【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明は固定化酵母を用いてアルコールを発
酵生産する方法において固定化酵母を充填した反
応器内が雑菌で汚染された場合に、固定化酵母を
反応器から抜き出すことなく簡便な手段で雑菌を
除去する方法に関するものである。
発酵生産法においては雑菌汚染が常に問題にな
つており、固定化酵母を用いたアルコール発酵に
おいても例外ではない。酵母を固定化しないで行
なう通常の回分培養法においては、発酵終了後発
酵液を発酵槽から抜き出すところから装置全体を
加熱殺菌等によつて容易に殺菌することができ
る。しかしながら、固定化酵母を用いる場合には
反応器内に常に固定化酵母があるところから、こ
の固定化酵母を死滅させずに雑菌のみを死滅させ
ることは容易ではない。そこで、従来反応器内が
雑菌で汚染された場合には、装置を解体して全体
を殺菌し、固定化酵母を新たに製造して反応器内
に充填してから運転を再開していたが、この作業
は大変な作業であり、労力の面のみならず操業時
間が減ることによる生産性の低下の面でも大きな
問題であつた。特にアルコール発酵の場合には安
価に大量生産する必要があるところからこの雑菌
汚染対策は固定化酵母を用いる方法の死命を制す
るものであつた。
本発明者らは雑菌を反応器内から簡単に除去す
る手段を開発すべく種々検討の結果、糖蜜または
糖汁の存在下で殺菌剤を作用させれば固定化酵母
を生存させたまま雑菌のみを選択的に死滅させう
ることを見出し、これに基いて本発明を完成する
に至つた。
すなわち本発明は、固定化酵母を充填した反応
器に基質溶液を導入してアルコール発酵を行なわ
せる方法において、該反応器が雑菌で汚染された
際に精蜜または糖汁と殺菌剤とを該反応器内に導
入することを特徴とする雑菌の除去方法に関する
ものである。
酵母はアルコール生産能を有するものであれば
特に限定されるものではなく、例としてはサツカ
ロミセス・フオルモセンシス（Saccharomyces
formosensis）IFO0216、同セレビシエ（S.
cerevisiae）協会７号菌（大蔵省醸造試験所）、
同カールスベルゲンシス（S.carlsbergensis）、同
ロブスタス（S.robustus）、同ロキシイ（S.
rouxii）などを挙げることができる。
酵母の固定化方法も特に限定されるものではな
く例えば多孔性ガラスビーズなどに吸着させる方
法であつてもよいが、本発明の方法にはゲル包括
法が好適であり、特に、少量の酵母菌体を担体に
固定化後この固定化物を栄養培地中で培養して酵
母を増殖させたいわゆる固定化増殖酵母を用いる
のがよい。担体の種類は特に限定されるものでは
なく、例えばポリアクリルアミド、ポリビニルア
ルコール、寒天、カラギーナン、コラーゲンなど
を用いることができる。特公昭56−43234号、特
公昭56−43235号、特開昭56−131391号などによ
つて開示されている光硬化性樹脂を用いて酵母を
固定化する方法は本発明の方法に好適である。光
硬化性樹脂の例としては無水マレイン酸などの不
飽和多塩基酸と多価アルコールとのポリエステル
類、ポリエチレングリコールとメタアクリル酸と
のポリエステル類、不飽和ウレタン類、非イオン
性不飽和アクリル樹脂、アニオン性不飽和アクリ
ル樹脂、カチオン性不飽和アクリル樹脂不飽和ポ
リビニルアルコール、不飽和ポリアミド類、不飽
和エポキシ類などを挙げることができる。固定化
方法としては、これらのいずれかの光硬化性樹脂
と前記酵母菌体の懸濁液とを混合し、これに250
〜600nｍの活性光線を照射して得られた固定化
物を球状、膜状、シート状、管状など任意の形状
にすればよい。
固定化酵母を充填する反応器、発酵原料である
基質溶液および発酵条件は従来と同様でよく、例
えば糖蜜を糖濃度として５〜20ｇ／dl程度、そし
て硫安を0.01〜１ｇ／dl程度含む基質溶液を反応
器内に滞留時間が２〜10時間程度になるように通
液し、反応器内の温度を25〜40℃程度、好ましく
は28〜35℃程度に保てばよい。糖蜜以外のものを
原料とするときは原料に応じて適宜ビタミン類、
有機栄養物、無機塩などを補充すればよい。
このようなアルコール発酵生産方法において反
応器内が雑菌で汚染された際に糖蜜または糖汁と
殺菌剤とを該反応器内に導入するところに本発明
の特徴がある。
反応器が雑菌で汚染されているか否かは、反応
器から排出される発酵液を平板培養しあるいは顕
微鏡で観察することによつて確認できる。また、
アルコール生産量の低下によつて推定することも
できる。
糖蜜とは糖汁から精製糖を取得するに至る各工
程の母液をいい、原料の種類、工程の種類を問わ
ない。例としては、ケインモラセス、ビートモラ
セス、ハイテストモラセスなどを挙げることがで
きる。糖汁とはさとうきび、ビード等を搾つて得
た原糖液の意である。
殺菌剤は水溶性のものがよく、例えば亜硫酸、
メタ重亜硫酸カリウム、次亜塩素酸、次亜塩素酸
ナトリウム、ペニシリン、クロラムフエニコー
ル、エリスロマイシン、ロイコマイシン、カナマ
イシン、セフアメジン、アンピシリンなどを挙げ
ることができる。
糖蜜または糖汁と殺菌剤とは予め混合して所定
濃度の溶液としてから反応器内に導入してもよ
く、これらを別々に反応器内に所定濃度になるよ
うに加えて反応器内で液循環あるいは通気等で混
合してもよい。
反応器内における糖蜜および糖汁の糖濃度とし
て0.5〜10ｇ／dl程度、好ましくは１〜５ｇ／dl
程度がよい。一方、殺菌剤の濃度はその種類およ
び糖蜜および糖汁の糖濃度によつて異なるが、例
えばメタ重亜硫酸カリウムで糖濃度が２ｇ／dlの
場合には50〜1000ppm程度が適当であり、次亜塩
素酸ソーダで糖濃度が２ｇ／dlの場合には100〜
500ppm程度が適当である。その他の殺菌剤を用
いる場合には予め試験を行なつて雑菌が死滅しか
つ固定化酵母が死滅しない濃度範囲を確認してか
ら実施すればよい。
次に、固定化酵母、固定していない酵母（生酵
母）、および雑菌について殺菌剤および糖蜜の濃
度を変えて殺菌力を測定した結果を示す。
この実験に用いた酵母はサツカロミセス・フオ
ルモセンシスIFO0216であり、固定化方法は実施
例１と同様にして行なつた。雑菌は固定化酵母を
用いてアルコールを連続的に発酵生産している装
置の反応器から得たものを用いた。実験方法とし
ては、固定化酵母および生酵母については糖蜜を
糖濃度として20ｇ／dlそして硫安を0.1ｇ／dl含
む溶液で30℃で24時間予備培養したものを用い、
雑菌についてはグルコース1.0ｇ／dl、酵母エキ
ス1.0ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／
dlおよび麦芽エキス0.3ｇ／dlを含有するPH6.0の
培地でやはり30℃で24時間培養したものを用い
た。そして、各菌とも下表に示す糖蜜濃度および
殺菌剤濃度の液に107〜108個／mlになるように添
加して30℃で３時間静置した。その後、それらの
液を0.8ｇ／dl食塩水で希釈し、その0.2mlを、生
酵母の場合にはグルコース1.0ｇ／dl、酵母エキ
ス1.0ｇ／dl、ペプトン1.0ｇ／dl、麦芽エキス0.3
ｇ／dl、NaCl0.5ｇ／dl、および寒天2.0ｇ／dlを
含有するPH6.0の培地上に、そして雑菌の場合に
は上記培地にカビサイジン0.005ｇ／dlを添加し
た培地上にそれぞれ撤いて30℃で48時間培養し、
発生したコロニー数を計数して生菌数を求めた。
一方、固定化酵母の場合には、固定化酵母シート
の一定量を乳鉢で粗砕してからホモジナイザーで
微粉砕し、これを0.8ｇ／dl食塩水で希釈して生
酵母と同様にして生菌数を測定した。
得られた結果を下表に示す。
This invention provides a method for producing alcohol by fermentation using immobilized yeast, and when a reactor filled with immobilized yeast becomes contaminated with bacteria, the bacteria can be removed by a simple means without removing the immobilized yeast from the reactor. It relates to a method of removal. Bacterial contamination is always a problem in fermentation production methods, and alcohol fermentation using immobilized yeast is no exception. In a conventional batch culture method in which yeast is not immobilized, the entire apparatus can be easily sterilized by heat sterilization or the like from the point where the fermented liquid is extracted from the fermenter after completion of fermentation. However, when immobilized yeast is used, since the immobilized yeast is always present in the reactor, it is not easy to kill only the miscellaneous bacteria without killing the immobilized yeast. Therefore, in the past, if the inside of the reactor became contaminated with bacteria, the equipment was dismantled, the entire device was sterilized, and immobilized yeast was newly produced and filled into the reactor before operation was resumed. This work is very difficult and is a big problem not only in terms of labor but also in terms of reduced productivity due to reduced operating time. Particularly in the case of alcoholic fermentation, since it is necessary to mass-produce at low cost, this countermeasure against bacterial contamination was the life-or-death of the method using immobilized yeast. The present inventors have conducted various studies to develop a means to easily remove contaminant bacteria from inside the reactor, and have found that if a bactericide is applied in the presence of molasses or sugar juice, contaminant bacteria can be removed while the immobilized yeast remains alive. The present invention was completed based on the discovery that it is possible to selectively kill the following. That is, the present invention provides a method for carrying out alcoholic fermentation by introducing a substrate solution into a reactor filled with immobilized yeast, and when the reactor is contaminated with bacteria, it is possible to mix nectar or sugar juice with a bactericide. This invention relates to a method for removing germs, which is characterized by introducing them into a reactor. Yeast is not particularly limited as long as it has the ability to produce alcohol; examples include Saccharomyces formocensis.
formosensis) IFO0216, S. cerevisiae (S.
cerevisiae) Association No. 7 (Ministry of Finance Brewing Laboratory),
S.carlsbergensis, S.robustus, and S.roxyi.
rouxii). The method of immobilizing yeast is not particularly limited, and may be, for example, a method of adsorbing it to porous glass beads, etc., but the gel entrapment method is suitable for the method of the present invention. It is preferable to use so-called immobilized propagated yeast, which is obtained by immobilizing the yeast on a carrier and then culturing the immobilized product in a nutrient medium to proliferate the yeast. The type of carrier is not particularly limited, and for example, polyacrylamide, polyvinyl alcohol, agar, carrageenan, collagen, etc. can be used. The method of immobilizing yeast using a photocurable resin disclosed in Japanese Patent Publication No. 56-43234, Japanese Patent Publication No. 56-43235, Japanese Patent Publication No. 56-131391, etc. is suitable for the method of the present invention. be. Examples of photocurable resins include polyesters of unsaturated polybasic acids such as maleic anhydride and polyhydric alcohols, polyesters of polyethylene glycol and methacrylic acid, unsaturated urethanes, and nonionic unsaturated acrylic resins. , anionic unsaturated acrylic resins, cationic unsaturated acrylic resins, unsaturated polyvinyl alcohols, unsaturated polyamides, unsaturated epoxies, and the like. The immobilization method involves mixing any of these photocurable resins with the yeast cell suspension, and adding 250
The immobilized product obtained by irradiation with active light of ~600 nm may be shaped into any shape such as a sphere, a film, a sheet, or a tube. The reactor filled with immobilized yeast, the substrate solution as a fermentation raw material, and the fermentation conditions may be the same as conventional ones, such as a substrate solution containing molasses with a sugar concentration of about 5 to 20 g/dl and ammonium sulfate about 0.01 to 1 g/dl. is passed through the reactor so that the residence time is about 2 to 10 hours, and the temperature inside the reactor is maintained at about 25 to 40°C, preferably about 28 to 35°C. When using ingredients other than molasses, add vitamins, etc. as appropriate depending on the raw material.
You can supplement with organic nutrients, inorganic salts, etc. A feature of the present invention is that in such an alcohol fermentation production method, when the inside of the reactor is contaminated with bacteria, molasses or sugar juice and a disinfectant are introduced into the reactor. Whether or not the reactor is contaminated with germs can be confirmed by culturing the fermentation liquid discharged from the reactor on a plate or observing it with a microscope. Also,
It can also be estimated by the decrease in alcohol production. Molasses refers to the mother liquor used in each process to obtain refined sugar from sugar juice, regardless of the type of raw material or the type of process. Examples include cane molasses, beet molasses, hightest molasses, etc. Sugar juice refers to the raw sugar solution obtained by squeezing sugar cane, beads, etc. The disinfectant should preferably be water-soluble, such as sulfurous acid,
Potassium metabisulfite, hypochlorous acid, sodium hypochlorite, penicillin, chloramphenicol, erythromycin, leucomycin, kanamycin, cefamedine, ampicillin, and the like can be mentioned. The molasses or sugar juice and the disinfectant may be mixed in advance to form a solution with a predetermined concentration and then introduced into the reactor, or they may be added separately into the reactor to a predetermined concentration and the solution is dissolved in the reactor. Mixing may be carried out by circulation or ventilation. The sugar concentration of molasses and sugar juice in the reactor is about 0.5 to 10 g/dl, preferably 1 to 5 g/dl.
Good condition. On the other hand, the concentration of the disinfectant varies depending on its type and the sugar concentration of molasses and sugar juice, but for example, when the sugar concentration is 2 g/dl in potassium metabisulfite, approximately 50 to 1000 ppm is appropriate; When the sugar concentration is 2g/dl with sodium chlorate, it is 100~
Approximately 500ppm is appropriate. When using other bactericidal agents, a test may be conducted in advance to confirm the concentration range in which germs are killed and immobilized yeast is not killed. Next, we will show the results of measuring the bactericidal power of immobilized yeast, unimmobilized yeast (live yeast), and miscellaneous bacteria by varying the concentrations of the bactericide and molasses. The yeast used in this experiment was Saccharomyces formocensis IFO0216, and the immobilization method was the same as in Example 1. The bacteria used were those obtained from a reactor of a device that continuously ferments and produces alcohol using immobilized yeast. As for the experimental method, immobilized yeast and live yeast were pre-cultured at 30°C for 24 hours in a solution containing molasses with a sugar concentration of 20 g/dl and ammonium sulfate 0.1 g/dl.
Regarding bacteria, glucose 1.0g/dl, yeast extract 1.0g/dl, peptone 1.0g/dl, NaCl 0.5g/dl
A culture medium of pH 6.0 containing 0.3 g/dl and malt extract and cultured at 30° C. for 24 hours was used. Then, each of the bacteria was added to a solution having a molasses concentration and a bactericide concentration shown in the table below at a concentration of 10 7 to 10 8 bacteria/ml and allowed to stand at 30°C for 3 hours. Then, dilute those solutions with 0.8 g/dl saline, and add 0.2 ml of the solution to 1.0 g/dl of glucose, 1.0 g/dl of yeast extract, 1.0 g/dl of peptone, and 0.3 g/dl of malt extract for fresh yeast.
g/dl, NaCl 0.5 g/dl, and agar 2.0 g/dl on a PH6.0 medium, and in the case of undesirable bacteria, the above medium was added with 0.005 g/dl of moldicidin. Incubate at 30℃ for 48 hours,
The number of viable bacteria was determined by counting the number of colonies that developed.
On the other hand, in the case of immobilized yeast, a certain amount of immobilized yeast sheet is coarsely crushed in a mortar, then finely crushed in a homogenizer, diluted with 0.8 g/dl saline, and grown in the same manner as fresh yeast. The number of bacteria was measured. The results obtained are shown in the table below.
【表】【table】
【表】
糖蜜あるいは糖汁と殺菌剤は気泡などの付着し
て溶液の接触しない部分などを生じないように反
応器の下部から導入するがよい。導入後は必要に
より液を循環させるなどして撹拌しながら雑菌を
死滅させるのに必要な時間放置する。この時間は
殺菌剤の種類、濃度、糖蜜および糖汁の濃度等に
よつて異なるが、30分間〜３時間程度にするのが
操作上便宜である。
その後は、この糖蜜または糖汁と殺菌剤とを含
有する溶液を反応器から抜き出し、必要により基
質溶液あるいはその他の培地溶液を反応器内に導
入して酵母を増強培養してから通常の運転に復帰
すればよい。
本発明の方法によつて、反応装置を雑菌除去の
ために解体するという煩瑣な作業を行なう必要が
なくなり、アルコール製造コストを大巾に引下げ
ることができた。
以下、実施例を示す。
実施例 １
ポリエチレングリコール、イソホロンジイソシ
アネート、およびメタアクリル酸−２−ヒドロキ
シエチルからなる平均分子量約5000のウレタン化
プレポリマーにサツカロミセス・フオルモセンシ
スIFO0216の懸濁液を加え、さらに光増感剤とし
てベンゾインエチルエーテルを加えて、これらを
ホモジナイザーで均一に分散した。この分散液に
主波長360nｍの低圧水銀灯を約３分間照射射し
て肉厚約１mmの膜状の固定化酵母を製造した。
この固定化酵母を矩冊形に切断して、縦・横と
も90mmで高さが700ｍの角筒形の槽にスペーサー
を介して並べ、この槽を４段に連結したものを反
応器１基とし、３基の反応器を直列に連結したも
のを反応器として用いた。
この反応器に、糖蜜を糖濃度として20ｇ／dlそ
して硫安0.1ｇ／dlを含む基質溶液を反応器内の
滞留時間が５時間になるように通液し、通気を行
ないながら30℃でアルコールを連続生産させた。
そして毎日１回、末端の反応器から流出してくる
アルコール含有液を前述のカビサイジンを添加し
た雑菌用の合成培地に撤いて培養し、雑菌の発生
の有無を監視していたところ350時間目に雑菌が
発生したことを発見した。そこで、反応器より反
応液を抜き取り、塩素濃度として100ppmの次亜
塩素酸ソーダ溶液30を反応器の下部から導入し
て抜き出す洗浄操作を３回行ない、反応器内に糖
濃度が２ｇ／dlの糖蜜液を張込み、続いて次亜塩
素酸ソーダを塩素濃度として200ppmになるよう
に加えた。30℃で２時間程液循環を行なつてから
この液を抜きだし、糖濃度20ｇ／dlの糖蜜および
0.1ｇ／dlの硫安を含む基質溶質を張込んで30℃
に保つて通気を行なう増強培養を４回繰返し、そ
の後定常運転に復帰させた。
この殺菌処理を行なう直前の反応器流出液はア
ルコール濃度が7.2ｇ／dlであり、雑菌数が４×
108個／mlであつたが、この処置後の反応器流出
液はアルコール濃度が7.7ｇ／dlであり、雑菌数
は０個／mlになていつた。
実施例 ２
サツカロミセス・フオルモセンシスIFO0216の
かわりにサツカロミセス・セレビシエ協会７号菌
を用いて実施例１と同様に固定し、この固定化酵
母を実施例１と同じ反応器に装着して同様にアル
コール発酵生産を行なつていたところ、生産開始
後400時間目に反応器内に雑菌が発生しているこ
とが確認された。
そこで反応器より反応液を抜き取り、SO2濃度
として200ppmのメタ重亜硫酸カリウム液で実施
例１と同様にして３回洗浄し、反応器に糖濃度と
して５ｇ／dlの糖蜜液を張込み、SO2として
500ppmになるようにメタ重亜硫酸カリウムを加
えた。30℃で６時間液循環を行なつてからこの液
を抜き出し、実施例１と同様にして定常運転に復
帰させた。
この殺菌処置を行なう直前の反応器流出液はア
ルコール濃度が7.4ｇ／dlであり、雑菌数が５×
107個／mlであつたが、この処理後の反応器流出
液はアルコール濃度が7.9ｇ／dlであり、雑菌数
は０個／mlになつていた。[Table] Molasses or sugar juice and sterilizer should be introduced from the bottom of the reactor to prevent air bubbles from adhering to areas that are not in contact with the solution. After introduction, the liquid is circulated and stirred if necessary, and left for a period of time necessary to kill germs. Although this time varies depending on the type and concentration of the disinfectant, the concentration of molasses and sugar juice, etc., it is convenient for operation to set it to about 30 minutes to 3 hours. Thereafter, the solution containing the molasses or sugar juice and the fungicide is extracted from the reactor, and if necessary, a substrate solution or other medium solution is introduced into the reactor to enhance yeast culture before normal operation begins. All you have to do is come back. The method of the present invention eliminates the need for the troublesome work of disassembling the reaction apparatus to remove contaminants, making it possible to significantly reduce alcohol production costs. Examples are shown below. Example 1 A suspension of Satucharomyces formocensis IFO0216 was added to a urethanized prepolymer of polyethylene glycol, isophorone diisocyanate, and 2-hydroxyethyl methacrylate with an average molecular weight of about 5000, and benzoin ethyl ether was added as a photosensitizer. were added and uniformly dispersed using a homogenizer. This dispersion was irradiated with a low-pressure mercury lamp with a main wavelength of 360 nm for about 3 minutes to produce a film-like immobilized yeast with a thickness of about 1 mm. This immobilized yeast is cut into rectangular shapes and arranged in a rectangular cylindrical tank with a length and width of 90 mm and a height of 700 m via spacers, and these tanks are connected in four stages to form one reactor. A reactor consisting of three reactors connected in series was used. A substrate solution containing molasses with a sugar concentration of 20 g/dl and ammonium sulfate 0.1 g/dl was passed through the reactor so that the residence time in the reactor was 5 hours, and alcohol was added at 30°C with ventilation. Continuous production.
Then, once a day, the alcohol-containing liquid flowing out from the end reactor was removed to a synthetic medium for bacteria containing the above-mentioned moldicidin and cultured, and the presence or absence of bacteria was monitored, and at 350 hours, It was discovered that germs were present. Therefore, the reaction liquid was extracted from the reactor, and a washing operation was performed three times in which a sodium hypochlorite solution with a chlorine concentration of 100 ppm was introduced from the bottom of the reactor and extracted, and the sugar concentration in the reactor was 2 g/dl. Molasses solution was poured in, and then sodium hypochlorite was added to give a chlorine concentration of 200 ppm. After circulating the liquid at 30°C for about 2 hours, the liquid was extracted, and molasses with a sugar concentration of 20 g/dl and
Filled with a substrate solute containing 0.1 g/dl ammonium sulfate and heated at 30°C.
Enhancement culture was repeated four times with aeration while maintaining the temperature, and then normal operation was resumed. The alcohol concentration of the reactor effluent immediately before this sterilization treatment was 7.2 g/dl, and the number of bacteria was 4×.
However, after this treatment, the alcohol concentration of the reactor effluent was 7.7 g/dl, and the number of miscellaneous bacteria had decreased to 0 bacteria/ml. Example 2 Saccharomyces cerevisiae association No. 7 bacteria was used instead of S. formocensis IFO0216 to immobilize it in the same manner as in Example 1, and this immobilized yeast was installed in the same reactor as in Example 1 to produce alcohol by fermentation in the same manner. During this process, it was confirmed that bacteria had grown inside the reactor 400 hours after the start of production. Therefore, the reaction solution was extracted from the reactor, washed three times with a potassium metabisulfite solution with an SO 2 concentration of 200 ppm in the same manner as in Example 1, and the reactor was filled with a molasses solution with a sugar concentration of 5 g/dl, and the SO 2 concentration was 200 ppm. as 2
Potassium metabisulfite was added to give a concentration of 500 ppm. After the liquid was circulated at 30°C for 6 hours, the liquid was extracted and normal operation was resumed in the same manner as in Example 1. The alcohol concentration of the reactor effluent immediately before this sterilization treatment was 7.4 g/dl, and the number of bacteria was 5x.
However, the alcohol concentration of the reactor effluent after this treatment was 7.9 g/dl, and the number of miscellaneous bacteria was 0.