JPH025398B2

JPH025398B2 -

Info

Publication number: JPH025398B2
Application number: JP8172487A
Authority: JP
Inventors: Kazuya Mochizuki; Hidekatsu Maeda; Yukinae Yamazaki; Hideo Suzuki
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1987-04-02
Filing date: 1987-04-02
Publication date: 1990-02-01
Also published as: JPS63248393A

Description

[Detailed description of the invention]

(1) 産業上の利用分野本発明は、微生物を利用して光学的に活性なＤ
−ピペコリン酸を調製する方法に関する。Ｄ−ピペコリン酸は中枢神経系のシナプス伝達
の調節などそれ自身も薬理活性を有する他、いく
つかの抗生物質やアルカロイド系薬剤の修飾用合
成中間体としての利用が期待されている。 (2) 従来の技術しかしながら、Ｄ−ピペコリン酸を安価、且つ
大量に供する方法は未だ確立していない。光学分
割剤を用いてＤ・Ｌピペコリン酸からＤ−ピペコ
リン酸を得る方法が現在のところ採られている
が、光学分割剤が高価であり、且つその供給に難
点がある為、この方法ではＤ−ピペコリン酸を安
価、且つ大量に供することはできない。ちなみ
に、この従来法で得たＤ−ピペコリン酸の価格は
Ｄ・Ｌ−ピペコリン酸の100倍にも及び、このよ
うな状況はＤ−ピペコリン酸の工業的利用は言う
までもなく、用途開発をも制約している。これに
対しＤ・Ｌ−ピペコリン酸は安価であり、且つ大
量に製造されているので、このＤ・Ｌ−ピペコリ
ン酸からＤ−ピペコリン酸を簡便に分離すること
ができれば、Ｄ−ピペコリン酸を安価、且つ大量
に製造することが可能になる。 (3) 発明が解決しようとする問題点そこで、本発明者は、このような従来法に代わ
るＤ−ピペコリン酸の製法を探索した結果、Ｄ−
ピペコリン酸資化能を実質的に欠損し、Ｌ−ピペ
コリン酸資化能を有する微生物を新たに自然界よ
り分離し、このような微生物をＤ・Ｌ−ピペコリ
ン酸に作用させると、Ｌ−ピペコリン酸はこれら
の微生物により資化され消滅するのに対し、Ｄ−
ピペコリン酸は資化されることなく残在すること
を見出した。本発明は、この知見に基づき、完成されたもの
である。すなわち、本発明はミクロコツカス属、クルシ
ア属、シユードモナス属、アルカリゲネス属より
選ばれ、且つＤ−ピペコリン酸資化能が実質搭に
欠損し、Ｌ−ピペコリン酸資化能を有する微生物
をＤ・Ｌ−ピペコリン酸含有培地で培養し、Ｄ−
ピペコリン酸を分割・採取することを特徴とする
Ｄ−ピペコリン酸の製造法に関するものである。 (4) 問題点を解決するための手段本発明に適用される微生物は、Ｌ−ピペコリン
酸は活発に資化するが、Ｄ−ピペコリン酸は全く
資化しないか、或いは極めて弱くしか資化しない
微生物であれば、いずれでも用いることができ
る。このような微生物を例示すれば本発明者らが
自然界から分離したミクロコツカスNo.7B菌、ク
ルシア属No.113B菌、シユードモナスNo.B520B菌、
アルカリゲネス属No.309B1菌が挙げられる。以下これらの微生物の菌学的性質は以下に示す
とおりである。 Γミクロコツカス属No.7B菌形態 ●直径1μｍ程度の球菌。しばしば４個で１
クラスターを形成。（肉汁寒天上で生育し
た菌体） ●グラム染色：陽性 ●運動性：なし ●芽胞形成能：なし次の各培地における生育状態肉汁寒天平板培養生育は、良好。コロニーの形状は、円
形。菌層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。
色素生産性、無し。肉汁寒天斜面培地生育は、良好。生育状態は、拡布状。菌
層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。色素生
産性、無し。肉汁液体培養生育は認められるが、濁りは生ぜず、菌
体は沈澱する。色素生産性、無し。肉汁ゼラチン穿刺培養生育は不良。ゼラチン液化は、認められ
ない。リトマス・ミルク培地をアルカリ性にする。凝固、液化
は、認められない。次の生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地および
Christensenの培地で陰性 (9) 無機窒素の利用硝酸塩：陰性、アンモニウム塩：陽性 (10) 色素の生成：認められない。 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲 ●温度：20〜40℃●PH：５〜８ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：酸化的 (17) 下記の糖類からの酸およびガスの生成Ｌ−アラビノース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−キシロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−グルゴース：酸を生成。ガスは生
成せず。Ｄ−マンノース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−フラクトース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−ガラクトース：酸、ガスとも生成
せず。麦芽糖：酸、ガスとも生成せず。シヨ糖：酸、ガスとも生成せず。乳糖：酸、ガスとも生成せず。トレハロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−ソルビツト：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−マンニツト：酸、ガスとも生成せ
ず。イノシツト：酸、ガスとも生成せず。グリセリン：酸、ガスとも生成せず。デンプン：酸、ガスとも生成せず。以上の特徴はR.E.Buchanan、N.E.Gibbons編
バージエイズマニユアルオブデタミネイテ
イブバクテリオロジイ８版「Bergey′s manual
of Determinative Bacteriology 8th Edition」
及び長谷川武治編「微生物の同定と分類、第１
版」（学会出版センター、1981年）に記載のミク
ロコツカス属（Micrococcus属）の特徴と一致し
ている。本菌をミクロコツカス属No.7Bと命名し、
FERM Ｐ−No.9311として寄託されている。 Γクルシア属No.113B菌形態 ●直径1μｍ長さ2μｍ程度の桿菌。（肉汁寒天
上で生育した菌体） ●グラム染色：陽性 ●運動性であり、複数の周鞭毛を有する。 ●芽胞形成能：なし次の各培地における生育状態肉汁寒天平板培養生育は、良好。コロニーの形状は、円
形。菌層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。
色素生産性、無し。肉汁寒天斜面培地生育は、良好。生育形状は、拡布状。菌
層の隆起は、偏平状。色素生産性、無し。肉汁液体培養生育は認められるが、濁りは生ぜず、菌
体は沈澱する。色素生産性、無し。肉汁ゼラチン穿刺培養生育は不良。ゼラチン液化は、認められ
ない。リトマス・ミルク培地をアルカリ性にする。凝固、液化
は、認められない。培地は粘稠になる。次の生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地および
Christensenの培地で陰性 (9) 無機窒素の利用硝酸塩：陰性、アンモニウム塩：陰性 (10) 色素の生成：認められず。 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陰性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲 ●温度：10〜40℃●PH：５〜８ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：グルコ−スから酸を生
成せず。 (17) 下記の糖類からの酸およびガスの生成Ｌ−アラビノース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−キシロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−グルコース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−マンノース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−フラクトース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−ガラクトース：酸、ガスとも生成
せず。麦芽糖：酸、ガスとも生成せず。シヨ糖：酸、ガスとも生成せず。乳糖：酸、ガスとも生成せず。トレハロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−ソルビツト：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−マンニツト：酸、ガスとも生成せ
ず。イノシツト：酸、ガスとも生成せず。グリセリン：酸、ガスとも生成せず。デンプン：酸、ガスとも生成せず。以上の特徴は前記の２書に記載されているクル
シア属（Kurthia属）の特徴と一致する。本菌を
クルシア属No.113Bと命名し、FERM Ｐ−No.9312
として寄託されている。 Γシユウドモナス属No.520B菌形態 ●直径約1μｍ、長さ約2μｍ程度の桿菌。（肉
汁寒天上で生育した菌体） ●グラム染色：陰性 ●運動性であり、一本の極鞭毛を有する。 ●芽胞形成能：なし。次の各培地における生育状態肉汁寒天平板培養生育は、良好。コロニーの形状は、円
形。菌層の隆起は偏平状。光沢は鈍光。色
素生産性、無し肉汁寒天斜面培地生育は、良好。生育形状は、拡布状。菌
層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。色素生
産性、無し。肉汁液体培養生育は良好。均一に濁り、菌体の沈澱も
認められる。色素生産性、無し。肉汁ゼラチン穿刺培養生育は良好。ゼラチン液化は、認められ
ない。リトマス・ミルク培地を酸性にする。凝固が、認められ
る。次の生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陽性 (2) 脱窒反応：陽性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陽性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地および
Christensenの培地で陽性 (9) 無機窒素の利用硝酸塩：陽性、アンモニウム塩：陽性 (10) 色素の生成：認められず。 (11) ウレアーゼ：陽性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲 ●温度：10〜40℃●PH：５〜８ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：酸化的 (17) 下記の糖類からの酸およびガスの生成Ｌ−アラビノース：酸を生成。ガス
は、生成せず。Ｄ−キシロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−グルゴース：酸を生成。ガスは生
成せず。Ｄ−マンノース：酸を生成。ガスは生
成せず。Ｄ−フラクトース：酸を生成。ガスは
生成せず。Ｄ−ガラクトース：酸を生成。ガスは
生成せず。麦芽糖：酸、ガスとも生成せず。シヨ糖：酸を生成。ガスは生成せず。乳糖：酸を生成。ガスは生成せず。トレハロース：酸を生成。ガスは生成
せず。Ｄ−ソルビツト：酸を生成。ガスは生
成せず。Ｄ−マンニツト：酸を生成。ガスは生
成せず。イノシツト：酸を生成。ガスは生成せ
ず。グリセリン：酸と生成。ガスは生成せ
ず。デンプン：酸を生成。ガスは生成せ
ず。以上の特徴は前記の２書に記載されているシユ
ードモナス属（Pseudomonas属）の特徴と一致
している。本菌をシユードモナス属520Bと命名
し、FERM Ｐ−No.9313として寄託されている。 Γアルカリゲネス属No.309B1 形態 ●直径約1μｍ、長さ約2μｍ程度の桿菌。（肉
汁寒天上で生育した菌体） ●グラム染色：陰性 ●運動性であり、複数の周鞭毛を有する。 ●芽胞形成能：なし。次の各培地における生育状態肉汁寒天平板培養生育は、良好。コロニーの形状は、円
形。菌層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。
色素生産性、無し。肉汁寒天斜面培地生育は、良好。生育形状は、拡布状。菌
層の隆起は、偏平状。光沢は鈍光。色素生
産性、無し。肉汁液体培養生育は認められるが、濁りは生ぜず、菌
体は沈澱する。色素生産性、無し。肉汁ゼラチン穿刺培養生育は不良。ゼラチン液化は、認められ
ない。リトマス・ミルク培地をアルカリ性にする。凝固、液化
は、認められない。次の生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：陰性 (2) 脱窒反応：陰性 (3) MRテスト：陰性 (4) VPテスト：陰性 (5) インドールの生成：陰性 (6) 硫化水素の生成：陰性 (7) デンプンの加水分解：陰性 (8) クエン酸の利用：Koserの培地および
Christensenの培地で陽性 (9) 無機窒素の利用硝酸塩：陰性、アンモニウム塩：陽性 (10) 色素の生成：認められず。 (11) ウレアーゼ：陰性 (12) オキシダーゼ：陽性 (13) カタラーゼ：陽性 (14) 生育の範囲 ●温度：20〜40℃●PH：５〜８ (15) 酸素に対する態度：好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト：グルコースより酸を生
成せず。 (17) 下記の糖類からの酸およびガスの生成Ｌ−アラビノース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−キシロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−グルコース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−マンノース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−フラクトース：酸、ガスとも生成
せず。Ｄ−ガラクトース：酸、ガスとも生成
せず。麦芽糖：酸、ガスとも生成せず。シヨ糖：酸、ガスとも生成せず。乳糖：酸、ガスとも生成せず。トレハロース：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−ソルビツト：酸、ガスとも生成せ
ず。Ｄ−マンニツト：酸、ガスとも生成せ
ず。イノシツト：酸、ガスとも生成せず。グリセリン：酸、ガスとも生成せず。デンプン：酸、ガスとも生成せず。以上の特徴は前記の２書に記載されているアル
カリゲネス属（Alcaligenes属）の特徴と一致し
ている。本菌をアルカリゲネス属No.309B1と命名
し、FERM Ｐ−9314として寄託されている。これらのいずれかの微生物をＤ・Ｌ−ピペコリ
ン酸に作用させることによりＤ−ピペコリン酸が
得られるが、培養及び回収は通常、次の方法が挙
げられることができる。Ｄ・Ｌ−ピペコリン酸の0.1〜30％水溶液に、
窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーンステイープリカー、アンモニア塩類、尿素
等の有機、および無機窒素含有物、その他カリウ
ム塩類、リン酸塩類、マグネシウム塩類、カルシ
ウム塩類等の無機塩類等を補い培地とし、この培
地で前記の微生物を培養する方法である。尚、こ
の場合の培地の組成、及び培養条件には何等限定
はない。Ｄ・Ｌ−ピペコリン酸の初期濃度と用いる菌株
にもよるが、通常、30〜100時間培養することに
より、培地中のＬ−ピペコリン酸は消費され尽く
し、培養液中にはＤ−ピペコリン酸だけが残存す
るようになる。もう一つの方法は肉汁培地など適当な培地で前
記の微生物を培養し、得られた菌体をPH５〜８に
調整した0.1〜30％のＤ・Ｌ−ピペコリン酸水溶
液に懸濁し、通気しつつ孵置する方法である。PH
調整に用いる試薬には特に限定はない。また、こ
のＤ・Ｌ−ピペコリン酸水溶液に各種無機塩類や
ビタミン類等を添加しても差支えない。この場合
もＤ・Ｌ−ピペコリン酸の初期の濃度と用いる微
生物にもよるが、数時間から数日で菌体懸濁中の
Ｌ−ピペコリン酸は消滅し、Ｄ−ピペコリン酸だ
けが残存するようになる。なお、いずれの場合も培養温度は通常20〜50
℃、好ましくは30℃付近、PHは５〜８、好ましは
７付近により行われる。以上の操作により、Ｄ−ピペコリン酸を含みＬ
−ピペコリン酸を含まない培養液、或いは菌体懸
濁液が得られるので次の回収工程でＤ−ピペコリ
ン酸を回収する。培養液、或いは菌体懸濁液からのＤ−ピペコリ
ン酸は通常の任意の方法で回収できるが一例を挙
げるならば、培養液、或いは菌体懸濁液から遠心
分離等により菌体を除去し、次いでイオン交換等
により脱塩した後、濃縮することにより結晶とし
て回収できる。以下、本発明を実施例により更に詳細に説明す
る。 (4) 実施例ミクロコツカス属No.7B菌（FERM Ｐ−9311）、
クルシア属No.113B菌（FERM Ｐ−9312）、シユ
ードモナス属520B菌（FERM Ｐ−9313）、アル
カリゲネス属309B1菌（FERM Ｐ−9314）とそ
れぞれ１の肉汁培地に接種し、30℃で２日間振
盪培養した菌体を遠心分離により集め、PH7.0に
調整した２％のＤ・Ｌ−ピペコリン酸水溶液100
mlに懸濁し、30℃で40時間振盪した。光学分割カ
ラム（ダイセル化学社製、商品名CHIRALPAK
WH）を用いた高速液体クロマトグラフイーで、
この菌体懸濁液上清を分析したところ、Ｌ−ピペ
コリン酸は検出されずＤ−ピペコリン酸だけが認
められた。この菌体懸濁液から遠心分離により菌
体を除き、菌体懸濁液上清を得た。この上清液を
減圧濃縮し、水を完全に留去し、得られた残留物
よりＤ−ピペコリン酸をエタノールで抽出した。
この抽出液に対し、５容のジエチルエーテルを加
え、室温に１日放置しＤ−ピペコリン酸を析出さ
せた。析出したＤ−ピペコリン酸の結晶を濾取す
ることにより回収した。得られたＤ−ピペコリン
酸をアミノ酸分析システム（島津製作所製、商品
名LC−6A）で分析したところ、いずれの菌株を
用いた場合もピペコリン酸だけが検出された。ま
た、このＤ−ピペコリン酸を前記の光学分割カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフイーで分析し
たところ、いずれの場合もＤ−ピペコリン酸だけ
が検出された。また、このＤ−ピペコリン酸の一
定量を水に溶かし、この水溶液中のピペコリン酸
を前記の高速液体クロマトグラフイー、アミノ酸
分析システム、及びＤ−アミノ酸だけに感応する
Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ法により定量したとこ
ろ、この三つの方法とも同一の値を与えた。以上
の分析により菌体懸濁液から回収した化合物がＤ
−ピペコリン酸であることを確認した。それぞれの菌株についてＤ−ピペコリン酸の回
収率と光学純度を下表に示す。 (1) Industrial application field The present invention utilizes microorganisms to produce optically active D.
- Concerning a method for preparing pipecolic acid. D-pipecolic acid itself has pharmacological activities such as regulating synaptic transmission in the central nervous system, and is also expected to be used as a synthetic intermediate for modifying several antibiotics and alkaloid drugs. (2) Prior Art However, a method for providing D-pipecolic acid inexpensively and in large quantities has not yet been established. Currently, there is a method of obtaining D-pipecolic acid from D.L pipecolic acid using an optical resolution agent, but since the optical resolution agent is expensive and there are difficulties in supplying it, this method - Pipecolic acid cannot be provided cheaply and in large quantities. Incidentally, the price of D-pipecolic acid obtained by this conventional method is 100 times that of D/L-pipecolic acid, and this situation is a constraint not only on the industrial use of D-pipecolic acid but also on its application development. are doing. On the other hand, D-L-pipecolic acid is inexpensive and produced in large quantities, so if D-pipecolic acid can be easily separated from D-L-pipecolic acid, D-pipecolic acid can be produced at low cost. , and can be manufactured in large quantities. (3) Problems to be solved by the invention Therefore, as a result of searching for a method for producing D-pipecolic acid as an alternative to the conventional method, the present inventor discovered that D-
When microorganisms that are substantially deficient in the ability to assimilate pipecolic acid and have the ability to assimilate L-pipecolic acid are newly isolated from nature, and when such microorganisms are allowed to act on D.L-pipecolic acid, L-pipecolic acid is produced. is assimilated by these microorganisms and disappears, whereas D-
It was found that pipecolic acid remained without being utilized. The present invention was completed based on this knowledge. That is, the present invention uses D. Cultured in pipecolic acid-containing medium, D-
The present invention relates to a method for producing D-pipecolic acid, which is characterized by dividing and collecting pipecolic acid. (4) Means for solving the problem The microorganism applied to the present invention actively assimilates L-pipecolic acid, but does not assimilate D-pipecolic acid at all or only weakly assimilates it. Any microorganism can be used. Examples of such microorganisms include Micrococcus No. 7B, Crucia genus No. 113B, Pseudomonas No. B520B, which the present inventors isolated from the natural world.
Examples include Alcaligenes No. 309B1. The mycological properties of these microorganisms are shown below. ΓMicrococcus No.7B Bacteria Morphology ●A coccus with a diameter of approximately 1 μm. often 4 in 1
Form a cluster. (Bacteria grown on broth agar) ●Gram staining: Positive ●Motility: None ●Spore-forming ability: None Growth status in each of the following media: Broth agar plate culture Growth is good. The shape of the colony is circular. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull.
Pigment productivity, none. Growth on gravy agar slant medium is good. The growth condition is spread-like. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull. Pigment productivity, none. Meat juice liquid culture Growth is observed, but turbidity does not occur and the bacterial cells precipitate. Pigment productivity, none. Meat juice gelatin puncture culture Growth is poor. No gelatin liquefaction is observed. Litmus milk makes the medium alkaline. No coagulation or liquefaction was observed. The following physiological properties (1) Nitrate reduction: negative (2) Denitrification reaction: negative (3) MR test: negative (4) VP test: negative (5) Indole formation: negative (6) Hydrogen sulfide formation : Negative (7) Starch hydrolysis: Negative (8) Utilization of citric acid: Koser's medium and
Negative in Christensen's medium (9) Utilization of inorganic nitrogen Nitrate: negative, ammonium salt: positive (10) Pigment formation: not observed. (11) Urease: Positive (12) Oxidase: Negative (13) Catalase: Positive (14) Growth range ●Temperature: 20-40℃ ●PH: 5-8 (15) Attitude towards oxygen: Aerobic (16) O -F test: Oxidative (17) Generation of acid and gas from the following sugars L-arabinose: Neither acid nor gas is generated. D-xylose: Neither acid nor gas is produced. D-glucose: produces acid. No gas is produced. D-mannose: Neither acid nor gas is produced. D-fructose: Neither acid nor gas is produced. D-galactose: Neither acid nor gas is produced. Maltose: Does not produce acid or gas. Sucrose: Does not produce acid or gas. Lactose: Does not produce acid or gas. Trehalose: Neither acid nor gas is produced. D-Sorbit: Neither acid nor gas is produced. D-mannite: Neither acid nor gas was produced. Inosit: Neither acid nor gas is produced. Glycerin: Does not produce acid or gas. Starch: Does not produce acid or gas. The above features can be found in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition, edited by RE Buchanan and NE Gibbons.
of Determinative Bacteriology 8th Edition”
and Takeharu Hasegawa (ed.), “Identification and classification of microorganisms, Vol.
This corresponds to the characteristics of the genus Micrococcus described in ``Version'' (Gakkai Publishing Center, 1981). This bacterium was named Micrococcus No. 7B.
It has been deposited as FERM P-No.9311. Gamma Crucia No. 113B Bacteria Morphology ●A rod with a diameter of 1 μm and a length of approximately 2 μm. (Bacteria grown on broth agar) ●Gram staining: positive ●Motile and has multiple periflagella. ●Spore forming ability: None Growth status in each of the following media: Broth agar plate culture Growth is good. The shape of the colony is circular. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull.
Pigment productivity, none. Growth on gravy agar slant medium is good. The growth shape is spread-like. The ridges of the fungal layer are flat. Pigment productivity, none. Meat juice liquid culture Growth is observed, but turbidity does not occur and the bacterial cells precipitate. Pigment productivity, none. Meat juice gelatin puncture culture Growth is poor. No gelatin liquefaction is observed. Litmus milk makes the medium alkaline. No coagulation or liquefaction was observed. The medium will become viscous. The following physiological properties (1) Nitrate reduction: negative (2) Denitrification reaction: negative (3) MR test: negative (4) VP test: negative (5) Indole formation: negative (6) Hydrogen sulfide formation : Negative (7) Starch hydrolysis: Negative (8) Utilization of citric acid: Koser's medium and
Negative in Christensen's medium (9) Utilization of inorganic nitrogen Nitrate: negative, ammonium salt: negative (10) Pigment formation: Not observed. (11) Urease: Negative (12) Oxidase: Negative (13) Catalase: Positive (14) Growth range ●Temperature: 10~40℃●PH: 5~8 (15) Attitude towards oxygen: Aerobic (16) O -F test: No acid is generated from glucose. (17) Generation of acid and gas from the following sugars L-arabinose: Neither acid nor gas is generated. D-xylose: Neither acid nor gas is produced. D-glucose: Neither acid nor gas is produced. D-mannose: Neither acid nor gas is produced. D-fructose: Neither acid nor gas is produced. D-galactose: Neither acid nor gas is produced. Maltose: Does not produce acid or gas. Sucrose: Does not produce acid or gas. Lactose: Does not produce acid or gas. Trehalose: Neither acid nor gas is produced. D-Sorbit: Neither acid nor gas is produced. D-mannite: Neither acid nor gas was produced. Inosit: Neither acid nor gas is produced. Glycerin: Does not produce acid or gas. Starch: Does not produce acid or gas. The above characteristics match those of the genus Kurthia described in the above two books. This bacterium was named Crucia genus No. 113B and FERM P-No. 9312.
It has been deposited as. Γ Pseudomonas No.520B Bacteria Morphology ● Rod bacterium with a diameter of approximately 1 μm and a length of approximately 2 μm. (Bacteria grown on broth agar) ●Gram staining: negative ●Motile and has one polar flagellum. ●Spore forming ability: None. Growth status on each of the following media: Juicy agar plate culture Growth is good. The shape of the colony is circular. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull. Pigment productivity: None Growth on broth agar slant medium is good. The growth shape is spread-like. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull. Pigment productivity, none. Meat juice liquid culture Growth is good. It becomes uniformly cloudy, and precipitated bacterial cells are also observed. Pigment productivity, none. Meat juice gelatin puncture culture Growth is good. No gelatin liquefaction is observed. Litmus milk makes the medium acidic. Coagulation is observed. The following physiological properties (1) Nitrate reduction: Positive (2) Denitrification reaction: Positive (3) MR test: Negative (4) VP test: Negative (5) Indole production: Negative (6) Hydrogen sulfide production : Negative (7) Starch hydrolysis: Positive (8) Utilization of citric acid: Koser's medium and
Positive in Christensen's medium (9) Utilization of inorganic nitrogen Nitrate: positive, ammonium salt: positive (10) Pigment formation: not observed. (11) Urease: Positive (12) Oxidase: Positive (13) Catalase: Positive (14) Growth range ●Temperature: 10~40℃●PH: 5~8 (15) Attitude towards oxygen: Aerobic (16) O -F test: Oxidative (17) Formation of acids and gases from the following sugars L-arabinose: Forms acids. No gas is produced. D-xylose: Neither acid nor gas is produced. D-glucose: produces acid. No gas is produced. D-mannose: produces acid. No gas is produced. D-fructose: produces acid. No gas is produced. D-galactose: produces acid. No gas is produced. Maltose: Does not produce acid or gas. Sucrose: Produces acid. No gas is produced. Lactose: produces acid. No gas is produced. Trehalose: Produces acid. No gas is produced. D-Sorbit: Generates acid. No gas is produced. D-mannite: produces acid. No gas is produced. Inosites: Produces acid. No gas is produced. Glycerin: produced with acids. No gas is produced. Starch: produces acid. No gas is produced. The above characteristics are consistent with the characteristics of the genus Pseudomonas described in the above two books. This bacterium was named Pseudomonas 520B and has been deposited as FERM P-No.9313. Genus ΓAlcaligenes No.309B1 Morphology ●A bacillus with a diameter of approximately 1 μm and a length of approximately 2 μm. (Bacteria grown on broth agar) ●Gram staining: negative ●Motile and has multiple periflagella. ●Spore forming ability: None. Growth status on each of the following media: Juicy agar plate culture Growth is good. The shape of the colony is circular. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull.
Pigment productivity, none. Growth on gravy agar slant medium is good. The growth shape is spread-like. The ridges of the fungal layer are flat. The luster is dull. Pigment productivity, none. Meat juice liquid culture Growth is observed, but turbidity does not occur and the bacterial cells precipitate. Pigment productivity, none. Meat juice gelatin puncture culture Growth is poor. No gelatin liquefaction is observed. Litmus milk makes the medium alkaline. No coagulation or liquefaction was observed. The following physiological properties (1) Nitrate reduction: negative (2) Denitrification reaction: negative (3) MR test: negative (4) VP test: negative (5) Indole formation: negative (6) Hydrogen sulfide formation : Negative (7) Starch hydrolysis: Negative (8) Utilization of citric acid: Koser's medium and
Positive in Christensen's medium (9) Utilization of inorganic nitrogen Nitrate: negative, ammonium salt: positive (10) Pigment formation: not observed. (11) Urease: negative (12) Oxidase: positive (13) Catalase: positive (14) Growth range ●Temperature: 20-40℃ ●PH: 5-8 (15) Attitude towards oxygen: Aerobic (16) O -F test: No acid produced from glucose. (17) Generation of acid and gas from the following sugars L-arabinose: Neither acid nor gas is generated. D-xylose: Neither acid nor gas is produced. D-glucose: Neither acid nor gas is produced. D-mannose: Neither acid nor gas is produced. D-fructose: Neither acid nor gas is produced. D-galactose: Neither acid nor gas is produced. Maltose: Does not produce acid or gas. Sucrose: Does not produce acid or gas. Lactose: Does not produce acid or gas. Trehalose: Neither acid nor gas is produced. D-Sorbit: Neither acid nor gas is produced. D-mannite: Neither acid nor gas was produced. Inosit: Neither acid nor gas is produced. Glycerin: Does not produce acid or gas. Starch: Does not produce acid or gas. The above characteristics are consistent with the characteristics of the genus Alcaligenes described in the two books mentioned above. This bacterium was named Alcaligenes No. 309B1 and has been deposited as FERM P-9314. D-pipecolic acid can be obtained by allowing any of these microorganisms to act on D.L-pipecolic acid, and the following methods can usually be used for culturing and recovery. In a 0.1 to 30% aqueous solution of D/L-pipecolic acid,
Peptone, meat extract, yeast extract, as a nitrogen source
A culture medium supplemented with organic and inorganic nitrogen-containing substances such as corn staple liquor, ammonia salts, and urea, and inorganic salts such as potassium salts, phosphates, magnesium salts, and calcium salts is used to culture the above-mentioned microorganisms. This is the way to do it. In this case, there are no limitations on the composition of the medium and the culture conditions. Depending on the initial concentration of D/L-pipecolic acid and the strain used, usually by culturing for 30 to 100 hours, L-pipecolic acid in the medium is completely consumed, leaving only D-pipecolic acid in the culture solution. will remain. Another method is to culture the above-mentioned microorganisms in a suitable medium such as a meat broth medium, suspend the resulting microorganisms in a 0.1-30% aqueous solution of D/L-pipecolic acid adjusted to pH 5-8, and aerate the cells. This is a method of incubation. PH
There are no particular limitations on the reagents used for adjustment. Further, various inorganic salts, vitamins, etc. may be added to this D/L-pipecolic acid aqueous solution. In this case as well, depending on the initial concentration of D/L-pipecolic acid and the microorganism used, L-pipecolic acid in the bacterial cell suspension will disappear in a few hours to several days, leaving only D-pipecolic acid remaining. become. In both cases, the culture temperature is usually 20-50℃.
C., preferably around 30.degree. C., and a pH of 5 to 8, preferably around 7. By the above operations, L containing D-pipecolic acid
- Since a culture solution or bacterial cell suspension containing no pipecolic acid is obtained, D-pipecolic acid is collected in the next collection step. D-pipecolic acid from a culture solution or bacterial cell suspension can be recovered by any conventional method, but for example, bacterial cells can be removed from the culture solution or bacterial cell suspension by centrifugation, etc. Then, after desalting by ion exchange or the like, it can be recovered as crystals by concentrating. Hereinafter, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples. (4) Example Micrococcus No. 7B (FERM P-9311),
Crucia genus No. 113B (FERM P-9312), Pseudomonas genus 520B (FERM P-9313), and Alcaligenes genus 309B1 (FERM P-9314) were each inoculated into a broth medium and shaken at 30°C for 2 days. The cultured bacterial cells were collected by centrifugation and added to a 2% aqueous D/L-pipecolic acid solution adjusted to pH 7.0.
ml and shaken at 30°C for 40 hours. Optical resolution column (manufactured by Daicel Chemical Co., Ltd., trade name: CHIRALPAK)
High performance liquid chromatography using WH)
When this bacterial cell suspension supernatant was analyzed, L-pipecolic acid was not detected and only D-pipecolic acid was observed. The cells were removed from this cell suspension by centrifugation to obtain a supernatant of the cell suspension. The supernatant was concentrated under reduced pressure to completely remove water, and D-pipecolic acid was extracted from the resulting residue with ethanol.
Five volumes of diethyl ether was added to this extract, and the mixture was left at room temperature for one day to precipitate D-pipecolic acid. The precipitated D-pipecolic acid crystals were collected by filtration. When the obtained D-pipecolic acid was analyzed using an amino acid analysis system (manufactured by Shimadzu Corporation, trade name LC-6A), only pipecolic acid was detected in all strains used. Further, when this D-pipecolic acid was analyzed by high performance liquid chromatography using the optical resolution column described above, only D-pipecolic acid was detected in each case. Further, a certain amount of this D-pipecolic acid was dissolved in water, and pipecolic acid in this aqueous solution was quantified using the above-mentioned high performance liquid chromatography, amino acid analysis system, and D-amino acid oxidase method that is sensitive only to D-amino acids. However, all three methods gave the same value. The compound recovered from the bacterial cell suspension through the above analysis was
- Confirmed to be pipecolic acid. The recovery rate and optical purity of D-pipecolic acid for each strain are shown in the table below.

【表】 (5) 発明の効果本発明は、Ｄ−ピペコリン酸を安価、且つ大量
に供給することを可能にすることができる。[Table] (5) Effects of the Invention The present invention makes it possible to supply D-pipecolic acid at low cost and in large quantities.

Claims

[Claims]

1 selected from the genus Micrococcus, genus Crucia, genus Pseudomonas, and genus Alcaligenes, and D-
D- characterized in that a microorganism substantially deficient in pipecolic acid assimilation ability and having L-pipecolic acid assimilation ability is cultured in a medium containing D.L pipecolic acid, and D-pipecolic acid is divided and collected. Method for producing pipecolic acid.