JPH0244513B2 - Biseibutsuseikintainokoteikaho - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物生菌体の固定化法に係り、特に
ポリビニルアルコールと微生物生菌体とを含む懸
濁水溶液を凍結・成型後、真空脱水（乾燥）する
ことにより生成するゲル中に微生物生菌体を固定
化する方法に関する。 ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、
アルギン酸、カラゲナン、寒天等に微生物生菌体
を固定化（捕捉、包括）する方法が既に公知であ
るが、下記(1)〜(8)に要約するとおり、いずれにも
難点があり、更に優れた固定化法の開発が望まれ
てきた。 (1) ポリビニルアルコール水溶液に微生物生菌体
を混合後、風乾して、微生物生菌体含有膜を得
る方法があるが、この膜は、耐水性に劣り、軟
弱で、また微生物捕捉容量も低い。この膜をナ
イロン布等により支持（捕強）する提案もある
が、上記の難点の大部分は依然として解消され
ない。また、ポリビニルアルコール・フイルム
の特色として、微生物の活動に要する炭素源、
窒素源、無機物等の透過性に乏しいことに因
り、固定化微生物生菌体の活性が減退する（特
開昭52−145592、特公昭55−35415、プラスチ
ツク材料講度14、P.135、P.133（昭45）、日刊工
業新聞社）。 (2) ポリビニルアルコール水溶液と微生物または
酵素とを混合後、酸素を排除してコバルト60
（γ線）を照射するポリビニルアルコール架
橋・ゲル化法も周知である。しかし、この場
合、グリセリン等の放射線障害保護物質を併用
しても、なお微生物または酵素への悪影響をを
まぬがれず、照射経費もかさむほか、得られる
ゲルが軟弱で、しばしば、他の化学試薬による
２次的硬化処理を要する（Biotech.Bioeng.、
15、607（1973）、醗酵と工業、35、92（1977））。 (3) ポリビニルアルコール水溶液へホウ酸または
ホウ酸水溶液を加えると即座にゲル化すること
は古くから周知であり、この原理を利用する微
生物または酵素の固定化法も、もちろん試みら
れた。しかし、けん化度の高いポリビニルアル
コールから生成するゲルは軟弱で、成型し難
い。けん化度の低いポリビニルアルコールを用
いることにより、この難点は若干改善される
が、粘着性ゲルであるため、例えば、裁断片等
の成型品はいずれも、その形状を保持し難い
（特開昭54−135295、特公昭55−51552）。 (4) ポリビニルアルコール、テトラエチルシリケ
ートおよび微生物を含む懸濁水溶液に酸を加え
風乾することによるポリビニルアルコール・ケ
イ酸複合酵母膜の製法も提案されたが、やは
り、この膜も軟弱である。 この場合、酸を加えた後、凍結・乾燥して
も、生成する膜の機械的強度はかえつて低下
し、ほとんど成型不能である。 いずれにしても、微生物の懸濁液へ酸を加え
てPH３以下に調整する工程が含まれており、微
生物への悪影響もしばしば無視できない（特公
昭55−11311、特公昭55−30358）。 (5) ポリビニルアルコールと酵素とを溶解した水
溶液を低温ゲル化（凍結・固化）させることに
よる酵素の固定化法も提案されている（特開昭
50−52296）。しかし、単なる凍結・固化処理に
より生成するがゲルは弾性を示さず、引張り強
度、圧縮強度ともきわめて低い。また凍結・固
化・融解後に風乾した場合には、前記(1)の場合
と同様の軟弱なフイルムが得られるにすぎな
い。 なお、捻結・固化・融解後に減圧脱水を試み
る場合は、融解液の泡だちが激しく、しばしば
操作続行不能の状態をきたすほか、たとえば長
時間を費し、脱水しても、ほとんど弾性を示さ
ない。しかもかなりもろい白濁ゲルが生成する
にすぎず、その含水性も低い。 (6) アクリルアミド、Ｎ，N′−メチレンビスア
クリルアミドおよび微生物生菌体の混合懸濁中
溶液を脱酸素後、ここへ放射線を照射するかラ
ジカル発生剤を添加することによる固定化法も
著名であるが、得られるゲル中の残留モノマー
が猛毒であることもよく知られており、この残
留モノヤー及び放射線またはラジカルなどによ
る微生物生菌体への損傷が著しいうえ、ゲルの
機械的強度が低いため、２次的硬化処理をしば
しば必要とする（Biotech.Bioeng.、20、1264
（1978））。 (7) アルギン酸ナトリウムと微生物生菌体との混
合懸濁水溶液に、カルシウム・イオンまたはア
ルミンニウム・イオンを作用させ（ゲル化さ
せ）る固定化法も著名であるが、このゲルは、
機械的強度（特に耐圧縮強度）に難があるう
え、しばしば微生物生菌体の培地成分に供され
るリン酸二水素カリウム緩衝液（PH７）に侵さ
れ、破壊される（Biotech.Bioeng.、19、387
（1977））。 (8) 上記のアルギン酸塩（ポリ−１，４−β−Ｄ
−マンノウロン酸塩）と同じく、天然産の多糖
類の代表例として、ローカスト・ビーン・ガム
（Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース系）、ペク
チン（ポリ−１，４−α−Ｄ−ガラクトウロン
酸系）、寒天（ポリガラクトースの酸性硫酸エ
ステル）、カラゲナン（同じく、ポリガラクト
ースの酸性硫酸エステルなどが挙げられ、もち
ろんこれらについても、前記のアルギン酸塩同
様、やはり微生物生菌体固定化用担体としての
試みが多数提案されている。しかし、これら天
然産多糖類から得られるゲルに共通する難点と
して、機械的強度が十分でない事実が挙げら
れ、しばしば、補助的（２次的）硬化処理を要
する。また、多糖類水溶液は、しばしば常温で
固化（ゲル化）する場合があり、微生物生菌体
と混合するにあたり、これを40〜50℃以上に加
熱しなければならず、多くの微生物生菌体に著
しい傷害を与える。また、前記の補助的（２次
的）硬化処理工程においても、、例えば50℃以
上に加熱するか、化学試薬、溶媒等を使用する
ことによる微生物生菌体への損傷を伴なう。ま
た、天然産物にしばしば見受けられるように、
これらは、産地により、あるいは収穫時期等に
より、その品質が必ずしも一定しない例もあ
り、化学組成、化学構造等にも不明の点が多
い。 寒天は、古くから微生物生菌体の固定化（培
養担体）に用いられており、化学構造上、これ
に最も類似するカラゲナンも、当然のことなが
ら微生物生菌体の担体として提案され、やはり
寒天に類似の機能を果すことが確認されてい
る。しかし、これらの多糖類についても上述の
難点は例外ではなく、更に優れた担体の開発が
望まれている（Enzyme Microb.Technol.、
１、95（1979）、高分子、29、238（1980））。 本発明者等は、従来技術の欠点を克服すべく検
討した結果、ポリビニルアルコールと微生物生菌
体を含む懸濁水溶液から、弾力性に富む高含水性
のゲルが得られ、このゲル中に微生物生菌体をな
んらの損傷を伴なうことなくほぼ完全に包括（捕
捉）できることを見出し、効果の顕著な本発明を
完成した。 既ち本発明は、けん化度が95モル％以上で、粘
度平均重合度が1500以上のポリビニルアルコール
の水溶液に微生物生菌体を添加して得られる懸濁
水溶液を、任意形状の容器または成型用鋳型に注
入し、これを−６℃より低い温度で凍結・成型
し、しかる後、この成型体を、融解させることな
く脱水率5wt％以上に真空乾燥し、必要に応じ水
中に浸漬することを特徴とする微生物生菌体の固
定化法を提供するものである。 本発明によれば、ポリビニルアルコールと、微
生物生菌体の混合懸濁液を凍結・成型・乾燥する
過程でゲルが生成し、しかも微生物生菌体のほぼ
全量が、このゲル中に包括（捕捉）される。本発
明では、この固定化過程で、酸、アルカリ、放射
線、ラジカル発生剤、有機溶媒、反応試薬などを
全く用いず、また２次的硬化処理も必要としない
ことから、微生物は、ほとんど損傷を受けず（も
ちろん死滅をまぬがれ）、生菌体として捕捉され、
微生物生菌体本来の活性がそのまま保持される。 反応性試薬またはγ線等を用いる従来の微生物
固定化法においては、しばしば、微生物の全量ま
たはその大半が死滅する。 本発明では、微生物生菌体に対して、γ線や化
学試薬（または反応溶媒）による損傷を与えるこ
とがなく、これらを固定化することができる。 本発明の固定化用担体（ゲル）は、含水性に富
み、また、微生物生菌体の活動に要する炭素源、
窒素源、酸素ガス、二酸化炭素ガスその他の無機
物の透過性にも優れるゴム状の弾性体であるう
え、機械的強度の点でも優れている。 ポリビニルアルコールの水溶液を０〜30℃で１
日〜１週間貯蔵することにより、粘度上昇あるい
はゲル化の現象がしばしば見受けられることは、
古くから周知である。しかし、このゲルは、前記
天然産多糖類のゲルにしばしば見られるとおり、
例えば寒天のように軟弱であり、しかも、単り激
しくかきまぜるか、水を加えてかきまぜるか、あ
るいは若干温めることにより溶解する。一方、本
発明のゲルは、水または温水に不溶で、上記の公
知のゲルとは全く異なる。このことは、本発明
が、公知のポリビニルアルコール水溶液のゲル
化、あるいは前述のポリビニルアルコール水溶液
の化学的処理によるゲル化などに関する従来の知
見とは全く異なる新規なゲルを提供するものであ
ることを物語つている。 本発明に用いるポリビニルアルコールのけん化
度は、95モル％以上、好ましくは97モル％以上を
要する。けん化度80〜88モル％、特に85モル％以
下のポリビニルアルコールを用いても、軟弱なゲ
ルが得られるにすぎず、本発明の目的は達成され
ない。 また、本発明では、粘度平均重合度1500以上の
ポリビニルアルコールを用いる。ポリビニルアル
コールの重合度が低下すると共に、得られるゲル
の機械的強度も低下するため、本発明では、通常
市販されている高重合度品（重合度1700〜2600程
度）を用いるのが良い。 本発明では、まずポリビニルアルコールの水溶
液を調合する。その濃度に特に制限はないが、例
えば１〜20wt％、好ましくは７〜15wt％とする
ことができる。この濃度を更に例えば90wt％ま
で高めることもできるが、常温における水溶液の
粘度が10000cP以上にも達し、また、貯蔵中に粘
度上昇あるいはゲル化をきたすこともあり、若干
取扱い難い。この濃度を3wt％以下とすることも
できるが、後述の脱水（乾燥）所要時間が長び
き、経費（脱水動力費）がかさむ。 本発明においては、上記ポリビニルアルコール
水溶液へ微生物生菌体を添加するに先立ち、ポリ
ビニルアルコール水溶液を滅菌する。滅菌処理条
件としては、100℃×5minで目的を達する場合も
あるが、耐熱性菌に汚染されている場合は、120
℃×15min〜6hの高圧・蒸気滅菌を施す。紫外線
照射滅菌法も使用できるが、その有効性が照射表
面に限られることから、前記の加熱滅菌法と併用
するのが望ましい。いずれにしても、これらの処
理により、本発明に用いる資材が変質することは
なく、本発明の実施になんら支障をきたさない。 滅菌された水溶液は、次に、固定化対象とする
微生物生菌体と混合される。微生物生菌体として
は、アスペルギルス属、リゾプス属、シユードモ
ナス属、アセトバクター属、ストレプトマイセス
属、エシエリシア属、サツカロマイセス属、カン
デイダ属等のかび（すなわち糸状菌）、放線菌、
細菌、酵母、藻類など多くの微生物生菌体を対象
とすることができる。この場合、凍結乾燥保存し
た生菌体、生菌体の増殖培養液、あるいは増殖培
養液から遠心分離された生菌体濃縮懸濁液などの
いずれを用いることもできる。この微生物生菌体
の添加（混合）操作は、10〜35℃程度で行なうの
が至便であるが、耐熱性生菌体を固定する場合に
は、それぞれの耐熱性に応じ、35℃以上で操作す
ることもできる。10℃以下では水溶性の粘度が上
昇し、生菌体の混合・分散が緩慢であるが、この
点に留意するならば、上記操作を10℃以下で実施
することも差支えない。 微生物生菌体の添加量（乾燥体基準）としては
は水溶液中のポリビニルアルコールの７倍重量以
下にとどめるのが、微生物生菌体のほぼ全量を固
定化する観点から好ましく、この場合、後述の乾
燥（ゲル化）工程を経ることにより、微生物生菌
体の96〜98％を確実に捕捉（包括・固定化）でき
る。後述する凍結・成型・乾燥工程を経て得らる
ゲルを走査型電子顕微鏡により観察した結果、ゲ
ル内部は多孔質であり、固相（冷水、温水に不溶
のポリビニルアルコール）と液相（微生物生菌体
懸濁水）とが複雑に入り組み、迷水路網の状態と
推察された。水路の幅は1/2〜100μｍ程度にわた
り、複雑に連続蛇行する。したがつて、この連続
蛇行水路内に微生物生菌体（１〜10μｍ）を多少
とも捕捉した後は、この水相へ培養液（栄養培
地）を浸透させることにより、当然のことなが
ら、微生物生菌体を増殖させることができる。本
発明で得られるゲルには、このような内部構造上
の利点があるため、微生物生菌体の添加量（当初
固定化量）に制限はなく、例えば、ポリビニルア
ルコール濃度の1/1000〜７培の範囲で任意に選択
できる。 本発明では、このようにして得たポリビニルア
ルコール微生物生菌体の混合懸濁水溶液へ雑菌が
混入しないよう留意し、しかも殺菌燈（紫外線）
が直接照射されぬよう留意しつつ、懸濁水溶液を
任意形状の容器または所望の成型用鋳型へ注入
し、凍結・成型する。この場合、冷却剤として
は、例えば、食塩−氷（23：77）（−21℃）、塩化
カルシウム−氷（30：70）（−55℃）などの寒剤、
あるいはドライアイス−メチルアルコール（−72
℃）、液体窒素（−196℃）などを用い、−６℃よ
り低い温度に冷却し、凍結させる。冷却が不十分
であると、後述する乾燥工程を経て得られるゲル
の形状が、当初予期した形態すなわち、ポリビニ
ルアルコール水溶液注入容器または成型用鋳型の
形状と合致し難いほか、サルの機械的強度に劣
る。液体ヘリウムを用いれば、−269℃まで冷却で
きるが、不経済であるうえ、ゲルの品位に利点は
なく、実用上はフレオン冷凍機を用い、例えば−
20℃以下、さらには−35℃以下に冷却するのが良
い。微生物生菌体の多くは、−20〜−30℃近辺の
温度に長時間さらされると好ましくないことか
ら、むしろ−30℃以下、例えば−35〜−80℃まで
急速に冷却するのが良い。このような低温で凍
結・成型することは、微生物生菌体担持用ゲルの
機械的強度を高めることに寄与し、−20℃と−６
℃との間の温度で凍結・成型するより好ましい。 本発明による凍結・成型においては、ポリビニ
ルアルコール水溶液は任意の形状の鋳型内で固化
（氷結）・成型され、しかる後、鋳型の上面カバー
または下面カバー（あるいはその双方）取りはず
し、成型体の形状を保持しつつ凍結・乾燥するこ
とができる。凍結・成型時の冷却速度としては、
前述の微生物生菌体への影響を考慮して、−10℃
程度までは0.1〜７℃／min程度の緩漫冷却でも
差支えないが、その後は、７〜1000℃／minの急
速冷却が好ましい。 本発明においては、前述の容器または鋳型へ注
入されたポリビニルアルコールと微生物生菌体と
の混合懸濁水溶液が凍結されたことを確認後、こ
れに真空乾燥を施す。この場合、冷凍室から凍
結・成型体を取り出し、これを真空乾燥室へ移
し、直ちに吸引・脱水するならば、水分の除去
（昇華）に伴ない、試料が冷却されるので、特に
外部冷却を施さなくとも凍結・成型体が融解する
ことはない。凍結・成型体が融解しない程度に加
熱することは差支えなく、これにより脱水を促進
することができる。つまり、脱水工程の温度とし
ては、凍結・成型体を融解させないかぎり、特に
制限はなく、これがゲルの品位に特に影響するこ
とはない。この脱水工程においては、脱水率を
5wt％以上とし、たとえばゲルの含水率を20〜
92wt％に到達させる。含水率を20％以下とする
こともできる。 本発明においては、ポリビニルアルコールの濃
度のいかんにかかわらず、凍結・成型体に若干の
脱水処理（真空乾燥）を施す。この場合、脱水率
としては、5wt％さらには15wt％以上が採用され
る。すなわち、脱水が進行するとともに、ゲル強
度が著しく高まることから、所望のゲル強度に応
じ、脱水量を選定するのが良い。 この脱水工程（凍結・乾燥）を省略することは
できない。すなわち、これを実施しないかぎり、
本発明の弾性に富む、しかも機械的強度の優れた
高含水性ゲルは得られず、したがつて、固定化微
生物生菌体ゲルはきわめて軟弱である。また、凍
結状態を維持することなく、凍結・成型体を融解
後、減圧・脱水する方式によるときは、泡立ちが
激しく、ほとんど、操作続行不可能であるうえ、
たとえ長時間を費して脱水しても、弾性の乏しい
白濁ゲルが生成するにすぎない。 次に、凍結・成型・乾燥体を、例えば常温放置
し、融解（解凍）させることにより、弾性に富む
微生物固定化ゲルが得られる。この場合の融解操
作としては、１〜３℃／minの緩漫昇温のほか、
微生物生菌体の耐熱性を考慮したうえで、場合に
よつては３〜1000℃／minの急速昇温によること
もできる。いずれにしても、60℃以上では、ゲル
の表面に硬質皮膜が急速に生じることから、微生
物生菌体の耐熱性のいかんにかからず、解凍（融
解）操作温度としては40〜50℃以下が望ましい。
この解凍操作後、容器または鋳型の支持部から、
微生物固定化ゲルを容易に取り出すことができ
る。このゲルは水中で呼水し、含水率50〜95wt
％（湿潤体基準）に達するが、なお強固な弾性体
であるため、ゲル内に包括された微生物の生育・
活動に好適である。前述の走査型電子顕微鏡によ
る知見ならびに、上記の含水率（50〜95wt％）
から明らかなとおり、ゲルの内部の大半を空孔
（水相）が占めている。このゲルの含水率は、例
えば、こんにやく（含水率約97wt％、多糖類湿
潤ゲル）には及ばないが、生体細胞、人間・動物
等の生体組織などの含水率（70〜90wt％）に類
似し、しかも強度と弾性の点で、こんにやく、寒
天、アルギン酸、カラゲナン、グアール・ゴム、
ローカストビーン・ガム、アガロース、トラガン
ト・ゴム等の多糖類のゲルをはるかにしのぎ、人
間、動物等の生体組織に類似する。 本発明のゲルは、多量の水分を含むにもかかわ
らず、弾性を示し、堅く握りしめても、一時的に
変化するが、直ちに元の形状に復し、形くずれし
ない。しかもこの場合、含有水分の浸出はほとん
ど見られず、例えば含水率90wt％のゲルに２
Kg／cm²の圧縮応力を課しても、浸出（流出）水量
は、含有水の１〜２％にすぎないほか、引張り強
度も４Kg／cm²に及び、このような高含水のゲルと
しては、きわめて優れた弾性体である。 高含水性と機械的強度とは、従来から、医用高
分子および選択的透過膜等を開発するうえで、両
立し難い難題とされているが、本発明のゲルは、
上述の高含水性と強度とを有し、従来のポリビニ
ルアルコール水溶液の風乾皮膜あるいは、前述の
ポリビニルアルコール水溶液を０〜30℃に貯蔵す
る場合、あるいはポリビニルアルコール水溶液を
単に凍結・融解する場合などに得られる軟弱なゲ
ルとは全く異なる。 このように多くの水分を強固に保持することか
らも明らかなとおり、このゲルの見かけ比重は、
ほぼ水と同程度であり、水中でかろうじて沈降す
るにすぎない。 本発明のゲルには、粘着性がない。板状（８mm
×８mm×２mm）、円筒状（内径３mm、外径６mm、
長さ６mm）、球状（直径４mm）等に成型したゲル
約10ｇを50mlの水中で10日間かきまぜても、相互
付着、形くずれ等の現象は全く認められない。な
お、水道水中に１年間浸漬したが溶解せず、弾性
および強度も変らない（これは、例えばこんにや
くを数日間水道水に浸漬した場合、激しい形くず
れが起こるのと、きわめて対照的である）。 本発明においては、ポリビニルアルコール単一
成分がゲル素材（ゲル化成分）として用いられ
る。しかし、ポリビニルアルコールのゲル化現象
と全く無関係な無機物または有機物が共存するこ
とは、本発明に差支えなく、その共存量として
は、例えば、ポリビニルアルコールの1/2量以下
とすることができる。これに反し、ポリビニルア
ルコール（または変性ポリビニルアルコールとし
てのポリビニルアセタール、ポリビニルブチラー
ル等）に作用して複合ゲルを生成する物質ならび
にポリビニルアルコールと反応してこれを変性さ
せる物質は、たとえ少量共存することによつて
も、しばしば、本発明のゲル形成（ポリビニルア
ルコール単一成分のゲルの形成）に好ましくなな
い影響を及ぼし、機械的強度の優れた高含水性ゲ
ルの生成を困難とする。このような物質として
は、既に、ポリビニルアルコール類との程互作用
が知られているコロイド状アルカリ・シリケート
（米国特許2833661（1958））、コロイド状シリカ
（米国特許2833661（1958））、アルカリ性コロイド
状シリカ（特開昭54−153779）、有機ケイ素化合
物（酢酸ビニル樹脂、P93、日刊工学新聞社
Y1962））、テトラアルキルシリケート（特公昭55
−30358、特公昭55−11311）ホウ素、ホウ砂（フ
ランス特許743942（1933））、フエノール、ナフト
ール、メタ・クレゾール、ピロガロール、サリチ
ルアニリド、ジサリチルベンジジド、レゾルシノ
ール、ポリアミン類（高分子化学、11、（105）23
（1954））カオリン（kaolin）（Natura、170、461
（1955））、などが挙げられる。これらは、いずれ
もその共存量に対応して、ポリビニルアルコール
との複合ゲルを形成して不都合を生じるので、本
発明においては回避される。 本発明では、前述のとおり、微生物生菌体の懸
濁水溶液を凍結・成型することを不可欠としてい
る。一般に、微生物または生体組織あるいはこら
らの懸濁水を凍結する場合、多少ともこれらが凍
結障害を受けることは、古くからよく知られてい
る。この生体またはその組織、タンパク質等への
凍結障害を回避するか、あるいは、これを著しく
軽減するには、前述の−30℃の以下の温度まで急
冷する方法のほか、カルボキシメチルセルロース
等の水酸基含有水溶性高分子物質、さらには各種
の凍結・乾燥障害保護剤を少量共存させる方法が
著名である。本発明においては、ポリビニルアル
コール（ゲル化素材）自体が、強力な凍結・乾燥
障害保護剤として作用するため、通常微生物生菌
体の大部分が保護され、後述するとおり十分な生
育・活動が確保されるが、更に公知の凍結・乾燥
障害保護剤を共存させることができる。凍結・乾
燥障害を軽減する物質は、一般に、保護剤、保護
物質（Protectant、Protective substance）、添
加剤、添加物（additives.additionalsubstance）、
媒質、媒剤、媒液（adjuvant）、分散媒
（suspended medium）、安定剤（stabilier）など
と呼ばれ、具体的としては、マグネシウム・イオ
ン、グリセリン、ジメチルスルホキシドなどが著
名である。本発明で得られる微生物固定化ゲル成
型品として例えば２mm〜５mmの立方体ゲル、ある
いは８mm×８mmのラシヒ・リングなどを固定化微
生物生菌体の生育・活動に至適の温度とPH値を有
する基質水溶液（培地）に添加し、フラスコ内で
接触させる場合、元の（非固定化）微生物生菌体
に比較して、85〜97％程度の活性が観察される。
このゲル成型品の大きさを更に増大させると、上
記の相対比は低下する傾向にあるが、このような
場合には必要に応じ、公知の基質拡散浸透促進剤
すなわち、ラウリルアルコール硫酸エステル、セ
チルピリジウムクロリド、セチルトリメチルアン
モニウムプロミド等の界面活性剤を用いることが
でき、これによりゲルの機械的強度、表命等の性
能が低下することはない。 本発明のポリビニルアルコールゲルに、ポリビ
ニルアルコール繊維またはポリビニルアルコー
ル・フイルムに対する硬化処理を施すことによ
り、更に若干、ゲルの機械的強度が高まる。この
公知の硬化（架橋）処理としては、例えば、アル
デヒド、ジアルデヒド、ジイソシアナート、フエ
ノール類、あるいは、チタン、クロム、ジルコニ
ウム等の金属化合物、さらにはホウ砂、アクリロ
ニトリル、トリメチロールメラミン、エビクロロ
ヒドリン、ビス−（β−ヒドロキシエチル）スル
ホン、ポリアクリル酸、ジメチロール尿素、無水
マレイン酸等による方法を挙げることができる。
しかし、本発明のゲルは、既に述べたとおりの強
度（耐荷重性）を有し、また上記の補助的硬化処
理により、固定化微生物生菌体がしばしば損傷を
受けることを考慮するならば、本発明はこれらの
硬化処理を要しない。 次に実施例に基づいて本発明を説明する。 実施例 １ 市販ポリビニルアルコール（けん化度97モル
％、粘度平均重合度1700、４％水溶液の粘度（20
℃）26cP）の粉末86ｇ（含水率7wt％）を、水
914ｇに溶解し、8.0wt％水溶液とした。 この水溶液44ｇに、120℃×20minの加圧水蒸
気滅菌処理を施し、次に無菌室において放冷後、
ここへ、サツカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）0.8ｇを含む懸濁
水（リン酸緩衝液、PH７）４ｇを注ぎ、7min間
かきまぜた。この懸濁水溶液のポリビニルアルコ
ール濃度は7.3wt％である。この懸濁水40ｇを無
菌室において、ラシヒ・リング（外径８mm、内径
４mm、長さ８）成形用鋳型（130個分）へ注入し、
−33℃×0.5hの冷却（凍結・成型）を施した後、
成型体を取り出し、6hの真空乾燥を施した。解
凍後、23ｇ（含水率84wt％、脱水率≡凍結・成
型体の重量減少率＝43wt％）の成型ゲル（酵母
含有ラシヒリング）を得た、このゲル、あらかじ
め滅菌した0.9％食塩水40mlに6h浸漬した結果、
成型ゲルは吸水し27ｇ（含水率87wt％）に達し
た。また、この浸漬液には前記酵母は検出されな
い。したがつて、酵母のほぼ全量が、ラシヒリン
グ内に包括（捕捉）されたことを知つた。 直径３cm、高さ10cmのガラス製円筒（カラム）
に、上記ラシヒリング27ｇを不規則充てんし、あ
らかじめ120℃×20minの滅菌処理を施したエチ
ルアルコール合成用基質水溶液（グルコース
10wt％、硫酸マグネシウム七水和物60ppm、PH
６、32℃）を、25ml／ｈの流速で塔底から送入し
た結果、12h後の流出液のエチルアルコール濃度
は4wt％（理論収率の77％）に達した。この操作
を12日間継続した後の、塔頂流出液のエチルアル
コール濃度は、やはり4wtであつた。 実施例 ２ 市販のポリビニルアルコール（けん化度98.4モ
ル％、粘度平均重合度1800、４％水溶液の粘度
（20℃）29.5cP）の粉末84ｇ（含水率5wt％）を、
水916ｇに溶解し、8.0wt％水溶液（PH6.9）を得
た。 この水溶液18ｇに、120℃×20minの加圧水蒸
気滅菌処理を施し、次に無菌室において放冷後、
ここへ、サツカロマイセス・セレビシエ
（Saccharomyces cerevisiae）0.4ｇを含む懸濁
水（リン酸緩衝液、PH７）２ｇを注ぎ、7min間
かきまぜた。この懸濁水溶液のポリビニルアルコ
ール濃度は、7.2wt％である。 この懸濁水溶液18ｇを、無菌室において、ポリ
エチレン製容器（底面６×６cm）に注ぎ、−53℃
×0.6hの冷却（凍結・成型）を施した後、5hの真
空乾燥を施した。解凍後、10.5ｇ（含水率84wt
％、脱水率42wt％）の白色不透明ゲルを得た。
これを、あらかじめ滅菌した0.9％食塩水30mlに
6h浸漬した結果、ゲルは吸水し、12ｇ（含水率
86wt％）に達した。この浸漬液には前記酵母は
検出されなかつた。次にこのゲル、多数の細片
（８mm×８mm×４mm）に裁断後、あらかじめ滅菌
した0.9％食塩水40mlで洗浄し、この洗浄液を光
学顕微鏡により観察した結果、前記酵母が少数認
められたが、洗浄液の濁度に基づき、これを定量
し、当初の酵母の少なくとも98％がゲル（細片）
中に確実に包括されたことを知つた。 グルコース5wt％、硫酸マグネシウム七水和物
60ppmの、アルコール合成用基質水溶液40mlを、
坂口フラスコ（500ml）に採取後、120℃×20min
の滅菌処理を施し、無菌室に放冷後、ここへ、上
記裁断ゲル（固定化酵母）12ｇを投入し、焼綿栓
を付して30〜33℃の恒温室において振とうした結
果、この基質水溶液から、24h後に1.9wt％のエ
チルアルコールが検出された。この場合、基質水
溶液への酵母の流出はやはり認められなかつた。 一方、上記酵母と同株のサツカロマイセス・セ
レビシエ0.4ｇを含む懸濁水12ｇに、前述の基質
水溶液40mlを加え、同様に振とうした結果、その
エチルアルコール濃度は、24h後に2.2wt％（理
論収率の86％）に達した。 したがつて、本発明のゲルに包括された酵母
は、アルコール醗酵操作中も全て、ゲル中に固定
化され、しかもその解糖活性（エチルアルコール
生成能）は元の酵母（非固定酵母）の90％に及ぶ
ことが明らかである。 比較例 １ 実施例２のポリビニルアルコール8.0wt％水溶
液60ｇに、120℃×20minの加圧水蒸気滅菌処理
を施し、放冷後、無菌室において、この水溶液
へ、実施例２と同株のサツカロマイセス・セレビ
シエ（Saccharomyces cerevisiae）1.4ｇを含む
懸濁水（リン酸緩衝液）７ｇを注ぎ、7min間か
きまぜた。次に、この懸濁水溶液60ｇを、底面10
×10cmの容器へ注ぎ、２日間放置することによ
り、湿潤セロハン紙に似た軟弱な粘着性フイルム
14.5ｇ（含水率62wt％）を得た。このフイルム
（厚さ約1.5mm）を、あらかじめ滅菌した0.9％食
塩水20mlに浸漬した結果、4h後にフイルムは17.2
ｇ（含水率67wt％）に達した。この浸漬液には
かなりの酵母が認められ、比懸分析の結果から、
前記酵母の15％相当分が、ポリビニルアルコー
ル・フイルムに包括されることなく、浸漬液へ移
行したことを知つた。次に、このフイルムを、多
数の細片（８mm×８mm×1.5mm）に裁断後、あら
かじめ滅菌した0.9％食塩水84mlで洗浄した（こ
の洗浄液へ流出した酵母は、当初の酵母添加量の
1wt％程度である）。 実施例２の基質水溶液40mlを坂口フラスコ
（500ml）に採り、120℃×15minの滅菌処理を施
した後、無菌室で放冷し、ここへ、上記フイルム
裁断片17ｇを投入後、焼綿栓を付し、30〜33℃の
恒温室において振とうしたが、24h後のエチルア
ルコール濃度は0.4wt％（理論収率の15％）にす
ぎず、また、ポリビニルアルコールが若干溶出し
たこと知つた。 このように、ポリビニルアルコールを用いる公
知手法に従う場合、固定化過程における酵母の損
失が、実施例２の場合に比し著しいうえ、固定化
酵母の解糖（エチルアルコール生成）は著しく緩
慢である。また得られるフイルムは軟弱である。 比較例 ２ 実施例２のポリビニルアルコールのかわりに、
けん化度93モル％、粘度平均重合度1700、４％水
溶液の粘度（20℃）30cpの市販ポリビニルアル
コールを用い、同様に操作した。凍結・成型・乾
燥体10ｇ（含水率83wt％、脱水率44wt％）が得
られたが、解凍後は５℃においても軟弱化し、少
量のゲル層のほかに、多量のポリビニルアルコー
ル濃厚水溶液が層分離するのを認めた。また、同
時に、この分離液相に多量の酵母が流出したこと
を知つた。 比較例 ３ 実施例２のポリビニルアルコールのかわりに、
けん化度99.2モル％、粘度平均重合度500、４％
水溶液の粘度（20℃）5.6cPの市販ポリビニルア
ルコールを用い、その18wt水溶液18ｇにつき、
同様に操作したが、寒天に似たもろいゲル10.5ｇ
（含水率84wt％、脱水率42wt％）が得られたにす
ぎず、ほとんど弾性を示さず、軟弱であつた。 比較例 ４ 実施例３と同じ重合度500のポリビニルアルコ
ール水溶液の濃度を30wt％まで高め、その水溶
液18ｇにつき同様に操作し、10.4ｇ（含水率84wt
％、脱水率42wt％）のゲルを得たが、このゲル
には、水中で著しく軟化し、形くずれを起こし、
同時に、水中へ酵母が流出した。 比較例 ５ 市販ポリビニルアルコール（けん化度99.4モル
％、粘度平均重合度2600、４％水溶液の粘度（20
℃）、66cP）の粉末65ｇ（含水率8wt％）を、水
93.5ｇに溶解し、6wt％とした。この水溶液に加
圧水蒸気滅菌を施し、放冷後、実施例１と同様の
酵母懸濁水３ｇを添加し、−70℃×0.5hの凍結・
成型処理後、常温で2h放置した結果、軟質ゲル
（37ｇ、脱水率０％、含水率94wt％）を得たが、
弾性を示さず、水中に１晩浸漬することにより形
くずれし、水層は濁り、多量の酵母が水中に流出
した。また、水中浸漬前の軟質ゲルはわずか100
ｇ／cm²の引張り応力により容易に破断された。 すなわち、たとえ、ポリビニルアルコール水溶
液に凍結・成型を施しても、引き続き、これに凍
結・乾燥を施さないかぎり、本発明のゲルに比
し、耐水性の乏しい軟弱なゲルが生成するにすぎ
ず、酵母を固定化して実用に供するに耐えないこ
とが明らかである。 比較例 ６ 比較例５の凍結・成型処理後、成型体34ｇを常
温で融解させ、しかる後、真空乾燥器に移し、減
圧乾燥を試みたが融解液の泡立ちが激しく、操作
を停止しなければならなかつた。次に、泡立ち対
策として、上記成型体融解液の1/10（3.7ｇ）を
採取し、これをポリエチレン製ビーカー（100ml）
の底面に塗布後、減圧乾燥を試た。これにより、
ビーカーの底面に１ｇのゲル（含水74wt％、脱
水率72wt％）が生成したが、その弾性は乏しく、
また600ｇ／cm²の引張り応力により直ちに切断さ
れた。 これに反し、本発明実施例２のゲル（酵母含有
ゲル）は、引張り応力４Kg／cm²まで切断されず、
また、これに２Kg／cm²の圧縮応力を課しても、こ
の応力を除いた後は、元の形状がほぼ完全に回復
された。 このように、たとえ、ポリビニルアルコール水
溶液を凍結・成型しても、その後、これを融解さ
せることなく（凍結状態を維持しつつ）脱水しな
いかぎり、本発明の高含水性で、しかも弾性力に
富む、機械的強度の優れたゲル（酵母含有ゲル）
は得られないことがわかる。 ゲル（微生物含有ゲル）の弾性と強度は、いず
れも、反応器（塔）へゲルを充てんする操作上の
重要な物性であるほか、ゲル内微生物の増殖に伴
なうゲル内細孔の膨張（増殖部近傍のゲル素材へ
の引張り応力、ならびに、相異なる増殖部分には
さまれたゲル素材への圧縮応力）の観点からもき
わめて重大な意味を有する。すなわち、微生物生
菌体固定化用担体ゲルとしては、微生物の激しい
増殖を受け容れるに足るゲル弾性ならびに、細孔
の膨張に耐えうる強度が、ともに要求される。本
発明実施例１、２のゲルに比し、本比較例のゲル
は、この点において、やはり不十分であること
は、比較例６に述べるとおりである。 実施例 ３ 市販ポリビニルアルコール（けん化度97モル、
粘度平均重合度1700、４％水溶液（20℃）26cP）
の粉末86ｇ（含水率7wt％）を、水914ｇに溶解
し、8.0wt％の水溶液（PH6.8）を得た。この水溶
液170ｇに120℃×20minの加圧水蒸気滅菌処理を
施し、次に無菌室において放冷後、ここで、エル
ビニア・ヘルビコラ（Erwinia herbicola）４ｇ
を含む懸濁水（リン酸緩衝液）20ｇを注ぎ、
7min間かきまぜた。この懸濁水溶液のポリビニ
ルアルコール濃度は7wt％である。 この懸濁水溶液190ｇを、無菌室において、ラ
シヒ・リング（８mm×８mm）成型用鋳型（630個
分）へ注入し、−53℃／0.5hの冷却（凍結・成型）
を施した後、成型体を取り出し、6hの真空乾燥
を施した。解凍後、133ｇ（含水率86wt％、脱水
率30wt％）のゲルを得た。このゲルを、あらか
じめ滅菌した0.9％食塩水100mlに6h浸漬した結
果、成型ゲルは吸水して139ｇ（含水率87wt％）
に達した。この浸漬液には、前記細菌は検出され
ない。したがつて、細菌のほぼ全量が、ラシヒリ
ング内に包括されたことが分かる。 直径３cm、高さ60cmのアクリル樹脂製円筒（カ
ラム）へ、上記ラシヒ・リング139ｇを不規則充
てんし、あらかじめ、120℃×20minの滅菌処理
を施したチロシン合成用基質水溶液（フエノール
0.1％、亜硝酸ナトリウム0.2％、酢酸アンモニウ
ム５％、ピルビン酸ナトリウム３％、ピリドキサ
ールホスフアート100ppm、エチレンジアミンテ
トラアセタート300ppm、PH８、30℃）を150ml／
ｈの流速で塔底から送入した結果、10h後に、流
出液のβ−チロシン（β−（ｐ−ヒドロキシフエ
ニル）アラニン）濃度は600ppm（収率30モル％）
に達した。 実施例 ４ 市販ポリビニルアルコール（けん化度97モル
％、粘度平均重合度2200、４％水溶液の粘度（20
℃）54cP）の粉末85ｇ（含水率6wt％）を、水
915ｇに溶解し、8.0wt％の水溶液（PH6.9）を得
た。 この水溶液380ｇに120℃×20minの加圧水蒸気
滅菌処理を施し、次に、無菌室において放冷後、
ここへ、ラクトバチルス・ブレビス
（Lactobacillus brevis）４ｇを含む懸濁水（ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、
PH8.0）20mlを添加し、7min間かきまぜた。この
懸濁水溶液のポリビニルアルコール濃度は7.6wt
％である。 この懸濁水溶液200ｇを、無菌室において、ラ
シヒリング（８mm×８mm）成型用鋳型（665個分）
へ注入し、−45℃×0.5hの冷却（凍結・成型）を
施した後、鋳型の上面カバーを除き成型体を支持
する下面カバーに6hの真空乾燥を施した。解凍
後、130ｇ（含水率87wt％、脱水率35％）のゲル
を得た。このゲルを、あらかじめ滅菌した0.9％
食塩水150mlに6h浸漬した結果、成型ゲルは吸水
して139ｇ（含水率88wt％）に達した。この浸漬
液には前記細菌は認められず、細菌のほぼ全量
が、ラシヒリング内に包括されたことを知つた。 実施例３のカラムに上記成型ゲル139ｇを不規
則充てんし、あらかじめ120℃×20minの滅菌処
理を施したフルクトース合成用基質水溶液（グル
コース5wt％、硫酸マンガン四水和物0.01モル／
、62℃、PH6.3）を、12ml／ｈの流速で塔底か
ら送入した結果、35h後の流出液はPH6.7、フルク
トース濃度2.0wt％（収率40モル％）であつた。 実施例 ５ 実施例４において、ラクトバチルス・ブレビス
（Lactobacillus brevis）のかわりに、ストレプ
トマイセス・フエオクロモゲネス
（Streptomyces phaeochromogenes）を用い、
しかもその添加量としては、実施例４の場合の1/
２００、すなわち細菌0.002ｇを含む懸濁水（培養
液）20mlとした。 ポリビニルアルコールと細菌の混合懸濁水溶液
200ｇを同様に凍結・成型・乾燥し、ゲル128ｇ
（含水率87wt％、脱水率36wt％）を得た。この成
型ゲルを、あらかじめ滅菌した0.9％食塩水150ml
に6h浸漬した結果、成型ゲルは吸水して137ｇ
（含水率88wt％）に達した。 このゲル（137ｇ）を、実施例３のカラムに不
規則充てんし、あらかじめ120℃×15minの滅菌
処理を施した培養液（キシロース１％、ペプトン
１％、肉エキス１％、酵母エキス0.3％、食塩0.5
％、硫酸マグネシウム七水和物0.06％、30℃）
を、120ml／ｈの流速で塔底から48hにわたり送
入した。この培養液（培地）送入操作の前後にお
いて、充てん物（ラシヒリング）の一部を採取
し、走査型電子顕微鏡により観察した結果、培地
送入開始前にはゲル中にほとんど細菌が認められ
ないのに反し、培地送入後は、細菌集落（約50μ
ｍ、細菌数約30万個）が、ゲル内各所に見られ
た。 次にフルクトース合成用基質溶液（グルコース
５％、硫酸マグネシウム0.01M、PH8.3、65℃）
を塔底から90ml／ｈの流速で送入した結果、28h
後の流出液のフルクトース濃度は2wt％（収率40
モル％）に達し、PH値は6.3であつた。 なお、上述の培養（増殖）操作を省略して直ち
に基質溶液を28hにわたり送入しても、流出液の
フルクトースは0.02wt％にすぎないことを確かめ
た。 このように本発明においては、微生物生菌体を
固定化できるため、当然のことながらこれをゲル
内で増殖させることが可能である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ けん化度が95モル％以上で、粘度平均重合度
   が1500以上のポリビニルアルコールの水溶液に微
   生物生菌体を添加して得られる懸濁水溶液を、任
   意形状の容器または成型用鋳型に注入し、これを
   −６℃より低い温度で凍結・成型し、しかる後、
   この成型体を、融解させることなく脱水率5wt％
   以上に真空乾燥し、必要に応じ水中に浸漬するこ
   とを特徴とする微生物生菌体の固定化法。