JPH025393B2

JPH025393B2 -

Info

Publication number: JPH025393B2
Application number: JP56098770A
Authority: JP
Inventors: Hinata Saito; Fujio Kawamura; Hiroyuki Anzai
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1981-06-25
Filing date: 1981-06-25
Publication date: 1990-02-01
Also published as: JPS57212198A

Description

【発明の詳細な説明】〔〕発明の背景技術分野本発明は、枯草菌の形質転換に関する。さらに
具体的には、本発明は、使用するプラスミドの種
類および形質転換発現操作に特徴を有する枯草菌
の形質転換に関する。

最近の分子生物学の発展によつて、細菌に有用
物質産生遺伝子を組込んで該細菌に該有用物質産
生能を賦与する技術、すなわち所謂遺伝子組換え
ないし形質転換技術、が現実のものとなりつつあ
る。この場合の形質転換されるべき細菌、すなわ
ち宿主菌、としては太陽菌が主として用いられて
おり、この宿主に対して外来遺伝子を導入すべき
ベクターに関しても検討が多く行なわれて種々の
宿主−ベクター系が開発されている。

ところで、太陽菌はグラム陰性菌であるが、細
菌にはその外にグラム陽性菌も存在するので、グ
ラム陽性菌、特に枯草菌、についても適当な宿主
−ベクター系が開発されれば裨益するところは大
きい。単に宿主の種類が増えたというだけではな
く、グラム陰性菌では発現し難い形質の発現が可
能となることが期待されるからであり、また枯草
菌のようなグラム陽性菌に属する微生物はアミノ
酸、呈味成分、抗生物質あるいは各種酵素などの
大量生産に使用されてきたことを通じてその工業
的大量培養には長い経験と技術が蓄積されてお
り、また枯草菌は動植物に対して病原性を示さな
いうえヒト等の動物の腸管内での寄生性が無いた
め安全に取扱える微生物だからである。

〔〕発明の概要要旨本発明は上記の点に解決を与えることを目的と
し、枯草菌用ベクターとして有用なハイブリツド
プラスミドを提供することによつてこの目的を達
成しようとするものである。

従つて、本発明によるハイブリツドプラスミド
は、宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝
子部分と相同なDNAの断片と、枯草菌で増殖可
能なプラスミド由来のDNAの断片と、を含み、
上記の第一のDNAは宿主染色体の相同部分との
組換えによる相補性により、ヒスチジン非要求性
遺伝子を形成するものであり、宿主枯草菌で増殖
可能なものであること、を特徴とするものであ
る。

また、このハイブリツドプラスミドを使用する
方法に係る本発明による枯草菌のDNA組換法は、
宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝子部
分と相同なDNAの断片と、枯草菌で増殖可能な
プラスミド由来のDNAの断片と、を含み、上記
の第一のDNAは宿主染色体の相同部分との組換
えによる相補性により、ヒスチジン非要求性遺伝
子を形成するものであり、宿主枯草菌で増殖可能
なものであるところのハイブリツドプラスミド
を、組換能を有する宿主枯草菌に形質転換法によ
つて導入して、宿主枯草菌の染色体に該ハイブリ
ツドプラスミドが多重に組込まれた染色体組込み
形質転換体を生成させ、この染色体組込み形質転
換体を選別すること、を特徴とするものである。

ここで、「染色体組込み形質転換体」とは、宿
主染色体へハイブリツドプラスミドが組込まれた
形質転換体を意味する。

効果本発明によれば取扱い上安全な枯草菌について
の新規な宿主−ベクター系が提供されるのである
が、本発明のハイブリツドプラスミドによれば高
い頻度で枯草菌の形質転換が行なわれ、それによ
つて宿主染色体上にこのハイブリツドプラスミド
が同一方向に40コピー以上も多重に組込まれる。

従来、枯草菌のコンピテントな条件下での
DNA組換えは供与一本鎖DNAと受容菌染色体の
二重交叉によるといわれている。しかし、本発明
での組換えは宿主菌の対数増殖期におきており、
プラスミドは所謂キヤンベル型組換えによつて宿
主染色体に連続して同一方向に多重に組込まれて
いる。この事実は、従来の知見からは予測されな
かつたことである。

このように、本発明ではベクターとなるべきハ
イブリツドプラスミドが宿主枯草菌の染色体中に
多重に組込まれるから、このベクターに有用遺伝
子たとえば生理活性ポリペプチド産生遺伝子を組
込んだ場合はこの有用遺伝子が宿主染色体上に増
幅された状態で存在することになり、従つて有用
遺伝子の形質発現が効率よく行なわれることが期
待できる。特に、本発明ハイブリツドプラスミド
の代表例であるpUB HA31（詳細後記）は分子量
が4.1メガダルトン（Md）と小さいから、有用遺
伝子の多重組込みは有効に行なわれよう。また、
このプラスミドは染色体中に組込まれていること
に相当して、この形質転換体菌株の保存中にある
いは外部環境により脱落することが少なくて安定
であるので、菌株取扱上も有利である。

〔〕発明の具体的説明１ハイブリツドプラスミド (1) 定義 (1) 構造本発明によるハイブリツドプラスミド
は、宿主となるべき枯草菌の染色体の
hisA^-遺伝子部分と相同なDNAの断片と、
枯草菌で増殖可能なプラスミド由来の
DNAの断片と、を含むものである。ここ
で、第一のDNA、すなわち宿主となるべ
き枯草菌のhisA^-遺伝子部分と相同な
DNA、は宿主染色体の相同部分との組換
えによる相補正によりヒスチジン非要求性
遺伝子を形成するもの、すなわち生成され
る染色体組込み形質転換体にその選別に有
用なヒスチジン非要求性の形質を発現させ
ることができるものである。このハイブリ
ツドプラスミドは、宿主枯草菌で増殖可能
なものでなければならない。

本発明によるハイブリツドプラスミド
は、二種のDNA断片を含むものである。
断片を「含む」ということは、この二種の
断片のみからなる場合の外に、他のDNA
断片、特に有用物質産生遺伝子DNA、を
含んでなることをも包含するものである。

(2) 相同DNA断片このハイブリツドプラスミドでの宿主と
なるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝子部
分と相同なDNAの断片は、ヒスチジン要
求性（hisA^-）遺伝子のDNA鎖からなる
ものである。

このDNAの断片は、前記の通り、宿主
染色体の相同部分との組換えによる相補性
により、生成される染色体組込み形質転換
体にその選別に有用な形質を発現させるこ
とができるものでなければならない。その
ような要件を満たす条件の一つは、ハイブ
リツドプラスミドの該DNA断片とこれと
相同な宿主枯草菌の染色体の部分の栄養要
求性（hisA^-）が栄養非要求性遺伝子から
そのDNAの一部に変異が生じていること
によつて導びかれたものであり、しかもこ
の変異がプラスミドDNAと宿主染色体
DNAとでは異なる部位に生じていること、
である。具体的には、たとえば、プラスミ
ドDNAと宿主染色体との間の相同部分で
あるヒスチジン要求性遺伝子について、プ
ラスミド側の該遺伝子がその一端のヌクレ
オチドのいくつかが欠失していることによ
つてヒスチジン要求性となつているのに対
して、宿主染色体側の該遺伝子がその
DNAの内部のヌクレオチド１個が点変異
していることによつて（たゞし、両DNA
部分が組換えを起すべく並列したときに、
この点変異部分は、プラスミドDNA欠失
部分とは異なる部位に存在しなければなら
ない）ヒスチジン要求性となつている、と
いうことである。この場合には、キヤンベ
ル型組換えによつて、それぞれのアタツチ
メントサイトの片側にあるプラスミド
DNAの非欠失部分と宿主染色体DNAの非
変異部分とからの相補的寄与によつて、
DNAの変異を持たない原遺伝子、すなわ
ちヒスチジン非要求性遺伝子、が再生され
ることになり、この形質すなわちヒスチジ
ン非要求性によつて目的の形質転換体の選
別が可能となるのである。

(3) プラスミド由来DNA断片プラスミド由来のDNAの断片を与える
べきプラスミドとしては、枯草菌で増殖可
能な種々のものがありうる。具体的には、
たとえば、pUB110、pLS11、pLS13、
pLS14、pC194、pE194、pSA2100、
pT84、pTP5、その他がある。これらのう
ちで好ましいのは、pUB110、pC194、
pE194、特にpUB110、である。pUB110
は黄色ブドウ球菌由来で、カナマイシン耐
性（km^R）の分子量約3Mdのマルチコピー
プラスミドである。km^Rのようなマーカー
は、形質転換体を一次選別するのに利用す
ることができる。

(2)造成 (1) 原理本発明ハイブリツドプラスミドの造成
は、基本的には必須二DNA断片の連結か
らなる。しかし、宿主染色体と相同な
DNA断片に関しては宿主染色体の対応相
同部分との間に前記のような要件を満たす
必要があるから、すなわち、たとえば、こ
の相同部分がヒスチジン要求性に関する正
常な遺伝子のDNAの変異によるヒスチジ
ン要求性となつている必要があるから、こ
のハイブリツドプラスミドの造成は二種の
DNA断片の連結とこの要件の充足という
二つの様相から考えることができる。

(2) 好ましい方法本発明ハイブリツドプラスミドを造成す
る好ましい方法は、プラスミドたとえば
pUB110と宿主染色体DNA断片を組込ん
だフアージ誘導体、たとえばρ₁₁phisA⁺、
とを適当な制限酵素たとえばEco RIで切
断し、生成するプラスミド断片とフアージ
から切出された宿主染色体DNA断片とを
DNAリガーゼたとえばT4リガーゼで連結
し、これをコンピテント枯草菌たとえば
Bacillus subtilis61242にたとえばSpizizen
の方法〔J.Bacteriol.81、741−746（1961）〕
によつて導入し、生成される形質転換体か
らクローン化された目的ハイブリツドプラ
スミドたとえばpUB HA31を回収するこ
とからなるものである。この方法では、リ
ガーゼで連結して得られたまゝの連結体は
hisA⁺のDNAに欠失がないので、このプ
ラスミドは依然としてhisA⁺であり、これ
を枯草菌の形質転換に付すことによつて
hisA^-という所望遺伝形質が生じる。な
お、この方法の代りに、人為的なDNA変
異または欠失誘起法によつてもよい（詳細
後記）。

この前者の好ましい造成方法で使用され
る宿主染色体DNA断片を組込んだフアー
ジ誘導体は、種々のテンペレートフアージ
から河村の方法〔Gene、５（1979）、87−
91）（Elsevier）、「蛋白質、核酸、酵素」
第26巻、第469−475頁（1981）〕によつて
つくることができる。

使用しうるテンペレートフアージとして
は、ρ₁₁（分子量＝約78メガダルトン
（Md））、φ105、φ3T、その他がある。こ
れらのうちでは、ρ₁₁、およびφ105、特に
ρ₁₁、が好ましい。

宿主枯草菌からの目的染色体DNA断片、
たとえばhisA⁺、を組込んだフアージ（た
とえばρ₁₁）誘導体をつくるには、枯草菌
染色体DNA（たとえばhisA⁺）および
ρ₁₁DNAをともにEco RIで切断し、生成
断片をDNAリガーゼによる連結操作およ
びクローン化に付せばよい。枯草菌の
hisA⁺遺伝子を含むフアージρ₁₁の誘導体と
して、ρ₁₁p hisA⁺が既に知られており、ま
たこれは本発明で使用するのに好ましいも
のの一つである。

一方、プラスミドとしては、枯草菌で増
殖可能な種々のものが使用可能であつて、
その具体例のいくつかは前記した通りであ
る。コピー数の多いプラスミドが好まし
い。好ましいものは、黄色ブドウ球菌由来
のpUB110である。

前記のフアージ誘導体と上記のプラスミ
ドとを連結するには、前記のように、同一
制限酵素による両者の切断および生成断片
のリガーゼによる連結を行なえばよい。使
用することができる制限酵素は、フアージ
誘導体とプラスミドとの両者を切断するこ
とができ、しかも必要なDNA部分（たと
えば、プラスミドの自律増殖のためのドラ
イブユニツト、hisA⁺部分、および必要な
薬剤耐性関与遺伝子）を切断しない任意の
であることができる。具体例を挙げれば、
Eco RI、Bam HI、Hin ｄ、その他が
ある。これらのうちでは、Eco RIが好ま
しい。

生成する連結体を本発明ハイブリツドプ
ラスミドに変換するためにこの連結体によ
る枯草菌の形質転換を行なうが、ここに用
いられる枯草菌は後記する染色体への多重
組込みに使用する枯草菌と同じように定義
されるものでよい。具体的には、たとえ
ば、B.subtilis61242株〔工業技術院微生物
工業技術研究所受託番号「微工研菌寄第
6028号」。hisAI^-、trpC2^-、cysB3^-〕、
Bacillus subtilis PS9−16〔同「微工研菌
寄第6029号」。hisAI^-、metB5^-、leuA8^-、
trpC2^-、nonAI^-、nonBI^-〕、UOT278お
よびUOT378（UOTは東京大学応用微生物
研究所斎藤研究室保存株を意味し、自由分
譲可能である）がある。これらの菌は、い
ずれも、B.subtilis marburg株の変異株で
あり、その主な遺伝子型は上記に示した通
りである。

形質転換は、Spizizenの方法〔J.
Bacteriol.81741（1961）〕に準じて行なう
ことができる。形質転換体の選別は、
Km^R（プラスミドがpUB110である場合）
による一次選別および目的のHis⁺による
二次選別によつて行ない、さらにプラスミ
ドの検定を行なうことができる。これらの
詳細は、上記文献および後記実験例を参照
されたい。

(3) 生成物このようにして、たとえばρ₁₁phisA⁺の
断片をpUB110に連結したのち、B.
subtilis61242株に対して形質転換を行なえ
ば、本発明ハイブリツドプラスミドpUB
HA31が得られる。pUB HA31は、アガ
ロースゲル電気泳動法によつて測定して分
子量4.1Mdのプラスミドである。

pUB HA31は、他のプラスミドpUB
HA81と同時に分離される。両者のEco
RIによる切断パターン（アガロース電気
泳動図）（第１図参照）の検討の結果、
pUB HA81はρ₁₁hisA⁺にクローン化され
ている3.3MdのEco RI断片がそのまゝの
大きさでクローン化されていて（従つて
His⁺）、形質転換法により遺伝子DNAを
宿主細胞に導入した際に形質転換体から分
離されることが予測されるプラスミドであ
る。これに対し、本発明のpUB HA31は
思いがけないことに、この3.3MdのEco
RI断片が一部欠失して（従つてhisA^-）そ
の一部すなわち1.1Mdの断片がクローン化
されているプラスミドである。

(4) 他の造成法上記の好ましい造成法では、フアージ誘
導体としてρ₁₁phisA⁺を使用しているが、
代りにρ₁₁phisA^-を使用すれば、hisA^-の
ハイブリツドプラスミドを直接得ることが
可能である。

また、上記のhis⁺のハイブリツドプラス
ミドpUB HA81に対してたとえばその一
部を欠失させることによつて、his⁺をhis^-
に変換させることができる。たとえば、正
常なヒスチジン遺伝子を含む断片を２個所
以上切断する制限酵素（上記の場合はHin
ｄ）でpUB HA81DNAを処理し、T₄リ
ガーゼで連結したのち、枯草菌を形質転換
させることにより、ヒスチジン遺伝子の一
部を欠失したプラスミドを取得することが
できる。

２染色体組込み形質転換体の造成上記のようにして得られる本発明ハイブリツ
ドプラスミド、たとえばpUB HA31、を使用
してたとえばS.Cohenの方法〔Molec.gen.
Genet.168、111−115（1979）〕に準じて形質転
換を行なうことができる。

(1) ハイブリツドプラスミド前記のようにして造成された本発明ハイブ
リツドプラスミドはそのまゝの形で形質転換
に使用することができるが、必要に応じて
pUB110、pC194、pE194、pSA2100、
pTP4、pTP5などのプラスミドベクターに
再度クローン化して使用に供してもよい。ま
た、有用物質産生遺伝子、たとえば哺乳動物
の活性ペプチド（インシユリン、インターフ
エロン、成長ホルモン、ACTHなどのホル
モン、ソマトスタチンなど）、ビタミン類、
酸素、抗生物質、アミノ酸その他の生体内産
生に関与する遺伝子、を組込んでから形質転
換に付すこともできる。なお、このような有
用物質産生遺伝子は、この過程より前の段階
たとえばフアージ誘導体の段階で組込んでお
くこともできる。

(2) 宿主枯草菌組換可能であり（Rec⁺）、ハイブリツドプ
ラスミドDNAと相同のhisA^-遺伝子部分を
持ち、対応する栄養非要求性の形質がこの遺
伝子の一部欠失または変異によつてマイナス
になつている（すなわち、栄養要求性（たと
えばhisA^-）（たゞし、この変異の部位は、
ハイブリツドプラスミドの対応DNA部分に
おいて異なつていること）任意の枯草菌が使
用可能である。

このような枯草菌の具体例は、たとえば、
B.subtilis61242株、B.subtilis PS9−16、
UOT278およびUOT378などである。

(3) 形質転換 S.Cohenの方法の詳細は、上記文献を参照
されたい。

この方法を本発明に適用した場合の詳細
は、後記実験例を参照されたい。

(4) 形質転換体の選別生成される形質転換体からの染色体組込み
形質転換体の選別は前記の組換えによる相補
性によつて発現した形質（たとええばHis⁺）
によつて一挙に行なうこともできるが、染色
体組込み形質転換体以外の形質転換体をも含
めた全形質転換体をプラスミド由来の形質た
とえば薬剤耐性によつて非形質転換体から一
次選別し、好ましくは得られた形質転換体を
増殖させて量を増やしてから、問題の形質す
なわち前記の相補性により発現したたとえば
His⁺によつて二次選別することが好ましい。

染色体組込み形質転換体の選別は、このよ
うな形質利用の手段の外に、ハイブリツドプ
ラスミド多重組込みによる活性の向上を利用
してこれを行なうこともできよう。

(5) 得られる染色体組込み形質転換体ハイブリツドプラスミドpUB HA31によ
つて形質転換させて得たB.subtilis61242株
（B.subtilis UOT477）は、「微工研菌寄第
6030号」として工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている。

３実験例 ρ₁₁phisA⁺の造成下記の河村の方法〔「蛋白質、核酸、酸素」第
26巻、第４号（1981年）第469−475頁〕に従つ
て、ρ₁₁phisA⁺を造成した。

すなわち、His⁺の枯草菌DNA（4μｇ）と
ρ₁₁DNA（10μｇ）をEco RIで切断し、T4リガー
ゼで連結する。受容菌としてフアージρ₁₁を溶原
化したヒスチジン要求株、たとえばB.subtilis
（his A1、leu A8、ρ₁₁）を用いる。連結DNAを
用いてこの株のコンピテント細胞（１ml）に加え
て、形質転換を行なう。通常0.1ml当たり約100〜
1000の形質転換体が得られる。

次に、hisA⁺遺伝子をもつρ₁₁フアージを選択し
かつ濃縮するために、His⁺形質転換体を50〜100
ずつに分け、５mlのＬ−brothに懸濁後OD₆₆₀＝
0.05に希釈し37℃で振とう培養する。OD₆₆₀＝0.2
〜0.3になつたときマイトマイシンＣ（0.5μｇ／
ml）処理を行なつてフアージを誘起し、溶菌液を
ミリポアフイルターで処理して生菌を除いてお
く。これらの溶菌液中のプラーク形成能とHiS⁺
形質導入能をテストする。His⁺形質導入能は対
数増殖期のヒスチジン要求性の非溶原菌を用いて
調べる。

このようにして得られたHiS⁺形質導入体につ
いて選択プレート上でsingle colony isolationを
行ない、再び溶菌液を調製して、プラーク形成能
とHis⁺形質導入能を調べる。

ハイブリツドプラスミドの造成 (1) 異種DNAの連結およびハイブリツドプラス
ミドの検出 pUB110およびρ₁₁phisA DNAの各々1μｇ
を、Ｓ緩衝液（20ｍＭトリス塩酸PH7.2、
10mM MgCl₂、0.1M NaCl）中で37℃で１時
間Eco RI処理し、さらに65℃で10分加熱して
から急冷した。これを緩衝液（20ｍＭトリス塩
酸PH7.6、10mMジチオスレイトール、2mM
ATP）に移し、T4リガーゼ（１単位）を加
え、10℃で24時間反応させた。

このDNA混合物によつてB.subtilis61242株
（Rec⁺hisAI、trpC2、cysB3）を形質転換させ
るためにSpizizenの方法に準じて、まずB.
subtilis61242株をCI培地（10×Salts10ml、蒸
留水90ml、50％グルコース１ml、1M
MgSO₄0.4ml、２mg／mlのトリプトフアン2.5
ml、５％カザミノ酸（Difco製）0.4ml）で培養
し、更にＣ培地（10×Salts10ml、蒸留水90
ml、10％グルコース、１ml、1M MgSO₄0.4
ml、トリプトフアン（２mg／ml）0.25ml、５％
カザミノ酸（Difco製）0.2ml）で60〜90分培養
したのち、このDNA混合物を培養液に加え、
その後60分間培養した。

形質転換株は、まず10μｇ／mlのカナマイシ
ンを含むTrypton Blood Base Agar（Difco
製）培地でカナマイシン耐性株を選択し、この
耐性株をさらにヒスチジンを含まない最小培地
（trpおよびcysは含む）にレプリカし、ヒスチ
ジン非要求株を選択した。

このようにして得られた枯草菌（Km^R、
His⁺株）について、保有するプラスミドの大
きさを簡易検出法にて調べた。すなわち、その
コロニーを30μlのLRS溶液（50mMトリス塩酸
PH7.5、10mM EDTA、0.1M NaCl、10mg／ml
リゾチーム、40μｇ／mlRNaseA、25％シユク
ロース）に懸濁させて37℃で200分処理したの
ち、10％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）3μl加
えて、加熱する。このDNA溶液をアガロース
ゲル電気泳動にかけて、プラスミドの大きさを
検定した。その結果、pUB110よりも分子量の
大きなプラスミドを２種確認した。

(2) ハイブリツドプラスミドの分離精製およびそ
の同定前記２種のプラスミドを保有する枯草菌
（Km^R、His⁺株）からのプラスミドの分離精製
は、Gryzanらの方法〔J.Bacteriol.134、318
（1978）〕が利用でき、その方法に準拠した。

すなわち、枯草菌（形質転換体）をＬ培地
（Bacto−trypton（Difco製））10ｇ、yeast
extract（Difco製）５ｇ、NaCl5ｇ、グルコー
ス２ｇ、カナマイシン10mg／ml、NaOHにて
中性に調整）に接種して対数増殖期後期まで培
養し、培養液を遠心して菌体を得て、それをリ
ゾチーム処理してから、5M NaClと10％SDS
を加えた。これを一晩０℃に静止したのち、遠
心し、その上清にエタノールを加え、さらに遠
心し、その沈殿物をRNaseとブロテアーゼと
で処理し、さらにフエノール処理し、その水相
よりエタノール沈殿物としてDNAを取得した。
このDNAをLow Melting Pointアガロースゲ
ル電気泳動にかけ、泳動後、エチジウムブロマ
イドで染色し、プラスミドを切り出した、脱染
後、TE緩衝液を加え、68℃で10分間加熱溶解
させ、フエノール処理した。この水相を、エタ
ノール沈殿後、TE緩衝液に溶解し、透析して、
精製プラスミドを得た。この方法で１リツトル
の培養液から50μｇ以上のcccDNAが得られ
た。

(3) 制限酵素切断地図の作成その他分離されたハイブリツドプラスミドは、制限
酵素による切断地図の作成、アガロース電気泳
動による分子量測定及び形質転換活性測定など
によりその性状を調べる。

たとえば、前記ρ₁₁hisAの断片をpUB110に
連結したのち、B.subtilis61242株に対して形質
転換を行なつて得られるハイブリツドプラスミ
ド（pUB HA31）は、下記の性状を有してい
る。

このプラスミドは他の種類のプラスミド
（pUB HA81）と同時に分離されるが、両者の
Eco RIによる切断パターン（アガロース電気
泳動図）として第１図が得られた。

更に、pUB HA31にhisA⁺遺伝子がクローン
化されているか否かを調べるため、受容菌であ
る枯草菌UOT378株（hisAI^-）をHis⁺に形質
転換する活性の有無を測定した。結果を第２図
にしてあるが、Eco RI分解産物では1.1Md断
片に相当する分画にHis⁺への形質転換活性が
みられた。これはプラスミド保有菌のHis⁺で
あるが、その宿主染色体のDNAも形質転換活
性を有している。また、pUB HA31を用いて
枯草菌組換え能欠損変異株GSY908
（recE4hisA1）を形質転換させた場合、得られ
たカナマイシン株はヒスチジン要求性であつ
た。従つて、pUB HA31はhisA1⁺ポイントの
近傍を有しており、hisA遺伝子の一部を欠失
しているが、hisAに関し宿主染色体と相同性
を持つているため導入により組換体を作ること
ができる。

次に、pUB HA31の切断点地図を得る目的
で、９種の制限酵素での切断数を調べ、二重切
断との組合せにより切断部位を決定した。使用
した制限酵素は、BamH、Bgl、Bgl、
Hind、Kpn、Sma、Pat、およびSac
であり、その切断点地図を３図に示した。こ
の結果から、3.3Md断片のSac−Kpn領域
におそらく連続して欠失したことが示唆され、
この1.1Mdの断片は前述の酵素のうち、BamH
およびBclの切断部位を示すだけである。

(4) pUB HA81よりhisA遺伝子の一部欠失変異
プラスミドのin vitro造成 pUB HA81DNA0.3μｇを２ケ所切断する制
限酵素Hindにより完全に切断したのち、常
法に従つてT4リガーゼにて連結した。この連
結DNAを用いて枯草菌UOT278株をKm耐性
に形質転換した。得られた形質転換体のもつプ
ラスミドを簡易検出法にて調べたところ、
pUB HA81より小さなプラスミドが検出され
た。このプラスミドは分子量が約5.6Mdであつ
てpUB HA81のHind断片約0.7Mdが欠失し
たものであり、またhisA遺伝子の一部を欠失
していた。

ハイブリツドプラスミド（pUB HA31）によ
る形質転換 (1) プロトプラストの調製 B.subtilis61242株（Rec⁺、hisA）を30℃
で一昼夜TBAB培地で前培養した。この前培
養した菌を、50mlのPennassay培地（Difco製）
にOD₆₆₀＝0.05程度になるように接種し、37℃
でOD₆₆₀＝0.4程度まで振とう培養した。遠心し
たのち、菌体を５mlのSMMP液に懸濁させて、
滅菌した三角コルベンに移した。これに最終濃
度が１mg／mlになるようにリゾチームを加え、
37℃でゆつくりと振とうしながら培養した。３
時間後、水平ローターで遠心して集菌し、この
菌体を５mlのSMMP液で洗滌後、再遠心し、
菌体を５mlのSMMP液に懸濁させて、ブロト
プラストを得た。

(2) 形質転換およびカナマイシン耐性株の選択前記で得られた枯草菌のプロトプラスト0.5
mlに0.1μｇのpUB HA31DNA（DNA溶液と２
倍濃度のSMMPの等量混合物）を加え、直ち
に1.5mlの40％ポリエチレングリコール（平均
分子量6000）を加えた。２分後、５mlの
SMMP液で希釈して、水平遠心した。菌体を
１mlのSMMP液に懸濁させ、30℃で90分間振
とう培養した。得られた菌体を、150μｇ／ml
のカナマイシンを含むDM3再生培地に接種し、
37℃で48時間培養して、カナマイシン耐性株を
選択した。カナマイシン耐性株は10⁶／μｇ
DNA以上の出現を示した。

(3) 多重組込み体の選択上記で得られたカナマイシン耐性株を10μ
ｇ／mlのカナマイシンを含むＬ培地〔Bacto−
trypton（Difco製）10ｇ、yeast extract（Difco
製）５ｇ、NaCl5ｇ、グルコース２ｇ、
NaOHにて中性に調整〕に接種し、37℃で対
数増殖期後期まで培養物を100倍希釈後、その
0.02〜0.1mlをヒスチジンを含まない最小寒天
培地に接種し、37℃で48時間培養して、His⁺
株、つまり多重組込み体を選択した（その頻度
は、生菌数に対し１×10^-3〜10^-2であつた）。

(4) 多重組込みの確認 (1) Southern解析により証明前述の方法で得られた枯草菌61242株の
Rec⁺His⁺組換え体より常法により宿主染色
体を分離精製し、このDNA1μｇを0.8％アガ
ロース電気泳動にかけたのち、変性処理して
ニトロセルローズフイルターに移した。
〔α³²P〕dATPでニツクトランスレートした
pUB110DNAをプローブとしてこのフイル
ターにハイブリダイズさせ、そのオートラジ
オグラムを撮つた。Rec⁺His⁺組換え体は、
明らかに宿主染色体領域にハイブリダイズ活
性が見られ、プラスミドの宿主染色体への組
込みを示した（第４図）。

(2) デンシトリメトリーによる多重度の定量前記のHis⁺組換え体宿主染色体をEcoRI
またはBglで切断すると、プラスミド
DNA自体を上記酵素により切断した場合に
生じるバンドに比べて、切断パターン写真で
極めて濃く生じた。

このことは、プラスミドが同一方向に連な
つて多重に組込まれたことを示している。
His⁺組換え体宿主染色体の1μｇDNAを常法
に従つて上記制限酵素２単位で各々完全に切
断し、0.8％アガロース電気泳動に供し、そ
のネガフイルムについて600nｍでトレース
した。ピークの面積比から、約40個のプラス
ミドが組込まれていることが示された（第５
図）。

(3) Hind切断による多重度の定量 pUB HA31は、Hindにより切断されな
い。従つて、約40個のプラスミドが組込まれ
ると、宿主染色体のこの部分はHindによ
り全く切断を受けない大きなDNA断片とな
る。そこで、His⁺組換え体宿主染色体
DNA1μｇを常法に従つて２単位のHindに
より完全に切断し、0.8％アガロース電気泳
動に供した。分子量マーカーとして分子量既
知のDNAとして枯草菌ビルレントフアージ
φ1DNA（105Md）を用いたが、これよりも
大きなDNA断片が生じていることが検出さ
れた（第６図）。pUB HA31の分子量が
4.1Mdであるから、少なくとも26個以上のプ
ラスミドが連なつた形で染色体に組込まれた
ことを示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明ハイブリツドプラスミド
pUB HA31その他のEcoRによる切断パターン
を示すアガロース電気泳動図である。１……未切断プラスミドpUB110、２……未切
断プラスミドpUB HA31、３……未切断プラス
ミドpUB HA81、４……EcoR切断プラスミド
pUB110、５……EcoR切断プラスミドpUB
HA31、６……EcoR切断プラスミドpUB
HA81、７……3.3Md hisA断片（φ105d hisA⁺
より調製）、８……分子量マーカー（φ105EcoR
切断産物）。第２図は、pUB HA31の形質転換活性を示す
ものであつて、Ａはアガロース電気泳動図、Ｂお
よびＣはこの電気泳動図上の泳動距離とHis⁺形
質転換体およびMet⁺His⁺形質転換体の出現頻度
を示すグラフである。第３図は、各種プラスミド
切断地図を示すものである。第４図は、His⁺組
換体宿主染色体のSouthern解析を示すものであ
る。Ａ……各DNAのアガロース電気泳動パターン、
Ｂ…… ³²PでニツクトランスレートしたpUB110
をプローブとしてのＡのオートラジオグラム、１
……pUB HA31DNA、２……168Ti染色体
DNA、３……BD366（pUB110）染色体DNA、
４……61242pUB HA31His⁺組換体染色体
（Rec⁺）、５……UOT279pUB HA31His⁺組換体
染色体（recE4）。第５図は、His⁺組換体染色体DNAの切断パタ
ーンのデンシトメトリーの結果を示すものであ
る。図中およびは、電気泳動における負極お
よび陽極をそれぞれ示す。第５図はBg1
digestに関するものであり、はEcoRI digestに
関するものである。第６図は、His⁺組換体宿主
染色体DNAのHind切断パターンを示すアガロ
ース電気泳動図である。Ｃ２……His⁺組換体染色体Hind切断、φ…
…φ1DNA（105Md）。

Claims

【特許請求の範囲】１宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝
子部分と相同なDNAの断片と、枯草菌で増殖可
能なプラスミド由来のDNAの断片と、を含み、
上記の第一のDNAは宿主染色体の相同部分との
組換えによる相補性によりヒスチジン非要求性遺
伝子を形成するものであり、宿主枯草菌で増殖可
能なものである、ことを特徴とする、ハイブリツ
ドプラスミド。２宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝
子部分とこれと相同なハイブリツドプラスミドの
DNAの両遺伝子はヒスチジン要求性に関する正
常な遺伝子から導びかれたものでありかつ相互に
異なる部位に変異を持つものである、特許請求の
範囲第１項記載のハイブリツドプラスミド。３分子量が4.1メガダルトンであるpUB
HA31DNAである、特許請求の範囲第１項記載
のハイブリツドプラスミド。４宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝
子部分と相同なDNAの断片と、枯草菌で増殖可
能なプラスミド由来のDNAの断片と、を含み、
上記の第一のDNAは宿主染色体の相同部分との
組換えによる相補性によりヒスチジン非要求性遺
伝子を形成するものであり、宿主枯草菌で増殖可
能なものであるところのハイブリツドプラスミド
を、組換能を有する宿主枯草菌に形質転換法によ
つて導入して、宿主枯草菌の染色体に該ハイブリ
ツドプラスミドが多重に組込まれた染色体組込み
形質転換体を生成させ、この染色体組み込み形質
転換体を選別することを特徴とする、枯草菌の
DNA組換法。５染色体組込み形質転換体の選別を、ハイブリ
ツドプラスミドの第一のDNAと宿主染色体の
hisA^-遺伝子部分との組換えによる相補性によつ
て染色体組込み形質転換体に発現される形質によ
つて行なう、特許請求の範囲第４項記載の枯草菌
のDNA組換法。６宿主となるべき枯草菌の染色体のhisA^-遺伝
子部分とこれと相同なハイブリツドプラスミドの
DNAの両遺伝子は相互に異なる部位に変異を持
つことによつてそれぞれヒスチジン要求性に関す
る正常な遺伝子から導びかれたものであり、染色
体組込み形質転換体の選別に利用するべき形質が
栄養非要求性である、特許請求の範囲第５項記載
の枯草菌のDNA組換法。７プラスミド由来のDNAの断片が、染色体組
込み形質転換体の選別に利用できる形質とは異な
る形質を発現させる遺伝子を有するものであり、
染色体組込み形質転換体の選別に先立つてこの後
者の形質によつて形質転換体をこれを非形質転換
体から選別する一次選別に付す、特許請求の範囲
第４〜６項のいずれかに記載の枯草菌のDNA組
換法。８一次選別後に形質転換体を増殖させ、その
後、染色体組込み形質転換体に発現された形質に
よつてその形質転換体を選別する、特許請求の範
囲第７項記載の枯草菌のDNA組換法。