JPH02673B2 - - Google Patents
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Description
本発明は固相免疫試験用試薬に関する。
固相免疫試験は、周知のように、たとえば粒径
３〜10mm程度のポリスチレンビーズ（小球）のよ
うな固体支持物（担体）に抗体又は抗原を吸着さ
せた試薬上で抗原抗体反応を行ない、反応後固体
支持物を取り出して固体支持物上の抗体又は抗原
の検出やその活性の定量等を行なうものであり、
抗原抗体反応に伴なうラテツクスの凝集を利用し
たラテツクス凝集法とは本質的に異なる。 以下肝炎の抗原、抗体の検出及び定量を例に説
明するが、本発明は勿論これに限定されるもので
はない。 肝炎Ａは普通２乃至６週間の短期潜伏期、おだ
やかな前徴および比較的おだやかな臨床的病状を
特徴とする。この病気は一般に汚染された食物お
よび液体により伝染するが、また系統的接種によ
つても感染するとされている。肝炎Ａは従来“伝
染性肝炎”とよばれていた。米国において一般に
主として肝炎Ａと思われる非−Ｂビールス性肝炎
の報告例は年間50000を超え、実際の米国内事例
は1200000位多いと推定される。 現在便利な肝炎Ａ抗原（HAVAg）又はその抗
体（アンチ−HAV）の特殊試験法がないので、
診断は発病の時点又は原因、患者の病歴、肝臓機
能試験および肝炎Ｂ感染の徴候のないことと共に
臨床的症状によらなければならない。 最近の次の２発見はこの罹病又は徴候を示す特
殊試験の開発を促進したものである。肝炎Ａ研究
用動物型決定の主要努力は1973年キヌザルおよび
後にチンプスが肝炎Ａビールス伝染病（HAV）
に感染し易いという発見および1973年フアインス
トンらによる肝炎Ａと結合した直径27mmのビール
ス様粒子の発見によつて最高点に達した。免疫電
子顕微鏡法（IEM）を用いてフアインストンら
は急性肝炎Ａをもつ患者の糞便抽出液中にこの粒
子を認め、これらは患者の感染前血清によつてで
なく同じ患者の恢瘉期血清によつて凝集されると
示した。同じHAV粒子は続いて感染霊長類の血
清および肝臓中に確認された。 この初めの苦心の生物学的方法およびIEM法
につづいて間もなくHAAgおよびアンチ−HAV
の検出の為のより実際的免疫学的方法が発見され
た。プロボストらは全量固定化試験を発表しその
アンチ−HAV検出効果を証明した。ミユーラー
らおよびモリツグは主としてアンチ−HAV検出
に応用できる敏感な免疫瘉着試験（IAHA）を発
表した。ホリンガーらおよびパーセルらは生物学
的試験体中のHAVAgおよびアンチ−HAVの双
方の検出に非常に敏感な放射線免疫試験（RIA）
法を発表している。アンチ−HAVに対する
IAHAおよびRIA試験は実験室に応用するに最も
有用な２方法と思われる。デイーンスタークらは
IAHAとRIAの比較研究をし２方法が敏感性と特
異性においてよく匹敵することを発見している。
更に他の研究はこの発見を実証したが、RIAは
IAHAによつて検出されたものの他にアンチ−
HAVに特有の他の初期抗体を検出するのである
（プラドレーらのJ.Clin.Microbiol.５、521−530
（1977））。 肝炎Ｂ伝染病は一般に血液製品又は針の様な汚
染器具によつて伝染するが、また糞便−口関係に
よつても感染する。従来肝炎Ｂ伝染病は６週間乃
至６ケ月の潜伏期を伴なうとされていた。しかし
現近２週間程度の短期潜伏期が報告されている。
この病気はおだやか又は無症候であるが、もし徴
候があれば発病は特に烈しい。前徴には関節痛、
関節炎、発疹、発熱、食慾不振、疲労および黄疸
を伴なう又は伴なわない掻痒床がある。 少なくとも２つの明瞭な抗原−抗体系、即ち表
面（HBsAg：アンチ−HBs）と芯（HBcAg：ア
ンチ−HBc）が肝炎Ｂと連合する。22nｍ小球お
よび直径22nｍで長さは種々の長管体として血液
中に発見される肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）は肝
炎Ｂビールスの外被蛋白質を表わすと信じられ
る。DNAおよびDNAポリメラーゼを含む42nｍ
粒子は伝染性ビールス（デイン粒子）を表わすと
思われる。清浄剤中でデイン粒子は26nｍ電子濃
密芯、HBcAgに分解する。後者は血清肝炎に罹
つた患者の烈しい感染段階時の肝細胞核中に見ら
れる。したがつてビールス性肝炎Ｂをもつた患者
は蛋白質外被表面抗原（アンチ−HBs）および蛋
白質芯（アンチ−HBc）に対する抗体を生成する
と期待できる。 アンチ−HBcは露出後しばしば抗原血液（HBs
Ag）を伴なつて肝機能障害の高さでまたアンチ
−HBsの発現前長く12−20週間現われる。アンチ
−HBcは一般にHBsAgの長期循環を行ない、ア
ンチ−HBcがビールスの活性応答に応じて生成さ
れることを示唆している。 HBsAg、アンチ−HBsおよびアンチ−HBcは
単独で血清中にあるか又は個々の試料中一緒に共
存している。３種ともすべて肝炎Ｂビールス伝染
病の経過を判断するに重要である。 肝炎Ｂの診断はまた免疫拡散又は寒天−ゲル拡
散法、向流電気泳動法、全量固定法、ヘンマググ
ルチオネーシヨン（hemmagglutination）およ
び放射線免疫試験の様な種々の試験を包含してい
るのである。 肝炎ＡおよびＢの抗原および抗体検出に選ばれ
る診断法はその簡便性と敏感性の理由で固相放射
線免疫試験（RIA）である。この方法は殆んどの
免疫試験に使われる結合免疫反応体と非結合のも
のとを簡単迅速に分離できる。一般肝炎診断用固
相RIAの欠点はしかし肝炎免疫反応体が固体物質
に直接又は間接に被覆された場合それが比較的不
安定であつたことである。 ガリソンらの米国特許第3790663号には、固相
RIA中で使用した抗原を検出するための試薬が開
示されている。彼等の技術は有機重合体を抗血清
で被覆して空気乾燥し、乾燥していない新しく調
製した抗血清で被覆した試薬に匹敵しうる抗原用
に魅力のある貯蔵安定性の試薬を作ることを包含
している。 そしてガリソンらは抗原の検出に便利な固体支
持物につけた抗体について報告している。本発明
は不活性非懸濁性固体支持物に抗原又は抗体を吸
着させて後、これを糖含有溶液に浸漬し、次に該
固体支持物を糖含有溶液から分離し、これを非凍
結状態で乾燥せしめることを特徴とする固相免疫
試験用試薬の製造法を提供するものであり、この
試薬は何ケ月間も安定である。本発明試薬の貯蔵
安定性は免疫反応体で被覆された固相を新しくつ
くつて使う必要をなくし、したがつて日常臨床測
定における実際の固相免疫試験における使用を可
能にする。 本発明は抗原および抗体の検出および測定用免
疫試験に有用な貯蔵安定性試薬に関する。この試
薬は理想的に直接又は間接に抗原又は抗体で被覆
されておりまた貯蔵安定性を賦与する様糖衣で安
定化されている固体支持物より成る。 固体支持物に抗原又は抗体を間接応用するには
一般に固体支持物を予め抗原又は抗体で被覆し対
応する抗体又は抗原の付着を可能にさせる方法が
ある。例えば固体支持物を最終的に肝炎Ａ抗原で
被覆しようとするならば支持物を先づ肝炎Ａ抗体
で被覆すればよい。 固体支持物に抗原又は抗体を直接又は簡接いず
れかでつけるには、抗体の結合能力又は抗原のア
ンチジエニシテイ（antigenicity）のいずれかを
保存することが望ましい。本発明法は糖衣をつけ
ることによつてむき出しの免疫吸着媒の結合能力
又はアンチジエニシテイを保つ方法を与える。 本発明は抗原および抗体が直接又は間接に固相
物質につけられた場合におこる安定性問題を解決
したのである。むき出しの抗体又は抗原は数時間
でその結合能力又はアンチジエニシテイを失な
い、対応する抗体又は抗原の検出用試験に本質的
に使用できないことが認められている。この問題
解決の１方法は被覆固体支持物を緩衝された塩溶
液中に貯蔵して湿潤又は湿気状態に保つことであ
つた。これは欲求およびアンチジエニシテイを保
つに適当な方法であるが、この環境を維持する不
便と経費は容易に明白であろう。 抗体の検出用免疫試験において抗体に対し親和
力をもつ抗原は扱かい易い固体支持物につけられ
る。もしそれらが適当な濃度とするに適した純粋
状態で得られるならば、抗原は直接固体支持物表
面に添付できる。またある抗原は固体支持物表面
に他のものより容易に付着する。支持物の表面に
対し親和力の小さいものは抗体予備膜を用いて添
付できる。この場合固体支持物を普通の方法によ
り抗体で被覆した後抗原源泉にさらすのである。 一般に抗原はより容易に添付した抗体に付着
し、抗原は抗体膜にさらす前精製の必要はない。
抗原抗体間の親和力は抗原性物質を選択的に確保
する、また抗原を伴なう破片は洗い去ることがで
きる。 本発明における固相支持物質にはガラス、金属
又はプラスチツク等の材料から加工した様な小
球、管、ウエルスおよび棒等がある。固体支持物
は固相免疫試験用の支持物であるから凝集反応に
用いるラテツクス粒子等とはその大きさが本質的
に異なる。つまり反応系の固体支持物の数を容易
にしらべうる程度の大きさを有し、ラテツクス粒
子のように静止反応系で懸濁性であることはな
い。本発明の好ましい実施態様はポリスチレン小
球を用いる。この材料は容易に入手でき、免疫吸
着媒をつけ易くまた取扱い易い。本発明は固体支
持物に添付した免疫吸着媒の安定性を証明するも
ので、固体支持物のみに関するものでないことを
記憶しておくことが大事である。 本発明の範囲内として考えられる免疫吸着媒に
は免疫反応性を示すすべての抗体および抗原を包
含する。本発明の最も好ましい実施態様は免疫吸
着媒として用いられかつ下記に記載の方法により
直接又は間接にポリスチレン小球につけられる肝
炎Ａ又はＢいずれかの抗体および抗原に対して親
和力をもつ抗原又は抗体を特徴づける。 本発明の範囲内であると予定している糖衣には
１糖類、２糖類および多糖類がある。下記実施例
には蔗糖の特殊効果を示しているが、他の糖類も
調合され、抗原被覆支持物に使われまた欲求およ
びアンチジエニシテイの保存に対し効果あるとわ
かつている。例えば次の糖溶液がつくられた： 表 りん酸塩で緩衝された塩溶液
（PBS）中の％ キシリツト 10 乳 糖 10 葡萄糖 10 マンニツト 10 PBSソルビツト 10 デキストラン 10 肝炎Ａ抗体を予め被覆した後Ａ抗原源泉にさら
したポリスチレン小球をPBS中で３回洗つた。
これを次いで表の調合液中に室温で30分間浸漬
した。PBSのみに浸漬した小球少量を除いて、
他の全小球をとり出し室温で一夜乾燥した。翌朝
小球を37℃の培養器に２時間入れた。各組につい
て３陰性対照試料と３陽性対照試料にラジオラベ
ルした抗体を用いてアンチジエニシテイについて
試験を行なつた。 陰性対照試料の陽性対照試料に対する毎分当り
の平均計数比は小球上に残つている抗原活性を示
す。次表は用いた糖衣の相対効果を示すこれらの
比率である。 表 １ 湿PBS 36.9 ６ デキストリン 26.8 ２ 葡萄糖 32.7 ７ ソルビツト 25.9 ３ 乳 糖 29.8 ８ マンニツト 22.4 ４ 蔗 糖 28.5 ９ 乾燥PBS 7.9 ５ キシリツト 26.8 上表は種々の糖類が被覆に役立ち、抗原をつけ
た固体支持物の活性を保護し保存することを示し
ている。 次の実施例は更に本発明の利用性を示すであろ
う。 実施例 １ アンチ−HAVを含む抗血清をPH9.5の0.01Mト
リス緩衝液で１：500乃至１：6000に稀釈した。
この稀釈液に直径約0.7cmのポリスチレン小球を
加えた。被覆操作は室温で約２時間行なわせた。
次いで小球をトリス緩衝液中で洗い、これを
HAV−Agに対し陽性でありかつ0.3M塩容液で
PH7.5の緩衝液（PBS）とした0.01Mりん酸塩液
で１：５乃至１：100に稀釈した肝臓又は糞便い
ずれかの抽出液に入れた。HAV−Agは使用前普
通の方法でフオルマリンおよび熱処理によつて不
活性化できる。遠心分離による透明化以外HAV
−Ag含有抽出液の精製は必要ない。小球はアン
チ−HAV予備膜によつて小球と結合するHAV
−Agで被覆させた。このHAV−Ag被覆操作は
室温で24時間行なわせた。次いで小球をPBS中
で洗い、小球はその中で安定であり、使用迄貯蔵
した。安定乾燥小球を得る為、PBSで洗つた小
球を室温で約30分間５％蔗糖溶液で被覆した後風
乾した。 −ラベル付き抗原試薬の製造 普通の方法で 125−ラベル付き抗体（アンチ
−HAV）を製造し、PBS、通常人血清２％およ
びトウイーン−200.2％および0.005Mを含む50％
牛胎児血清中に稀釈し45℃で24−48時間培養し
た。56℃の様な高温を用いれば培養は0.5−３時
間に短縮できる。 試験方法 肝炎Ａ抗体（アンチ−HAV）の試験用試料と
しては血清又は再石灰化血漿が好ましい。 肝炎Ａ抗原に対する抗体検出試験は肝炎Ａ抗原
（HAV−Ag）に対する血清アンチ−HAVと放射
性ラベル付きアンチ−HAVとの競合結合の原理
に基づく。試験トレイ中でアンチ−HAV125を
患者の血清と混合した後HAV−Agが結合してい
る安定性固相試薬を加えた。室温で一夜又は45℃
で１時間培養の後洗つて小球の計数比をガンマ放
射線計数管で測定記録した。 設定されたカツト−オフ値よりも高い計数比は
抗体に対し陰性であるが、低い計数比は加えたラ
ジオラベル付き抗体と血清中のインドジエナス
（indogenous）抗体との間の競合結合を示す。ア
ンチ−HAVの存在も患者試料の中和パーセント
を試験対照試料と比較計算して決定できる。50％
カツト−オフ値よりも大きな中和パーセントは上
記したと同じ論理で抗体の存在を示すものであ
る。 実施例 ２ 安定性固相試薬の製造 種々の純度のデイーン粒子調合物を２−メルカ
プトエタノール（0.30−0.75％）および約1.0乃至
2.5％のトリトンＸ−100ノニデツトＰ−40の様な
非イオン性清浄剤と37℃で１時間処理した。この
処理の目的はデイーン粒子の脂肪蛋白質膜をとり
その芯抗原をあらわすにあつた。この処理につい
て上記条件は好ましいが、悪影響なく変えうる。
処理後混合物は緩衝液で、例えば0.001MEDTA
を含む生理学的塩溶液中の0.01Mトリス−HCl
（PH7.1）で適当に稀釈した。この溶液を直ちにプ
ラスチツク又はガラスでつくつた小球、管又はウ
エルスの様な固体表面を被覆するに用いた。この
様につくつたデイン芯（HBcAg）は非常に“べ
たべた”しており、固体表面に容易に吸着する。
デイン粒子の製造が甚しく不純で、多量の外部蛋
白質を含んでいる場合、上記の様にデイン芯と反
応させる前固体をアンチ−HBcで予め被覆する必
要がある。ポリスチレン小球がデイン芯溶液と24
乃至72時間培養された場合この製法ではアンチ−
HBcで予め被覆された小球より只の小球上により
デイン芯があつた、特に低濃度のデイン芯を用い
た場合そうであつた。もしデイン芯が直接固体表
面につけられるならば、被覆用液中の清浄剤濃度
は非常に低くなければならないことが発見されて
いる（0.005％よりも低いとよい）。 得られたHBcAg被覆小球を安定化する為５−
10％蔗糖溶液を用いた。HBcAg小球は上記蔗糖
溶液中室温で約20分間培養した後風乾した。 125−ラベル付き抗体試薬薬製造実施例 HBcAgに対する 125−ラベル付きデイン芯抗
体（アンチ−HBc）を普通の方法で製造し牛胎児
血清50％、再石灰化通常人血漿２％およびトウイ
ーン−20 0.4％を含み、0.04M EDTA緩衝液で
PH7.3とした0.005Mトリス中に稀釈した。 試験方法 血清又は再石灰化した血漿が肝炎Ｂ抗体（アン
チ−HBc）の試験試料として好ましかつた。アン
チ−HBcの検出試験は肝炎Ｂ芯抗原（HBcAg）
を被覆した小球に対する 125−ラジオラベル付
きアンチ−HBcと患者試料中にあるアンチ−HBc
との競合結合の原理に基づくものである。試験ト
レイ中で患者試料を 125−ラジオラベル付きア
ンチ−HBcおよびHBcAgを被覆した小球と共に
室温で約20時間培養した。培養後洗い小球の計数
比を適当なガンマ放射線検出器で測定記録した。
設定したカツト−オフ値より高い計数比は試料中
にアンチ−HBcがないこと又は検出されない程度
のアンチ−HBcのあることを示す設定カツト−オ
フ値より低い計数比は血清中にアンチ−HBcの存
在を示すのである。 肝炎Ｂ表面抗原を固相物質に直接又は間接に被
覆し、またRIAが肝炎Ｂ表面抗原に対する抗体の
為である場合に上記の固相安定化の同じ方法を行
なうことができる。実施例中の２方法は主として
固相に被覆される抗原の純度による。高純度抗原
は抗原に抗体を予め被覆する必要なく直接小球上
に被覆できる。 実施例 ３ アンチ−HBsを含むギアナ豚抗血清をりん酸塩
で緩衝した塩溶液（PBS、0.01Mりん酸ナトリウ
ム、0.15M塩化ナトリウム、PH7.2）中に１：
1750に稀釈した。この液を直径0.64cmのポリスチ
レン小球入りフラスコに加えた。小球を入れたこ
の被覆用液を45℃温浴に入れて45℃に２時間あた
ためた。次いで小球をPBS（これは室温であつ
た）で２回洗つた。次いで２％蔗糖を含むPBS
液を使つて室温で小球を約15分間被被覆し風乾し
た。 この方法を用いて、他の小球を２％乳糖、２％
葡萄糖およびPBS単独に約15分浸漬して同様に
被覆した。小球はすべて風乾した。 実施例 ４ 陰性対照試料、HBcAg／ad抗原をもつ試料お
よびHBsAg／ay抗原をもつ試料上にラジオラベ
ル付抗体を用いて肝炎Ｂ表面抗原検出用放射線免
疫試験を行なつた。抗原含有試料計数の陰性対照
試料のそれに対する比率を種々の糖類で被覆した
ポリスチレン小球について次表に示している。
３〜10mm程度のポリスチレンビーズ（小球）のよ
うな固体支持物（担体）に抗体又は抗原を吸着さ
せた試薬上で抗原抗体反応を行ない、反応後固体
支持物を取り出して固体支持物上の抗体又は抗原
の検出やその活性の定量等を行なうものであり、
抗原抗体反応に伴なうラテツクスの凝集を利用し
たラテツクス凝集法とは本質的に異なる。 以下肝炎の抗原、抗体の検出及び定量を例に説
明するが、本発明は勿論これに限定されるもので
はない。 肝炎Ａは普通２乃至６週間の短期潜伏期、おだ
やかな前徴および比較的おだやかな臨床的病状を
特徴とする。この病気は一般に汚染された食物お
よび液体により伝染するが、また系統的接種によ
つても感染するとされている。肝炎Ａは従来“伝
染性肝炎”とよばれていた。米国において一般に
主として肝炎Ａと思われる非−Ｂビールス性肝炎
の報告例は年間50000を超え、実際の米国内事例
は1200000位多いと推定される。 現在便利な肝炎Ａ抗原（HAVAg）又はその抗
体（アンチ−HAV）の特殊試験法がないので、
診断は発病の時点又は原因、患者の病歴、肝臓機
能試験および肝炎Ｂ感染の徴候のないことと共に
臨床的症状によらなければならない。 最近の次の２発見はこの罹病又は徴候を示す特
殊試験の開発を促進したものである。肝炎Ａ研究
用動物型決定の主要努力は1973年キヌザルおよび
後にチンプスが肝炎Ａビールス伝染病（HAV）
に感染し易いという発見および1973年フアインス
トンらによる肝炎Ａと結合した直径27mmのビール
ス様粒子の発見によつて最高点に達した。免疫電
子顕微鏡法（IEM）を用いてフアインストンら
は急性肝炎Ａをもつ患者の糞便抽出液中にこの粒
子を認め、これらは患者の感染前血清によつてで
なく同じ患者の恢瘉期血清によつて凝集されると
示した。同じHAV粒子は続いて感染霊長類の血
清および肝臓中に確認された。 この初めの苦心の生物学的方法およびIEM法
につづいて間もなくHAAgおよびアンチ−HAV
の検出の為のより実際的免疫学的方法が発見され
た。プロボストらは全量固定化試験を発表しその
アンチ−HAV検出効果を証明した。ミユーラー
らおよびモリツグは主としてアンチ−HAV検出
に応用できる敏感な免疫瘉着試験（IAHA）を発
表した。ホリンガーらおよびパーセルらは生物学
的試験体中のHAVAgおよびアンチ−HAVの双
方の検出に非常に敏感な放射線免疫試験（RIA）
法を発表している。アンチ−HAVに対する
IAHAおよびRIA試験は実験室に応用するに最も
有用な２方法と思われる。デイーンスタークらは
IAHAとRIAの比較研究をし２方法が敏感性と特
異性においてよく匹敵することを発見している。
更に他の研究はこの発見を実証したが、RIAは
IAHAによつて検出されたものの他にアンチ−
HAVに特有の他の初期抗体を検出するのである
（プラドレーらのJ.Clin.Microbiol.５、521−530
（1977））。 肝炎Ｂ伝染病は一般に血液製品又は針の様な汚
染器具によつて伝染するが、また糞便−口関係に
よつても感染する。従来肝炎Ｂ伝染病は６週間乃
至６ケ月の潜伏期を伴なうとされていた。しかし
現近２週間程度の短期潜伏期が報告されている。
この病気はおだやか又は無症候であるが、もし徴
候があれば発病は特に烈しい。前徴には関節痛、
関節炎、発疹、発熱、食慾不振、疲労および黄疸
を伴なう又は伴なわない掻痒床がある。 少なくとも２つの明瞭な抗原−抗体系、即ち表
面（HBsAg：アンチ−HBs）と芯（HBcAg：ア
ンチ−HBc）が肝炎Ｂと連合する。22nｍ小球お
よび直径22nｍで長さは種々の長管体として血液
中に発見される肝炎Ｂ表面抗原（HBsAg）は肝
炎Ｂビールスの外被蛋白質を表わすと信じられ
る。DNAおよびDNAポリメラーゼを含む42nｍ
粒子は伝染性ビールス（デイン粒子）を表わすと
思われる。清浄剤中でデイン粒子は26nｍ電子濃
密芯、HBcAgに分解する。後者は血清肝炎に罹
つた患者の烈しい感染段階時の肝細胞核中に見ら
れる。したがつてビールス性肝炎Ｂをもつた患者
は蛋白質外被表面抗原（アンチ−HBs）および蛋
白質芯（アンチ−HBc）に対する抗体を生成する
と期待できる。 アンチ−HBcは露出後しばしば抗原血液（HBs
Ag）を伴なつて肝機能障害の高さでまたアンチ
−HBsの発現前長く12−20週間現われる。アンチ
−HBcは一般にHBsAgの長期循環を行ない、ア
ンチ−HBcがビールスの活性応答に応じて生成さ
れることを示唆している。 HBsAg、アンチ−HBsおよびアンチ−HBcは
単独で血清中にあるか又は個々の試料中一緒に共
存している。３種ともすべて肝炎Ｂビールス伝染
病の経過を判断するに重要である。 肝炎Ｂの診断はまた免疫拡散又は寒天−ゲル拡
散法、向流電気泳動法、全量固定法、ヘンマググ
ルチオネーシヨン（hemmagglutination）およ
び放射線免疫試験の様な種々の試験を包含してい
るのである。 肝炎ＡおよびＢの抗原および抗体検出に選ばれ
る診断法はその簡便性と敏感性の理由で固相放射
線免疫試験（RIA）である。この方法は殆んどの
免疫試験に使われる結合免疫反応体と非結合のも
のとを簡単迅速に分離できる。一般肝炎診断用固
相RIAの欠点はしかし肝炎免疫反応体が固体物質
に直接又は間接に被覆された場合それが比較的不
安定であつたことである。 ガリソンらの米国特許第3790663号には、固相
RIA中で使用した抗原を検出するための試薬が開
示されている。彼等の技術は有機重合体を抗血清
で被覆して空気乾燥し、乾燥していない新しく調
製した抗血清で被覆した試薬に匹敵しうる抗原用
に魅力のある貯蔵安定性の試薬を作ることを包含
している。 そしてガリソンらは抗原の検出に便利な固体支
持物につけた抗体について報告している。本発明
は不活性非懸濁性固体支持物に抗原又は抗体を吸
着させて後、これを糖含有溶液に浸漬し、次に該
固体支持物を糖含有溶液から分離し、これを非凍
結状態で乾燥せしめることを特徴とする固相免疫
試験用試薬の製造法を提供するものであり、この
試薬は何ケ月間も安定である。本発明試薬の貯蔵
安定性は免疫反応体で被覆された固相を新しくつ
くつて使う必要をなくし、したがつて日常臨床測
定における実際の固相免疫試験における使用を可
能にする。 本発明は抗原および抗体の検出および測定用免
疫試験に有用な貯蔵安定性試薬に関する。この試
薬は理想的に直接又は間接に抗原又は抗体で被覆
されておりまた貯蔵安定性を賦与する様糖衣で安
定化されている固体支持物より成る。 固体支持物に抗原又は抗体を間接応用するには
一般に固体支持物を予め抗原又は抗体で被覆し対
応する抗体又は抗原の付着を可能にさせる方法が
ある。例えば固体支持物を最終的に肝炎Ａ抗原で
被覆しようとするならば支持物を先づ肝炎Ａ抗体
で被覆すればよい。 固体支持物に抗原又は抗体を直接又は簡接いず
れかでつけるには、抗体の結合能力又は抗原のア
ンチジエニシテイ（antigenicity）のいずれかを
保存することが望ましい。本発明法は糖衣をつけ
ることによつてむき出しの免疫吸着媒の結合能力
又はアンチジエニシテイを保つ方法を与える。 本発明は抗原および抗体が直接又は間接に固相
物質につけられた場合におこる安定性問題を解決
したのである。むき出しの抗体又は抗原は数時間
でその結合能力又はアンチジエニシテイを失な
い、対応する抗体又は抗原の検出用試験に本質的
に使用できないことが認められている。この問題
解決の１方法は被覆固体支持物を緩衝された塩溶
液中に貯蔵して湿潤又は湿気状態に保つことであ
つた。これは欲求およびアンチジエニシテイを保
つに適当な方法であるが、この環境を維持する不
便と経費は容易に明白であろう。 抗体の検出用免疫試験において抗体に対し親和
力をもつ抗原は扱かい易い固体支持物につけられ
る。もしそれらが適当な濃度とするに適した純粋
状態で得られるならば、抗原は直接固体支持物表
面に添付できる。またある抗原は固体支持物表面
に他のものより容易に付着する。支持物の表面に
対し親和力の小さいものは抗体予備膜を用いて添
付できる。この場合固体支持物を普通の方法によ
り抗体で被覆した後抗原源泉にさらすのである。 一般に抗原はより容易に添付した抗体に付着
し、抗原は抗体膜にさらす前精製の必要はない。
抗原抗体間の親和力は抗原性物質を選択的に確保
する、また抗原を伴なう破片は洗い去ることがで
きる。 本発明における固相支持物質にはガラス、金属
又はプラスチツク等の材料から加工した様な小
球、管、ウエルスおよび棒等がある。固体支持物
は固相免疫試験用の支持物であるから凝集反応に
用いるラテツクス粒子等とはその大きさが本質的
に異なる。つまり反応系の固体支持物の数を容易
にしらべうる程度の大きさを有し、ラテツクス粒
子のように静止反応系で懸濁性であることはな
い。本発明の好ましい実施態様はポリスチレン小
球を用いる。この材料は容易に入手でき、免疫吸
着媒をつけ易くまた取扱い易い。本発明は固体支
持物に添付した免疫吸着媒の安定性を証明するも
ので、固体支持物のみに関するものでないことを
記憶しておくことが大事である。 本発明の範囲内として考えられる免疫吸着媒に
は免疫反応性を示すすべての抗体および抗原を包
含する。本発明の最も好ましい実施態様は免疫吸
着媒として用いられかつ下記に記載の方法により
直接又は間接にポリスチレン小球につけられる肝
炎Ａ又はＢいずれかの抗体および抗原に対して親
和力をもつ抗原又は抗体を特徴づける。 本発明の範囲内であると予定している糖衣には
１糖類、２糖類および多糖類がある。下記実施例
には蔗糖の特殊効果を示しているが、他の糖類も
調合され、抗原被覆支持物に使われまた欲求およ
びアンチジエニシテイの保存に対し効果あるとわ
かつている。例えば次の糖溶液がつくられた： 表 りん酸塩で緩衝された塩溶液
（PBS）中の％ キシリツト 10 乳 糖 10 葡萄糖 10 マンニツト 10 PBSソルビツト 10 デキストラン 10 肝炎Ａ抗体を予め被覆した後Ａ抗原源泉にさら
したポリスチレン小球をPBS中で３回洗つた。
これを次いで表の調合液中に室温で30分間浸漬
した。PBSのみに浸漬した小球少量を除いて、
他の全小球をとり出し室温で一夜乾燥した。翌朝
小球を37℃の培養器に２時間入れた。各組につい
て３陰性対照試料と３陽性対照試料にラジオラベ
ルした抗体を用いてアンチジエニシテイについて
試験を行なつた。 陰性対照試料の陽性対照試料に対する毎分当り
の平均計数比は小球上に残つている抗原活性を示
す。次表は用いた糖衣の相対効果を示すこれらの
比率である。 表 １ 湿PBS 36.9 ６ デキストリン 26.8 ２ 葡萄糖 32.7 ７ ソルビツト 25.9 ３ 乳 糖 29.8 ８ マンニツト 22.4 ４ 蔗 糖 28.5 ９ 乾燥PBS 7.9 ５ キシリツト 26.8 上表は種々の糖類が被覆に役立ち、抗原をつけ
た固体支持物の活性を保護し保存することを示し
ている。 次の実施例は更に本発明の利用性を示すであろ
う。 実施例 １ アンチ−HAVを含む抗血清をPH9.5の0.01Mト
リス緩衝液で１：500乃至１：6000に稀釈した。
この稀釈液に直径約0.7cmのポリスチレン小球を
加えた。被覆操作は室温で約２時間行なわせた。
次いで小球をトリス緩衝液中で洗い、これを
HAV−Agに対し陽性でありかつ0.3M塩容液で
PH7.5の緩衝液（PBS）とした0.01Mりん酸塩液
で１：５乃至１：100に稀釈した肝臓又は糞便い
ずれかの抽出液に入れた。HAV−Agは使用前普
通の方法でフオルマリンおよび熱処理によつて不
活性化できる。遠心分離による透明化以外HAV
−Ag含有抽出液の精製は必要ない。小球はアン
チ−HAV予備膜によつて小球と結合するHAV
−Agで被覆させた。このHAV−Ag被覆操作は
室温で24時間行なわせた。次いで小球をPBS中
で洗い、小球はその中で安定であり、使用迄貯蔵
した。安定乾燥小球を得る為、PBSで洗つた小
球を室温で約30分間５％蔗糖溶液で被覆した後風
乾した。 −ラベル付き抗原試薬の製造 普通の方法で 125−ラベル付き抗体（アンチ
−HAV）を製造し、PBS、通常人血清２％およ
びトウイーン−200.2％および0.005Mを含む50％
牛胎児血清中に稀釈し45℃で24−48時間培養し
た。56℃の様な高温を用いれば培養は0.5−３時
間に短縮できる。 試験方法 肝炎Ａ抗体（アンチ−HAV）の試験用試料と
しては血清又は再石灰化血漿が好ましい。 肝炎Ａ抗原に対する抗体検出試験は肝炎Ａ抗原
（HAV−Ag）に対する血清アンチ−HAVと放射
性ラベル付きアンチ−HAVとの競合結合の原理
に基づく。試験トレイ中でアンチ−HAV125を
患者の血清と混合した後HAV−Agが結合してい
る安定性固相試薬を加えた。室温で一夜又は45℃
で１時間培養の後洗つて小球の計数比をガンマ放
射線計数管で測定記録した。 設定されたカツト−オフ値よりも高い計数比は
抗体に対し陰性であるが、低い計数比は加えたラ
ジオラベル付き抗体と血清中のインドジエナス
（indogenous）抗体との間の競合結合を示す。ア
ンチ−HAVの存在も患者試料の中和パーセント
を試験対照試料と比較計算して決定できる。50％
カツト−オフ値よりも大きな中和パーセントは上
記したと同じ論理で抗体の存在を示すものであ
る。 実施例 ２ 安定性固相試薬の製造 種々の純度のデイーン粒子調合物を２−メルカ
プトエタノール（0.30−0.75％）および約1.0乃至
2.5％のトリトンＸ−100ノニデツトＰ−40の様な
非イオン性清浄剤と37℃で１時間処理した。この
処理の目的はデイーン粒子の脂肪蛋白質膜をとり
その芯抗原をあらわすにあつた。この処理につい
て上記条件は好ましいが、悪影響なく変えうる。
処理後混合物は緩衝液で、例えば0.001MEDTA
を含む生理学的塩溶液中の0.01Mトリス−HCl
（PH7.1）で適当に稀釈した。この溶液を直ちにプ
ラスチツク又はガラスでつくつた小球、管又はウ
エルスの様な固体表面を被覆するに用いた。この
様につくつたデイン芯（HBcAg）は非常に“べ
たべた”しており、固体表面に容易に吸着する。
デイン粒子の製造が甚しく不純で、多量の外部蛋
白質を含んでいる場合、上記の様にデイン芯と反
応させる前固体をアンチ−HBcで予め被覆する必
要がある。ポリスチレン小球がデイン芯溶液と24
乃至72時間培養された場合この製法ではアンチ−
HBcで予め被覆された小球より只の小球上により
デイン芯があつた、特に低濃度のデイン芯を用い
た場合そうであつた。もしデイン芯が直接固体表
面につけられるならば、被覆用液中の清浄剤濃度
は非常に低くなければならないことが発見されて
いる（0.005％よりも低いとよい）。 得られたHBcAg被覆小球を安定化する為５−
10％蔗糖溶液を用いた。HBcAg小球は上記蔗糖
溶液中室温で約20分間培養した後風乾した。 125−ラベル付き抗体試薬薬製造実施例 HBcAgに対する 125−ラベル付きデイン芯抗
体（アンチ−HBc）を普通の方法で製造し牛胎児
血清50％、再石灰化通常人血漿２％およびトウイ
ーン−20 0.4％を含み、0.04M EDTA緩衝液で
PH7.3とした0.005Mトリス中に稀釈した。 試験方法 血清又は再石灰化した血漿が肝炎Ｂ抗体（アン
チ−HBc）の試験試料として好ましかつた。アン
チ−HBcの検出試験は肝炎Ｂ芯抗原（HBcAg）
を被覆した小球に対する 125−ラジオラベル付
きアンチ−HBcと患者試料中にあるアンチ−HBc
との競合結合の原理に基づくものである。試験ト
レイ中で患者試料を 125−ラジオラベル付きア
ンチ−HBcおよびHBcAgを被覆した小球と共に
室温で約20時間培養した。培養後洗い小球の計数
比を適当なガンマ放射線検出器で測定記録した。
設定したカツト−オフ値より高い計数比は試料中
にアンチ−HBcがないこと又は検出されない程度
のアンチ−HBcのあることを示す設定カツト−オ
フ値より低い計数比は血清中にアンチ−HBcの存
在を示すのである。 肝炎Ｂ表面抗原を固相物質に直接又は間接に被
覆し、またRIAが肝炎Ｂ表面抗原に対する抗体の
為である場合に上記の固相安定化の同じ方法を行
なうことができる。実施例中の２方法は主として
固相に被覆される抗原の純度による。高純度抗原
は抗原に抗体を予め被覆する必要なく直接小球上
に被覆できる。 実施例 ３ アンチ−HBsを含むギアナ豚抗血清をりん酸塩
で緩衝した塩溶液（PBS、0.01Mりん酸ナトリウ
ム、0.15M塩化ナトリウム、PH7.2）中に１：
1750に稀釈した。この液を直径0.64cmのポリスチ
レン小球入りフラスコに加えた。小球を入れたこ
の被覆用液を45℃温浴に入れて45℃に２時間あた
ためた。次いで小球をPBS（これは室温であつ
た）で２回洗つた。次いで２％蔗糖を含むPBS
液を使つて室温で小球を約15分間被被覆し風乾し
た。 この方法を用いて、他の小球を２％乳糖、２％
葡萄糖およびPBS単独に約15分浸漬して同様に
被覆した。小球はすべて風乾した。 実施例 ４ 陰性対照試料、HBcAg／ad抗原をもつ試料お
よびHBsAg／ay抗原をもつ試料上にラジオラベ
ル付抗体を用いて肝炎Ｂ表面抗原検出用放射線免
疫試験を行なつた。抗原含有試料計数の陰性対照
試料のそれに対する比率を種々の糖類で被覆した
ポリスチレン小球について次表に示している。
【表】
表のデータは各種糖類が被覆に役立ち抗体被
覆固体支持物活性の保護保存に役立つことを示し
ている。また表のデータは保護糖衣のない抗体
被覆小球は加熱処理後HBsAg／adおよびHBs
Ag／ay抗原に対する活性が減少しまたその活性
は加熱処理前にさえ減少していることを示してい
る。 実施例 ５ 抗−肝炎Ｂ表面抗原−ペロキシダーゼ結合物を
用いて肝炎Ｂ表面抗原検出用酵素免疫試験を行な
つた。試料は陰性対照試料、HBsAg／ad抗原含
有試料およびHBsAg／ay抗原含有試料であつた。
抗原含有試料の492nｍにおける光学密度から陰
性対照試料のその密度を差引いた差を各種糖類を
被覆したポリスチレン小球について次表に示して
いる。
覆固体支持物活性の保護保存に役立つことを示し
ている。また表のデータは保護糖衣のない抗体
被覆小球は加熱処理後HBsAg／adおよびHBs
Ag／ay抗原に対する活性が減少しまたその活性
は加熱処理前にさえ減少していることを示してい
る。 実施例 ５ 抗−肝炎Ｂ表面抗原−ペロキシダーゼ結合物を
用いて肝炎Ｂ表面抗原検出用酵素免疫試験を行な
つた。試料は陰性対照試料、HBsAg／ad抗原含
有試料およびHBsAg／ay抗原含有試料であつた。
抗原含有試料の492nｍにおける光学密度から陰
性対照試料のその密度を差引いた差を各種糖類を
被覆したポリスチレン小球について次表に示して
いる。
【表】
無糖
蔗糖(水中) 0.513 0.420 0.496 0.374
表のデータは各種糖類が被覆に役立ちまた抗
体被覆固体支持物活性の保護と保存に役立つこと
を示している。また表のデータから保護糖衣の
ない抗体被覆小球はその加熱処理前および後に
HBsAg／ay抗原に対する活性が減少しているこ
とを示している。
蔗糖(水中) 0.513 0.420 0.496 0.374
表のデータは各種糖類が被覆に役立ちまた抗
体被覆固体支持物活性の保護と保存に役立つこと
を示している。また表のデータから保護糖衣の
ない抗体被覆小球はその加熱処理前および後に
HBsAg／ay抗原に対する活性が減少しているこ
とを示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 不活性非懸濁性固体支持物に抗原又は抗体を
吸着させて後、これを糖含有溶液に浸漬し、次に
該固体支持物を糖含有溶液から分離し、これを非
凍結状態で乾燥せしめることを特徴とする固相免
疫試験用試薬の製造法。 ２ 吸着物質が抗原である特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 ３ 抗原が肝炎Ａ抗原、肝炎Ｂ表面抗原、肝炎Ｂ
芯抗原および肝炎ｅ抗原より成る群から選ばれた
ものである特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４ 吸着物質が抗体である特許請求の範囲第１項
に記載の方法。 ５ 抗体が肝炎Ａ抗体、肝炎Ｂ表面抗体、肝炎Ｂ
芯抗体および肝炎ｅ抗体より成る群から選ばれた
ものである特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ６ 固体支持物がビーズ、チユーブ、ウエル又は
ロツドの形状を有するプラスチツク、ガラス又は
金属である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ７ 固体支持物がポリエチレンビーズである特許
請求の範囲第１項に記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88805178A | 1978-03-20 | 1978-03-20 | |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JPH02673B2 true JPH02673B2 (ja) | 1990-01-09 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| DE (1) | DE2910707C2 (ja) |
| ES (1) | ES478800A1 (ja) |
| FR (1) | FR2420762A1 (ja) |
| GB (1) | GB2016687B (ja) |
| IT (1) | IT1113315B (ja) |
| NL (1) | NL7902152A (ja) |
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| JPS56141559A (en) * | 1980-04-04 | 1981-11-05 | Toray Ind Inc | Reagent for immunological inspection |
| GB2107053A (en) * | 1980-06-20 | 1983-04-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| EP0146654A3 (en) * | 1980-06-20 | 1986-08-20 | Unilever Plc | Processes and apparatus for carrying out specific binding assays |
| JPS57208459A (en) * | 1981-06-19 | 1982-12-21 | Eisai Co Ltd | Measuring method using enzyme-labelled antibody and reagent |
| JPS58187861A (ja) * | 1982-04-26 | 1983-11-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 成人型ｔ細胞性白血病関連抗体の測定法 |
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| JPS6035263A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-02-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 不溶性担体に固定化された免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬 |
| EP0133976A3 (de) * | 1983-08-09 | 1986-07-30 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Reagens für Immunverfahren |
| GB2187191B (en) * | 1984-01-30 | 1989-11-01 | Quadrant Bioresources Ltd | Protection of proteins and the like |
| EP0153875A3 (en) * | 1984-03-01 | 1987-06-24 | The State Of Victoria | Enzyme-linked immunosorbent assay method and test kit |
| GB8500698D0 (en) * | 1985-01-11 | 1985-02-13 | Unilever Plc | Preparation of reagents |
| DE3690028C2 (de) * | 1985-01-15 | 1995-05-24 | Cancer Res Inst | Verfahren und Testkit für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper gegen Retroviren |
| GB8500918D0 (en) * | 1985-01-15 | 1985-02-20 | Cancer Res Inst | Viral isolates |
| JPH0779694B2 (ja) * | 1985-07-09 | 1995-08-30 | カドラント バイオリソ−シズ リミテツド | 蛋白質および同類品の保護 |
| JPS6234059A (ja) * | 1985-08-07 | 1987-02-14 | Sankyo Co Ltd | 固相化試薬の安定化剤 |
| DE3856421T2 (de) * | 1987-04-27 | 2000-12-14 | Unilever Nv | Spezifische Bindungstestverfahren |
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| AU609332B2 (en) * | 1988-11-09 | 1991-04-26 | Biotrack, Inc. | Method and composition of stabilizing and solubilizing latex reagents |
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| US5468648A (en) | 1991-05-29 | 1995-11-21 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Interrupted-flow assay device |
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| US5879951A (en) | 1997-01-29 | 1999-03-09 | Smithkline Diagnostics, Inc. | Opposable-element assay device employing unidirectional flow |
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-
1979
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