【発明の詳細な説明】
本発明はヒト起原性のα−インターフエロンを
工業的規模において収率よくかつ簡易な操作で精
製・回収するα−インターフエロンの製法に関す
る。
インターフエロンはウイルスその他の物質の刺
激によりヒトを含む動物細胞から産出されるある
種の糖蛋白質である。このものはウイルスや細菌
又は原虫の細胞内増殖を阻止する機能をもつてい
るが、この機能は動物種に特異的であることか
ら、医薬としてヒトに用いる場合はヒトの細胞か
ら産生されたインターフエロンを得る必要があ
る。ヒトのインターフエロンを大量に得るために
は、ヒトリンパ球、ヒト繊維芽細胞又はヒト株化
リンパ芽球等を大量に集め、これらの細胞に適当
な刺激を与えてインターフエロンを産生させ、産
生されたインターフエロンを収率よく回収しなけ
ればならない。しかし従来の回収法は複雑な操作
と長い時間を要しており、工業的規模で行うには
不適なだけでなく、収率も低いという欠点があつ
た。
インターフエロンを精製、回収する先行技術と
しては、ヨードイオンあるいはチオシアン酸イオ
ンを遊離させる水溶性の塩を用いる分画法（特公
昭43−16061号）、弱酸性および弱塩基性イオン交
換体を用いるカラムクロマトグラフイーとゲル
過を組み合わせた精製法（特公昭51−34442号）、
強酸性陽イオン交換体による分画法（特開昭54−
89011号）、および多孔性ガラスビーズによる精製
法（特開昭52−145516号）等が知られている。
本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法を改良
したもので、特に、公知の方法における回収率の
低さ（50％以下）に着目し、この問題点を解決す
ることによつて本発明を完成した。すなわち従来
のチオシアン酸塩分画法は夾雑物を沈澱させ、こ
の沈澱を除去することによつてインターフエロン
を精製しているが、インターフエロンの分別効果
が十分でなく、インターフエロンが沈澱中へ混入
するので、回収率が低かつた。又チオシアン酸塩
をインターフエロンの沈澱剤として高濃度に用い
た場合にも、生成した沈澱からのインターフエロ
ンの抽出回収が困難であるため十分な結果が得ら
れなかつた。
本発明はヒト起原性α−インターフエロン（以
下、「α−インターフエロン」を単に「インター
フエロン」とも言う）を含有する粗インターフエ
ロン液をチオシアン酸塩によつて分画するに際
し、チオシアン酸塩を添加して長時間にわたり低
温下に保持し、生成した沈澱を分取し、これに60
〜100％のエタノール溶液を混合してインターフ
エロンを抽出するのである。
本発明においてヒト起原性インターフエロンを
含有する粗インターフエロン液とは、たとえばヒ
ト由来細胞からインターフエロンを誘発・産生さ
せて得られるもののほか、硫安分画法、イオン交
換吸着法、ベントナイト吸着法等を用いて粗イン
ターフエロン液を部分精製したものをいう。
ヒト由来細胞からインターフエロンを誘発・産
生させて粗インターフエロン液を得るには、公知
のインターフエロン産生法〔シンポジア シリー
ズ イン イムノ バイオロジカル スタンダー
デイゼーシヨン（Symposia Series in Immuno
Bielogical Standardization）第14巻、17〜23
頁、1970年〕を使用する。ヒト由来細胞も白血
球、リンパ球、腹腔、肺、脾の細胞のような網内
系細胞、培養ヒトリンパ芽球様細胞等あらゆる公
知のインターフエロン産生細胞を利用できるが、
好ましいものは産生能等の点からヒト白血球およ
び培養ヒトリンパ芽球様細胞であり、培養ヒトリ
ンパ芽球様細胞としては特にナマルバ株が好まし
い（J.Clim.Microbiol.1、116〜117、1974年）。
なお粗インターフエロン液として遺伝子工学の手
法によりヒト由来のインターフエロン遺伝子を大
腸菌に投入し、培養後その大腸菌が生産するイン
ターフエロンを精製する際に得られる粗インター
フエロン液を用いてもよい。また細胞融合の技術
によりヒト由来のインターフエロン産生細胞と温
血動物由来細胞を融合し、培養後その融合細胞が
生産するインターフエロンを精製する際に得られ
る粗インターフエロン液を用いてもよい。
本発明は粗インターフエロン液を過した後、
その液にチオシアン酸塩を最終濃度が約0.1〜
5.0Mになるように添加する。添加後、溶液のPH
を酸性側（PH２〜６）に調整し、２〜10℃の低温
で20〜30時間保持する。次に生成してくるインタ
ーフエロンを含む沈澱を遠心分離により回収し、
この沈澱にエタノール溶液を混合して抽出操作を
行なう。
エタノール溶液は水や有機溶媒を混合して60〜
100％濃度に調整したものを用いる。有機溶媒は
たとえばアセトンを用い、エタノールとアセトン
の混合比を１：0.1〜0.6にする。エタノール溶液
の添加量はチオシアン酸塩による分画前の粗イン
ターフエロン液の１／７〜１／２容量である。抽
出操作時の温度は０〜−30℃である。抽出を終つ
たエタノール溶液は３〜10℃で10〜60分間遠心分
離（2000〜10000rpm）を行ない、生じた沈澱を
除去して上清を回収する。
得られたインターフエロン含有の上清は要すれ
ば公知のイオン交換吸着法、ゲル過法あるいは
チオシアン酸塩による沈澱分画法等を行なつて高
度精製する。又PHを変えて分画してもよい。この
ようにして得た精製インターフエロンは安定剤を
添加したのち、医薬品製造の常法に従つて脱塩透
折、除菌過、分注したのち、凍結乾燥を行なつ
て乾燥製剤とする。
本発明はチオシアン酸塩を用いる分画法である
から、硫安分画法に比較して透折等の工程が簡略
となり、工業的規模の製法として好適である。本
発明によるとき得られたインターフエロンの比活
性は粗インターフエロン液に対して５〜100倍に
上昇しており、粗インターフエロン液からの回収
率はほぼ100％あり、これは従来の50％以下の値
からみて驚くべき回収率である。
本発明を実施例によつて詳細に説明するが、本
発明はこの実施例に限定されるものではない。ま
た実施例においてインターフエロンの活性値とし
て示した国際単位（IU）は、プラツク半減法あ
るいはCPE抑制法により国際ヒトインターフエ
ロン標準品MRC69／19を対照として求めたもの
である（最新医学、第29巻、第４号、660頁、
1974年）。
実施例 １
粗インターフエロン液５を塩酸にてPH２に調
整し、２日間４℃に放置してインデユーサとして
用いたセンダイウイルスを不活化し、この粗イン
ターフエロン液を遠心分離して上清を集める。集
めた上清を5Nの水酸化ナトリウムによりPH３に
調整し、これにチオシアン酸カリウムを終濃度
0.4Mになるように添加して撹拌し、４℃にて一
夜保存して沈澱を生成させる。次に溶液を４℃で
40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を分取し、
この沈澱にエタノールとアセトンを９：１に混合
したエタノール溶液１を加えて溶解させ、再び
４℃で40分間遠心分離（4000rpm）して沈澱を除
去し、上清を回収する。
この上清を予め0.1Mの酢酸緩衝液（PH３）で
平衡化したSP−セフアデツクス−25（フアルマシ
ア社製）により、イオン交換カラムクロマトグラ
フイーを行ない、吸着したインターフエロンを
0.1Mのリン酸２ナトリウム液（PH８）で溶出す
る。溶出液をガラスフイルターに通して液を集
め、塩酸で液のPHを7.4に調整したのち、室温
で30分間遠心分離（10000rpm）を行なう。続い
て0.15Mのリン酸加生理食塩水（PH7.4）で平衡
化したセフアデツクスＧ−100（フアルマシア社
製）のカラム（直径1.5cm×高さ60cm）を用い、
溶出液の遠心上清を3.8ml／時の流速で流下させ
てゲル過を行ない、精製インターフエロン画分
を得る。
その比活性は2.55×107IU／mg蛋白、回収率は
89％、精製度は950倍であつた。
実施例 ２
粗インターフエロン液50に終濃度0.5Mにな
るようにチオシアン酸カリウムを添加し、PH3.8
に調整した後、４℃で一夜保存して沈澱を生成さ
せる。次に４℃で30分間遠心分離（3000rpm）し
て沈澱を分取し、この沈澱に94％エタノール溶液
を加え溶解させ、再び４℃で30分間遠心分離
（3000rpm）して沈澱を除去し、上清10を回収
する。
この上清に含まれる精製インターフエロン画分
の比活性は7.5×104IU／mg蛋白、回収率は100％、
精製度は10倍であつた。
実験例
比活性2.5×104IU／mg蛋白の粗インターフエロ
ン液を用い、チオシアン酸カリウム沈澱からイン
ターフエロンを抽出する溶媒の適性を比較した。
抽出処理は実施例２に準じて行ない、94％エタ
ノール溶液のほか種々の抽出溶媒を用いてインタ
ーフエロンを抽出し、その精製度と回収率を調べ
た。その結果を第１表に示す。この実験結果から
エタノール溶液はインターフエロンの抽出に特異
的に有効であることが判る。
【表】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a method for producing α-interferon, which purifies and recovers α-interferon of human origin in high yield and with simple operations on an industrial scale. Interferon is a type of glycoprotein produced by animal cells, including humans, upon stimulation by viruses and other substances. This substance has the function of inhibiting the intracellular proliferation of viruses, bacteria, or protozoa, but since this function is specific to animal species, when used as a medicine for humans, it is necessary to use an interferon produced from human cells. I need to get Elon. In order to obtain a large amount of human interferon, a large number of human lymphocytes, human fibroblasts, human lymphoblast cell lines, etc. are collected, and appropriate stimulation is given to these cells to produce interferon. The interferon must be recovered in good yield. However, conventional recovery methods require complicated operations and take a long time, making them not only unsuitable for use on an industrial scale, but also having the disadvantage of low yields. Prior art techniques for purifying and recovering interferon include a fractionation method using water-soluble salts that liberate iodo ions or thiocyanate ions (Japanese Patent Publication No. 16061/1983), and using weakly acidic and weakly basic ion exchangers. Purification method combining column chromatography and gel filtration (Special Publication No. 51-34442)
Fractionation method using a strongly acidic cation exchanger
89011) and a purification method using porous glass beads (Japanese Unexamined Patent Publication No. 145516/1989). The present invention is an improvement on the fractionation method using thiocyanate, and focuses particularly on the low recovery rate (50% or less) in known methods, and the present invention has been developed by solving this problem. completed. In other words, in the conventional thiocyanate fractionation method, interferon is purified by precipitating impurities and removing this precipitate, but the effect of separating interferon is not sufficient and interferon is mixed into the precipitate. Therefore, the recovery rate was low. Furthermore, even when thiocyanate was used at a high concentration as a precipitant for interferon, satisfactory results could not be obtained because it was difficult to extract and recover interferon from the precipitate formed. The present invention uses thiocyanic acid when fractionating a crude interferon solution containing human-origin α-interferon (hereinafter "α-interferon" is also simply referred to as "interferon") using thiocyanate. Salt is added and kept at low temperature for a long period of time, and the precipitate formed is collected and added to it for 60 minutes.
Interferon is extracted by mixing ~100% ethanol solution. In the present invention, the crude interferon solution containing interferon of human origin refers to, for example, one obtained by inducing and producing interferon from human-derived cells, as well as one obtained by ammonium sulfate fractionation method, ion exchange adsorption method, bentonite adsorption method. This refers to partially purified crude interferon liquid using methods such as In order to obtain a crude interferon solution by inducing and producing interferon from human-derived cells, a known interferon production method [Symposia Series in Immuno Biological Standardization] is used.
Biological Standardization) Volume 14, 17-23
Page, 1970]. As human-derived cells, all known interferon-producing cells can be used, such as leukocytes, lymphocytes, reticuloendothelial cells such as peritoneal cavity, lung, and spleen cells, and cultured human lymphoblastoid cells.
Preferred are human leukocytes and cultured human lymphoblastoid cells from the viewpoint of productivity, etc., and Namalva strain is particularly preferred as cultured human lymphoblastoid cells (J.Clim.Microbiol.1, 116-117, 1974). .
Note that a crude interferon solution obtained by injecting a human-derived interferon gene into E. coli using genetic engineering techniques and purifying the interferon produced by the E. coli after culturing may be used as the crude interferon solution. Alternatively, a crude interferon solution obtained by fusing human-derived interferon-producing cells and warm-blooded animal-derived cells by cell fusion technology and purifying interferon produced by the fused cells after culturing may be used. In the present invention, after passing the crude interferon liquid,
Add thiocyanate to the solution to a final concentration of approximately 0.1~
Add to 5.0M. After addition, the pH of the solution
Adjust to the acidic side (PH2-6) and hold at a low temperature of 2-10°C for 20-30 hours. Next, the resulting precipitate containing interferon is collected by centrifugation,
An ethanol solution is mixed with this precipitate to perform an extraction operation. Ethanol solution is made by mixing water and organic solvent to 60~
Use one adjusted to 100% concentration. For example, acetone is used as the organic solvent, and the mixing ratio of ethanol and acetone is set to 1:0.1 to 0.6. The amount of ethanol solution added is 1/7 to 1/2 volume of the crude interferon solution before fractionation with thiocyanate. The temperature during the extraction operation is 0 to -30°C. After the extraction, the ethanol solution is centrifuged (2,000 to 10,000 rpm) at 3 to 10°C for 10 to 60 minutes, the resulting precipitate is removed, and the supernatant is recovered. The obtained interferon-containing supernatant is highly purified, if necessary, by a known ion exchange adsorption method, gel filtration method, or precipitation fractionation method using thiocyanate. Alternatively, fractionation may be performed by changing the pH. After adding a stabilizer to the thus obtained purified interferon, it is desalted, diafiltrated, sterilized, and dispensed according to conventional pharmaceutical manufacturing methods, and then freeze-dried to obtain a dry preparation. Since the present invention is a fractionation method using thiocyanate, the steps such as diafiltration are simpler than the ammonium sulfate fractionation method, and it is suitable as an industrial-scale production method. The specific activity of the interferon obtained according to the present invention is 5 to 100 times higher than that of the crude interferon solution, and the recovery rate from the crude interferon solution is almost 100%, which is 50% compared to the conventional method. This is a surprising recovery rate considering the values below. The present invention will be explained in detail by way of Examples, but the present invention is not limited to these Examples. In addition, the international unit (IU) shown as the activity value of interferon in the examples was determined using the international human interferon standard MRC69/19 as a control using the Plack halving method or CPE inhibition method (Modern Medicine, Vol. 29). Volume, No. 4, 660 pages,
(1974). Example 1 The crude interferon solution 5 was adjusted to pH 2 with hydrochloric acid, left at 4°C for 2 days to inactivate the Sendai virus used as an inducer, and the crude interferon solution was centrifuged to collect the supernatant. . The collected supernatant was adjusted to pH 3 with 5N sodium hydroxide, and potassium thiocyanate was added to the final concentration.
Add to 0.4M, stir, and store at 4°C overnight to form a precipitate. Then the solution was heated to 4°C.
Centrifuge for 40 minutes (4000 rpm) and collect the precipitate.
Ethanol solution 1, which is a 9:1 mixture of ethanol and acetone, is added to the precipitate to dissolve it, and the precipitate is removed by centrifugation (4000 rpm) at 4° C. for 40 minutes again, and the supernatant is collected. This supernatant was subjected to ion exchange column chromatography using SP-Sephadex-25 (manufactured by Pharmacia), which had been equilibrated with 0.1M acetate buffer (PH3), to remove the adsorbed interferon.
Elute with 0.1M disodium phosphate solution (PH8). Pass the eluate through a glass filter, collect the solution, adjust the pH of the solution to 7.4 with hydrochloric acid, and then centrifuge (10,000 rpm) at room temperature for 30 minutes. Next, using a Sephadex G-100 (manufactured by Pharmacia) column (diameter 1.5 cm x height 60 cm) equilibrated with 0.15 M phosphoric acid saline (PH 7.4),
The centrifuged supernatant of the eluate is passed down at a flow rate of 3.8 ml/hour to perform gel filtration to obtain a purified interferon fraction. Its specific activity is 2.55×10 7 IU/mg protein, and the recovery rate is
The purity was 89%, 950 times higher. Example 2 Potassium thiocyanate was added to crude interferon solution 50 to give a final concentration of 0.5M, and the pH was adjusted to 3.8.
After adjusting the temperature, it is stored at 4°C overnight to form a precipitate. Next, centrifuge at 4°C for 30 minutes (3000 rpm) to separate the precipitate, add 94% ethanol solution to this precipitate to dissolve it, centrifuge again at 4°C for 30 minutes (3000 rpm) to remove the precipitate, Collect supernatant 10. The specific activity of the purified interferon fraction contained in this supernatant is 7.5 × 10 4 IU/mg protein, and the recovery rate is 100%.
The degree of purification was 10 times higher. Experimental Example A crude interferon solution with a specific activity of 2.5×10 4 IU/mg protein was used to compare the suitability of solvents for extracting interferon from potassium thiocyanate precipitate. The extraction process was carried out according to Example 2, and interferon was extracted using various extraction solvents in addition to 94% ethanol solution, and its purity and recovery rate were examined. The results are shown in Table 1. This experimental result shows that the ethanol solution is specifically effective for extracting interferon. 【table】