
量を決めておいて、それに応じて接触時間を決め
るのが好ましい。 接触が終了した獣乳等は、放置もしくは加温し
たりすることによつて凝集を起し、バツチ式もし
くは連続的にカードを得ることができる。 このように、本発明法は、固定化したプロテア
ーゼを用いるもので、単に乳の流量を変える等の
ことで、凝乳反応を適宜コントロールできるの
で、目的に応じた好ましいカードを調製すること
ができ、また、高品質で高価なレンニンを長期に
わたり使用することができ、しかも均質なカード
を製造できるものである。 次に、本発明の実験例及び実施例を示すが、こ
こに用いる測定法等は次の通りである。 凝乳活性の測定法 0.012％のCaCl₂を含むスキムミルク10％
（0.05M酢酸緩衝液でPH5.8に調整）溶液を基質と
して用い、35℃に保温した基質10mlに酵素液10ml
を添加し、カードのフラグメントが生じる時間
（秒）を測定した。（凝集活性は酵素200mg、凝乳
時間40分（2400秒）を基準単位としている）この
時間をｔとすると、凝乳活性は次式で表わされ
る。 凝乳活性＝2400／ｔ×（200mg／添加酵素（mg）
） 固定化酵素の活性は吸着剤に添加した酵素の活
性量から吸着せずに流出した酵素の活性量を差し
引いたもので表した。 カードタンパク質の回収率： 凝乳によつて生じたカードをろ紙過して、充
分水洗した後キエルダール法でＴ−Ｎを求め、ま
た基質スキムミルク溶液10mlに、TCA混液
（0.11Mトリクロル酢酸、0.22M酢酸ナトリウム、
0.33M酢酸を含む溶液）を10ml加え生じたカード
のＴ−Ｎ（全窒素）を100％としてカードタンパク
質の回収率を求めた。 カードのSDS−電気泳動： 凝乳によつて生じたカードをろ紙過し、充分
水洗した後、少量を試験管にとり、これにSDS−
Ｂ−緩衝液（２％、SDS、50％グリセロール、
0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.2）、３％２
−メルカプトエタノールを含む溶液）0.5mlを加
えて、100℃、５分間でSDS化した。サンプル量
は泳動カラム一本当り、約100μｇのタンパク質
量になるように加え、常法通り泳動させた。 豆乳の凝集活性の測定 常法により、調製した豆乳を遠心分離して、オ
カラ残渣を除く、これを基質（Ｔ−Ｎ、0.56％）
として、固定化プロテアーゼに作用させ、凝乳活
性の場合と同様に、凝集までの時間を測定した。 実験例 １ プロテアーゼ６種類（麹菌アルカリプロテア
ーゼ、仔牛レンニン、ペプシン、トリプシ
ンプロナーゼ（科研化学(株)製、商品名）プロ
トリクイフアーゼ（上田化学(株)製、商品名））の
凝乳性について検討した。 凝乳時間が約５分になるように濃度を調整した
酵素溶液を基質スキムミルクに加えて20時間放置
後得られたカードタンパク質の回収率を表−１に
示す。さらに、得られたカードのSDS電気泳動パ
ターンを第１図に示す。第１図では麹菌アルカ
リプロテアーゼは仔牛レンニンはペプシン、
はトリプシンはプロトリクイフアーゼに由来
するカードのSDS電気泳動パターンである。

【表】

【表】 表−１から、ここで検討した６種の酵素には活
性に大小はあるもののいづれも凝乳活性が認めら
れた。また、カードタンパク質の回収率も酵素に
よつて異るが、いづれも30％以上の回収率が得ら
れることが判つた。 第１図において、図の右方が高分子タンパク
質、左方が低分子タンパク質であるからレンニン
から得られたタンパク質に比べ、溶液状態での
各プロテアーゼから得られたタンパク質は、より
低分子化されて（パターンが左寄り）おり、過分
解されていることが判る。 実験例 ２ 実験例１で用いた６種の酵素を各種の吸着剤に
吸着させ、固定化酵素を調整した。すなわち、多
孔性の吸着剤HP−20、30及び2MG（いずれも三
菱化成工業(株)製、商品名）を各々15mlづつカラム
（φ：10×200mm）に充填し、水に溶解した酵素約
200mgを室温で通過させ吸着剤に吸着させ、固定
化酵素カラムを得た。ここで得た固定化酵素に水
を通したところ、流出液は凝集活性を示さず、固
定化プロテアーゼが調製されたことが判つた。こ
の時、固定化された酵素活性は表−２に示した。

【表】 ここに得られた固定化プロテアーゼに、基質ス
キムミルク溶液を室温で約10ml／分の速さで通過
させ、流出液を試験管に取り、直ちに35℃の恒温
槽に入れ凝乳時間を測定した。 また、凝乳後20時間放置し、カードタンパク質
の回収率をみた。これらの結果は次表−３に示さ
れる。

【表】 さらに、カードの過分解の有無を確認するた
め、更に20時間放置しその時得られたカードのタ
ンパク質のSDS−電気泳動パターンを第２図及び
第３図に示した。 第２図で、はTCAカードタンパク質（トリ
クロル酢酸による沈殿カードタンパク質：対照）
′はHP−20吸着麹菌アルカリプロテアーゼ、
′はHP−20吸着レンニン、′はHP−20吸着
ペプシン、′はHP−20吸着トリプシン、′は
HP−20吸着プロナーゼ、′はHP−20吸着プロ
トリクイフアーゼによるカードタンパク質の
S′DS′電気泳動パターンを示す。また、第３図に
おいて″はHP−2MG吸着麹菌アルカリプロテ
アーゼ、″はHP−2MG吸着レンニン、″は
HP−2MG吸着ペプシン、″はHP−2MG吸着
トリプシン、″はHP−2MG吸着プロナーゼ、
″はHP−2MG吸着プロトリクイフアーゼによ
るカードタンパク質のパターンを示す。 実験例１、２から判るように本発明によつてプ
ロテアーゼを固定化することにより、カードタン
パク質の回収率を上げることができ、また、第２
図及び第３図から（HP−30に固定化した場合も
同様な結果で図は省略した）わかるように、固定
化することにより各プロテアーゼによつて凝乳さ
れたカードタンパク質がTCAカードタンパク質
あるいは固定化レンニンのものとほとんど変
わらず、カードタンパク質の過分解が防止される
という効果を奏することがわかる。 本発明に係る固定化プロテアーゼがカードの製
造に有効であるその理論的根拠の詳細は、今後の
研究にまたねばならないが一応のところ、疎水性
の結合力を有する多孔性の固定化担体にプロテア
ーゼを固定化することにより、α、β−カゼイン
の分解性に変化が生じた可能性が考えられるもの
の、推定の域を出ない。 実施例 １ 合成吸着剤HP−2MG約５mlをカラム（φ10×
60mm）に充填しこれに黄麹菌フスマ麹から硫安分
画、セフアデツクスＧ−25、バイオ−ゲルＰ−
150のゲル過させて得たアルカリプロテアーゼ
画分（未精製）約0.25ｇの水溶液を室温で通過さ
せ、充分水洗して固定化プロテアーゼとしカラム
温度を30℃に保つた。 これに10％スキムミルク溶液を室温で10ml／分
の流速で通過させ、流出液を20mlづつ集めた。 これらの分画した流出液は直ちに35℃の恒温槽
に移し、凝乳時間及びその時得られたカードタン
パク質の回収率を表−４に示した。

【表】 実施例 ２ 合成吸着剤HP−20約５mlをカラム（φ10×60
mm）に充填し、これに仔牛レンニン（デイフコ・
ラボラトリー社製、米国）約1.25ｇの水溶液を室
温で通過させ固定化レンニンとし、カラム温度を
30℃に保ち、10％スキムミルク溶液を10ml／分の
流速で通過させ流出液を20mlづつ集めた。 これらの分画した流出液を直ちに35℃の恒温槽
に移し、凝乳時間及びその時得られたカードタン
パク質の回収を表−５に示した。

【表】 実施例 ３ 多孔性合成吸着剤HP−40約10mlをカラム
（φ10×120mm）に充填し、これに麹菌アルカリプ
ロテアーゼであるアマノ−Ｐ（天野製薬(株)社商品
名）約0.1グラムの水溶液を通過させ、固定化プ
ロテアーゼを得る。 次いで、常温で、豆乳を20ml／minの両速でカ
ラムを通過させ処理液を20mlづつ集め、ただちに
これを35℃恒温槽に移し、凝集までの時間を測定
した。結果は表−６に表した。

【表】 また、その後同様に豆乳を通過させ処理液100
mlを得、これを50mlづつに分けて未加熱及び80℃
30分加熱したもののカードタンパク質量を求め、
酵素を固定化していないHP−40を通過させた
後、TCAで沈殿させたカードタンパク質を100％
として表−７に示した。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１において、溶液プロテアーゼ
によつて得られた各カードのSDS−電気泳動パタ
ーンを示す図である。第２図は実験例２におい
て、HP−20吸着プロテアーゼによつて得られた
各カードのSDS−電気泳動パターンを示す図であ
る。第３図は実験例２において、HP−2MG吸着
プロテアーゼによつて得られた各カードのSDS−
電気泳動パターンを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤に水
   性溶媒中でプロテアーゼを接触させ、吸着させて
   なる固定化プロテアーゼに獣乳、脱脂獣乳、もし
   くは凝集性蛋白性物質を接触させることにより、
   凝固させてカードを得ることを特徴とするカード
   の調製法。 ２ プロテアーゼが、レンニン、ペプシン、トリ
   プシン、パパイン、麹菌アルカリプロテアーゼ、
   放線菌プロテアーゼなどのプロテアーゼ系酵素か
   らなる群から選択されてなる特許請求の範囲第１
   項記載のカードの調製法。 ３ 疎水性の結合力を有する多孔性の吸着剤がス
   チレン系合成吸着剤又はメタクリル酸エステル系
   合成吸着剤又は多孔性ガラスビーズである特許請
   求の範囲第１項記載のカードの調製法。 ４ 獣乳、脱脂獣乳が牛乳、脱脂牛乳である特許
   請求の範囲第１項記載のカード調製法。 ５ 凝集性蛋白性物質が豆乳である特許請求の範
   囲第１項記載のカード調製法。