【発明の詳細な説明】
本発明は、細菌内毒素の検出測定法に用いるこ
とができる新規合成基質に関する。
カブトガニ（Horseshoe crab）の血球抽出液
（アメボサイト・ライセート）が微量の細菌内毒
素と反応してゲル化する現象をもとに細菌内毒素
の微量検出法が開発され、すでに医学、薬学およ
び環境衛生学の分野で使用されている。
本発明は、先に本出願人が開示した「細菌内毒
素の検出測定法」（特願昭52−70335号、特開昭54
−15797号）の発明の原理に基づき、当該発明の
臨床診断領域での実用化を目的とした改良法に使
用しうる新規合成基質に係る。
すなわち、先に開示した測定法の原理は、カブ
トガニのアメボサイト・ライセートもしくはその
中に含まれる酵素前駆体（アミダーゼ前駆体）成
分が、細菌内毒素を含む検体と接触した場合、酵
素前駆体が、内毒素により直ちに化学量論的に活
性化され、一定の化学構造を有する合成基質を特
異的に切断することを利用し、切断されて遊離生
成する残基を吸光光度法にて検出するものであつ
た。
ところで、この方法を用いて細菌内毒素を検出
測定する場合、検体の性質、性状に対応して、検
出測定対象となる遊離生成残基の種類を適宜取捨
選択しなければならない。
近年、エンドトキシン（細菌内毒素）の臨床病
理面の研究がさかんになり、従来から定着してい
る感染巣の明らかな疾患に由来する外因性エンド
トキシ血症及びエンドトキシンシヨツクの病態把
握等を目的として、主として外科領域に於てリム
ラス・アメボサイト・ライセート・テストが利用
されてきた。一方、内科領域においては、肝障害
に及ぼす腸管内グラム陰性細菌内毒素の影響や肝
の細菌内毒素解毒排泄機能等の網内系処理機能の
低下と言つた内因性の内毒素血症が問題となつて
おり、血液凝固線溶系、キニン系、循環系及び免
疫反応系に於て臨床的に内毒素を検出測定するこ
とが必須となつて来ている。
このような臨床診断を目的として、上記細菌内
毒素の測定法を適用する場合、検体試料として患
者体液特に血液、腹水、尿、膵液、脳脊髄液、胆
汁等を用いる。しかし、これら体液は、体液本来
の着色を有していたり、疾病に起因する色素（例
えば、黄疸系濃黄色、溶血による赤色等）を含む
ことがあり、これら色素の妨害により吸光光度法
による検出定量がしばしば困難となる。また、体
液中には、蛍光性を有する物質が多種存在してい
るため、合成基質の測定用残基として蛍光性物質
を選択しても測定の妨害はさけられない。
本発明者らは、上述のごとく前記細菌内毒素の
検出測定法の適用が困難であつた臨床診断用途に
も適応可能な新規合成基質の検索を鋭意検討した
結果、前記難点を解決し本発明に到達した。
すなわち、本発明の目的は、体液自体あるいは
臨床症状に対応して生ずる検体中の色素の光吸収
に妨害されない光吸収領域をもつ測定残基を生ず
る新規合成基質を提供することにあり、本発明の
新規合成基質を用いることにより臨床診断におい
てもより正確に細菌内毒素の検出測定を行うこと
ができる。
本発明は、一般式：
（式中、R1は、Ｌ―アミノ酸残基又はＬ―アミ
ノ酸から成るペプチド残基であつて、Ｎ末端に保
護基を有する残基を表わす。）で示されるカブト
ガニ・アメボサイト・ライセート又は該ライセー
トより分離された酵素前駆体の活性化酵素の合成
基質に関するものである。
本発明の新規合成基質を細菌内毒素の検出測定
に用いるには、本発明の新規合成基質とカブトガ
ニのアメボサイト・ライセート及び該ライセート
より分離された酵素前駆体成分から選ばれる１種
又は２種以上とを細菌内毒素を含む検体に接触さ
せることにより生成したｐ―（Ｎ，Ｎ―ジエチル
アミノ）アニリンを、１―ナフトール―２―スル
ホン酸と酸化カツプリングさせることにより生ず
る縮合物を吸光光度法により検出定量すれば良
く、かかる測定法は、特に体液等臨床診断用途に
好適である。
アメボサイト・ライセートは、カブトガニ血リ
ンパ液中に含まれるアメボサイトを、低張液で処
理することにより得ることができ、LAL―Test
（リムルス・アメボサイト・ライセート・テスト）
用の市販品を購入しても良い。例えば、プレゲル
（帝国臓器）、パイロスタツト（Worthington
Biochem.corp.USA）、パイロテスト（Difco
Lab.USA）、パイロジエント（Mallinckrodt，
Inc.USA）等の商品名のアメボサイト・ライセー
トが知られている。
酵素前駆体成分の分離は、アメボサイト・ライ
セートをカラムクロマトグラフイー、電気泳動
法、エレクトロフオーカツシング、アフイニテイ
クロマトグラフイー等により、精製分離して得る
ことができる。
これらアメボサイト・ライセートもしくは該ラ
イセートより分離される酵素前駆体が細菌内毒素
により活性化を受け活性化酵素となり、式（）
で示されるペプチド性化合物である本発明の合成
基質に特異的に作用する。式中、R1は、例えば
次に示す構造を有するものが挙げられる。
すなわち、Boc―Leu―，Boc―Val―Leu―，
Boc―Ser―，Boc―Val―Ser―，Bz―Leu―，
Bz―Val―Leu―，Bz―Ser―，Bz―Val―Ser
―，（式中、Bocはtert―ブトキシカルボニル基、
Bz―はベンゾイル基を表わす）等である。
式（）で表わされる合成基質はいずれも新規
物質であり、ｐ―（Ｎ，Ｎ―ジエチルアミノ）ア
ニリンがR1―Gly―Arg―で示されるペプチド性
残基中のArgのＣ末端とアニリド結合により連結
したものであるが、前記活性化酵素の作用を受け
て、このアニリド結合が容易に酵素化学的に水解
されてｐ―（Ｎ，Ｎ―ジエチルアミノ）アニリン
（以下DEAAと略記する）を遊離する。遊離した
DEAAは510nmと550nmの可視部に弱い吸収を有
し、淡い桃色を呈するが、体液の色調に妨害され
るため、吸光分析の対象としては好ましくない。
DEAAはカツプラーとして１―ナフトール―
２―スルホン酸を共存する系で酸化縮合させれば
次式を主反応とする縮合生成物の濃青色色調を呈
す。
この縮合物は675nmに最大吸収を有するので吸
光光度法により検出定量を行うことが出来る。ま
た体液等には同類色調の吸収が無いので、細菌内
毒素の存在を何ら妨害されることなく、明瞭に検
出測定出来る。
本発明の式（）で示されるペプチド性新規基
質を用いることにより、臨床検査に供される試料
としての体液中の細菌内毒素を、体液本来の色調
や疾病の症状に応じた黄疸系濃黄色、溶血による
赤色等の妨害色調を回避し本来体液には無い青色
系色調乃至これに対応する光吸収を利用して測定
するため、正確に細菌内毒素を検出測定出来る。
以下調製例および実施例、試験例、比較例によ
り本発明をより具体的に説明する。
調製例 １
アメボサイト・ライセートの調製
特公昭51−40131号に準じ日本産カブトガニ
Tachypleus tridentatus（体重約２Kg程度）から
厳重に汚染を避けて、約100ml程度の血リンパ液
を採取する。遠心分離によりアメボサイトを分離
し、３％塩化ナトリウム溶液で洗浄しアメボサイ
ト・ペレツトを得る。このアメボサイト・ペレツ
トに緩衝液（tris―HCl，0.05M：CaCl2，
0.001M：NaCl，0.15M：PH7.2）を原血リンパ液
の１／10容加え、滅菌したホモジナイザーでよく
撹拌し、凍結融解し、その後5000rpmで15分間遠
心して、上清を得た。これをアメボサイト・ライ
セート・Tachypleus（以下ALTと略称する）と
する。このALTをヤングらの方法［N.S.Young
ら；J.Clin. Invest.，51 1970（1972）］に準じ
SephadexG―50（フアルマシア・フアインケミカ
ル社の商品名）を用いてゲル過を行いアミダー
ゼ前駆物質を含む分画（Fraction―１）（以下
ALT―F1と略称する。）を得た。
調製例 ２
北米産カブトガニ リムラス・ポリフエムス
（Limulus polyphemus）の血リンパ液を調製例
１と同様に処理し、アメボサイト・ライセート・
リムラス（Amoebocyte Lysate Limulus：以下
ALLと略称する）を得た。
実施例 １
本発明に用いる一般式（）
（以下、基【式】を―
DEAAと略記する。）で示される新規ペプチド性
基質の調製方法について述べ、各種新規基質の物
性を表１に示す。
１） Ｈ・Arg（NO2）―DEAA
Boc―Arg（NO2）―OHとｐ―（Ｎ，Ｎ―ジ
エチルアミノ）アニリンとを、水溶性カルボジ
イミド（WSC）にて脱水縮合して、Boc―Arg
（NO2）―DEAAを得る。この化合物のtert―
ブチルオキシカルボニル基（Boc―）をHCl／
AcOEt（Acはアセチル基を、Etはエチル基を
表わし、本明細書においては以下同様に表わ
す）系で水解し、Ｈ・Arg（NO2）―DEAA…
(1)を得る。
２） Boc―Leu―Gly―OH
Boc―Leu―OHとグリシンエチルエステル
とを水溶性カルボジイミドにて脱水縮合して、
Boc―Leu―Gly―OEtを得る。この化合物を
NaOHアルカリにてエステル水解を行い、Boc
―Leu―Gly―OHを得る。
３） Boc―Leu―Gly―Arg―DEAA
Boc―Leu―Gly―OHとＨ・Arg（NO2）―
DEAAをブタノール中、水溶性カルボジイミ
ドの存在下脱水縮合を行い、Boc―Leu―Gly
―Arg（NO2）―DEAAを得る。この化合物の
パラジウム触媒還元にて、―NO2基を切断し
Boc―Leu―Gly―Arg―DEAAを得る。元素
分析の結果(f)を下に示す。計算値(c)は、
C29H50O5N8・AcOH・H2Oとして求めた。
【表】
４） Bz―Leu―Gly―OH
Bz―Leu―OHとＨ―Gly―OEtとをブタノ
ール中、水溶性カルボジイミドにより脱水縮合
し、Bz―Leu―Gly―OEtを得る。この化合物
をNaOHアルカリ性にてエステル水解し、Bz
―Leu―Gly―OHを得る。
５） Bz―Leu―Gly―Arg―DEAA
Bz―Leu―Gly―OHとＨ―Arg（NO2）―
DEAAとをブタノール中、水溶性カルボジイ
ミドで脱水縮合し、Bz―Leu―Gly―Arg
（NO2）―DEAAを得る。この化合物をパラジ
ウム触媒還元により、―NO2基を切断しBz―
Leu―Gly―Arg―DEAAを得る。元素分析の
結果(f)を下に示す。なお計算値(c)は、
C31H46O4N8・AcOH・H2Oとして求めた。
【表】
６） Boc―Val―Leu―Gly―OH
Boc―Val―OHとＨ―Leu―Gly―OEtとを
ブタノール中、水溶液カルボジイミドで脱水縮
合し、Boc―Val―Leu―Gly―OEtを得る。こ
の化合物をNaOHアルカリ水解し、Boc―Val
―Leu―Gly―OHを得る。
７） Boc―Val―Leu―Gly―Arg―DEAA
Boc―Val―Leu―Gly―OHとＨ―Arg
（NO2）―DEAAとをブタノール中、水溶性カ
ルボジイミドで脱水縮合し、Boc―Val―Leu
―Gly―Arg（NO2）―DEAAを得る。この化
合物をパラジウム触媒還元により、―NO2基
を切断しBoc―Val―Leu―Gly―Arg―DEAA
を得る。元素分析の結果(f)を下に示す。計算値
(c)は、C34H59O6N9・AcOH・H2Oとして求め
た。
【表】
８） Bz―Val―Leu―Gly―Arg―DEAA
Bz―Val―OHとＨ―Leu―Gly―OEtを脱水
縮合し、得られるBz―Val―Leu―Gly―OEt
をアルカリ水解し、次いでＨ―Arg（NO2）―
DEAAと脱水縮合し、還元的に―NO2基を切
断し、Bz―Val―Leu―Gly―Arg―DEAAを
得る。元素分析の結果(f)を下に示す。なお計算
値(c)は、C36H55O5N9・AcOH・H2Oとして求
めた。
【表】
９） Boc―Ser（OBz）―Gly―OH
Boc―Ser（OBz）―OHとグリシンエチルエ
ステルとを脱水縮合し、Boc―Ser（OBz）―
Gly―OEtを得る。この化合物をアルカリリ水
解し、、Boc―Ser（OBz）―Gly―OHを得る。
10） Bz―Ser（OBz）Gly―OH
Bz―Ser（OBz）―OHとグリシンエチルエス
テルとを脱水縮合し、Bz―Ser（CBz）―Gly―
OEtを得る。この化合物をアルカリ水解し、
Bz―Ser（OBz）―Gly―OHを得る。
11） Boc―Val―Ser（OBz）―Gly―OH
Boc―Ser（OBz）―Gly―OEtを酢酸エチル
中、HClにてBoc基を脱離し、次いでBoc―
Val―OHと脱水縮合し、Boc―Val―Ser
（OBz）―Gly―OEtとする。この化合物を
MeOH中、NaOHアルカリケン化し、Boc―
Val―Ser（OBz）―Gly―OHを得る。
12） Bz―Val―Ser（OBz）―Gly―OH
Boc―Ser（OBz）―Gly―OEtを酢酸エチル
溶媒中、HClにて水解し、Ｈ―Ser（OBz）―
Gly―OEtを得る。この化合物とBz―Val―
OHとをブタノール・クロロホルム中、WSCに
て脱水縮合し、Bz―Val―Ser（OBz）―Gly―
OEtとし、MeOH中NaOH水解し、Bz―Val―
Ser（OBz）―Gly―OHを得る。
13） Boc―Val―Ser―Gly―Arg―DEAA
Boc―Val―Ser（OBz）―Gly―OHとＨ―
Ag（NO2）―DEAAとをジメチルホルムアミ
ド・ブタノール系溶媒中、WSCにて脱水縮合
し、Boc―Val―Ser（OBz）―Gly―Arg
（NO2）―DEAAを得る。この化合物を、パラ
ジウム触媒下還元して―ON2基及び―OBz基
を切断して、Boc―Val―Ser―Gly―Arg―
DEAAを得る。元素分析の結果(f)を下に示す。
なお計算値(c)は、C31H53O7N9・AcOH・H2O
として求めた。
【表】
14） Bz―Val―Ser―Gly―Arg―DEAA
Bz―Val―Ser（OBz）―Gly―OHとＨ―
Arg（NO2）−DEAAとをDMF・HOBt溶媒で
WSCにて脱水縮合し、Bz―Val―Se（OBz）―
Gly―Arg（NO2）―DEAAを得る。この化合
物をパラジウム触媒下還元して、―NO2基及
び―OBz基を切断して、Bz―Val―Ser―Gly
―Arg―DEAAを得る。元素分析の結果(f)を下
に示す。なお計算値(c)は、C33H49O6N9・
AcOH3/2・H2Oとして求めた。
【表】
【表】
試験例 １
調製例１にて得られた日本産カブトガニ
（Tachypleus tridentatus）ライセート、ALT―
F1にM.Niwaらの方法（Japan.J.Med.Sci.Biol.
26，20，1973）に準じて調製したサルモネラミネ
ソタR595の内毒素を作用させて生じたアミダー
ゼ様活性化酵素を、実施例１で得た新規合成基質
に作用させ、各基質に対する内毒素活性化酵素の
水解速度を求めた。これらの値を表２に示す。
各種基質は、0.2M tris―HCl PH8.0、0.005M
CaCl2含の2.5mM溶液も調製して用いた。水解速
度は、基質溶液0.2mlを37℃で2.5分間予備加温し
たのち、20μlの酵素液を加え30分後に基質より遊
離するｐ―（Ｎ，Ｎ―ジエチルアミノ）アニリン
量を、試薬0.6mM1―ナフトール―２―スルホ
ン酸ナトリウム塩、0.05Mホウ酸ナトリウム―
NaOH緩衝液PH10.01ml、試薬0.2％
NaIO40.05Mホウ酸緩衝液PH8.62mlを用いて
675nmに於ける吸光度を測定し、酵素たんぱく吸
光度（A280）当りの水解速度を算出した。
【表】
【表】
試験例２ 比較例１
調製例２で得られた北米産カブトガニ
（Limulus polyphemus）のアメボサイト・ライ
セート（ALL）を用いて、患者血漿中のエンド
トキシンの検出を行なつた。
0.2Mトリス―0.02M CaCl2，PH８ 0.1mlに
ALL20μlを加え、次いで濃度既知エンドトキシ
ンの生理食塩水溶液（0.1〜0.5ng／ml）20μl、基
質として0.4mM Boc―Leu―Gly―Arg―
DEAA0.1mlを加え、37℃に30分インキユベート
したのち、0.6M １―ナフトール―２―スルホン
酸カリウム―0.05Mホウ酸PH8.6 １mlと0.2％過ヨ
ウ素酸―0.05M Borate PH8.6 ２mlを加えて、
30分間の反応後、675nmにおける吸光度を測定す
ることによつて、図１に示す検量線が得られた。
次に、同上の操作のうち、濃度既知エンドトキ
シンの代りに患者血漿を検液として加えて吸光度
を測定し、検量線により血漿中のエンドトキシン
量を算出した。結果を表３に示す。
比較例として、基質Boc―Leu―Gly―Arg―
DEAAの代りにBoc―Leu―Gly―Arg―pNAを
用いて、同様の操作を行なつたものを図２及び表
３に示した。
【表】
なお、血漿中には、アメボサイト・ライセート
中のアミダーゼ前駆物質の酵素活性を阻害する因
子が存在することは周知のとおりで、阻害因子を
除去する手段も種々考案されているが、本例にお
いては、血漿を３倍希釈したのち、100℃に10分
間加熱することによつて、阻害因子を除去したも
のを用いた（Lancet、ランセツト、６月７日号
1272頁1975年）。
表３においてみられるように、疾病によりある
いは、症状によつて、血漿の色は淡黄から濃黄ま
で差があり、これをPNA基質ではかるときはブ
ランク値が高くなり、したがつてサンプルの吸光
度の読みも高くなり、そのために比色計の読みの
誤差が大きくなつて好ましくない。
しかし、DEAA基質を用いれば、いかなる血
漿でもブランクは無視しうる程度にまで一様に小
さくなり、検出精度が上がることは明らかで、こ
の点において、DEAA基質の効果は顕著に示さ
れている。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to novel synthetic substrates that can be used in bacterial endotoxin detection assays. A method for detecting trace amounts of bacterial endotoxins has been developed based on the phenomenon in which horseshoe crab blood cell extract (amebosite lysate) reacts with trace amounts of bacterial endotoxins and turns into a gel. used in the field of science. The present invention is based on the "Method for Detecting and Measuring Bacterial Endotoxins" previously disclosed by the applicant (Japanese Patent Application No. 70335/1989, Japanese Patent Application Laid-Open No. 54-1982).
This invention relates to a novel synthetic substrate based on the principle of the invention of No. 15797) that can be used in an improved method for practical application of the invention in the clinical diagnostic field. That is, the principle of the previously disclosed measurement method is that when horseshoe crab amebocyte lysate or the enzyme precursor (amidase precursor) component contained therein comes into contact with a sample containing bacterial endotoxin, the enzyme precursor This method utilizes the ability to specifically cleave a synthetic substrate with a certain chemical structure, which is immediately stoichiometrically activated by endotoxin, and detects the residues that are released after cleavage using spectrophotometry. It was hot. By the way, when detecting and measuring bacterial endotoxins using this method, the type of free produced residue to be detected and measured must be selected as appropriate depending on the nature and properties of the specimen. In recent years, research on the clinical pathology of endotoxins (bacterial endotoxins) has become more active, with the aim of understanding the pathophysiology of exogenous endotoxemia and endotoxin shock originating from diseases with clearly established infection foci. The Limulus Amebocyte Lysate Test has been used primarily in the surgical field. On the other hand, in the field of internal medicine, endogenous endotoxemia, such as the influence of intestinal gram-negative bacterial endotoxins on liver damage and a decline in the reticuloendothelial system processing function, such as the liver's ability to detoxify and excrete bacterial endotoxins, is a problem. Therefore, it has become essential to clinically detect and measure endotoxins in the blood coagulation fibrinolytic system, kinin system, circulatory system, and immune reaction system. When applying the above method for measuring bacterial endotoxins for the purpose of such clinical diagnosis, patient body fluids, particularly blood, ascites, urine, pancreatic juice, cerebrospinal fluid, bile, etc., are used as specimen samples. However, these body fluids may have their own coloration or may contain pigments caused by diseases (e.g., deep yellow due to jaundice, red due to hemolysis, etc.), and detection by spectrophotometry due to interference with these pigments. Quantification is often difficult. Furthermore, since there are many types of fluorescent substances in body fluids, interference with measurement cannot be avoided even if a fluorescent substance is selected as the measurement residue of a synthetic substrate. As mentioned above, the present inventors have made extensive studies to search for a new synthetic substrate that can be applied to clinical diagnostic applications, to which it has been difficult to apply the above-mentioned bacterial endotoxin detection assay method. reached. That is, an object of the present invention is to provide a novel synthetic substrate that produces a measurement residue with a light absorption region that is not interfered with by the light absorption of a dye in a specimen that occurs in response to a body fluid itself or a clinical symptom. By using this newly synthesized substrate, bacterial endotoxins can be detected and measured more accurately in clinical diagnosis. The present invention is based on the general formula: (In the formula, R 1 represents an L-amino acid residue or a peptide residue consisting of an L-amino acid, and a residue having a protecting group at the N-terminus.) This invention relates to a synthetic substrate for an activated enzyme that is a more isolated proenzyme. In order to use the novel synthetic substrate of the present invention for detection and measurement of bacterial endotoxins, one or more species selected from the novel synthetic substrate of the present invention, horseshoe crab amebosite lysate, and enzyme precursor components separated from the lysate are used. p-(N,N-diethylamino)aniline, which is produced by contacting it with a sample containing bacterial endotoxin, is oxidized and coupled with 1-naphthol-2-sulfonic acid, and the resulting condensate is detected by spectrophotometry. It is sufficient to quantify the amount, and such a measurement method is particularly suitable for clinical diagnosis of body fluids and the like. Amebocyte lysate can be obtained by treating amebocytes contained in horseshoe crab hemolymph with a hypotonic solution.
(Limulus Amebosite Lysate Test)
You may also purchase commercially available products. For example, Pregel (Imperial Organ), Pyrostat (Worthington)
Biochem.corp.USA), Pyrotest (Difco
Lab.USA), Pyrozient (Mallinckrodt,
Amebosite lysate under trade names such as Inc.USA) is known. Enzyme precursor components can be obtained by purifying and separating amebosite lysate by column chromatography, electrophoresis, electrofocusing, affinity chromatography, or the like. These amebocyte lysates or enzyme precursors separated from the lysates are activated by bacterial endotoxins to become activated enzymes, and the formula ()
It specifically acts on the synthetic substrate of the present invention, which is a peptidic compound represented by In the formula, R 1 includes, for example, those having the structure shown below. That is, Boc―Leu―, Boc―Val―Leu―,
Boc―Ser―, Boc―Val―Ser―, Bz―Leu―,
Bz―Val―Leu―, Bz―Ser―, Bz―Val―Ser
―, (where Boc is a tert-butoxycarbonyl group,
Bz- represents a benzoyl group). All of the synthetic substrates represented by formula () are new substances, and p-(N,N-diethylamino)aniline forms an anilide bond with the C-terminus of Arg in the peptidic residue represented by R 1 -Gly-Arg-. However, under the action of the activating enzyme, this anilide bond is easily enzymatically hydrolyzed to liberate p-(N,N-diethylamino)aniline (hereinafter abbreviated as DEAA). do. liberated
DEAA has weak absorption in the visible wavelength range of 510 nm and 550 nm, giving it a pale pink color, but it is not suitable as a target for absorption analysis because it is interfered with by the color tone of body fluids. DEAA is 1-naphthol- as a cutupler.
When oxidative condensation is carried out in a system in which 2-sulfonic acid coexists, a condensation product having the following formula as the main reaction exhibits a deep blue color. Since this condensate has a maximum absorption at 675 nm, it can be detected and quantified by spectrophotometry. Furthermore, since body fluids do not absorb similar colors, the presence of bacterial endotoxins can be clearly detected and measured without any interference. By using the novel peptidic substrate represented by the formula () of the present invention, bacterial endotoxins in body fluids used as samples for clinical tests can be reduced to a jaundice-like deep yellow color according to the original color tone of the body fluid and the symptoms of the disease. Since interference colors such as red due to hemolysis are avoided and measurements are made using blue tones that are not normally present in body fluids or the corresponding light absorption, bacterial endotoxins can be accurately detected and measured. The present invention will be explained in more detail below using Preparation Examples, Examples, Test Examples, and Comparative Examples. Preparation Example 1 Preparation of amebosite lysate Japanese horseshoe crab according to Special Publication No. 51-40131
Approximately 100 ml of hemolymph fluid is collected from Tachypleus tridentatus (weighing approximately 2 kg) while strictly avoiding contamination. The amebocytes are separated by centrifugation and washed with 3% sodium chloride solution to obtain an amebocyte pellet. A buffer solution (tris-HCl, 0.05M: CaCl 2 ,
0.001M: NaCl, 0.15M: PH7.2) was added to 1/10 volume of the original blood lymph, stirred well with a sterilized homogenizer, frozen and thawed, and then centrifuged at 5000 rpm for 15 minutes to obtain a supernatant. This is called Amebosite Lysate Tachypleus (hereinafter abbreviated as ALT). This ALT was calculated using the method of Young et al. [NSYoung
et al; J. Clin. Invest., 51 1970 (1972)]
Gel filtration was performed using Sephadex G-50 (trade name of Pharmacia Huain Chemical Co., Ltd.) to fractionate the amidase precursor (Fraction-1) (hereinafter referred to as Fraction-1).
It is abbreviated as ALT-F 1 . ) was obtained. Preparation Example 2 The hemolymph of the North American horseshoe crab Limulus polyphemus was treated in the same manner as in Preparation Example 1 to obtain amebocyte lysate.
Amoebocyte Lysate Limulus:
(abbreviated as ALL) was obtained. Example 1 General formula () used in the present invention (Hereinafter, the group [formula] is abbreviated as - DEAA.) A method for preparing a novel peptidic substrate represented by the formula is described, and the physical properties of various new substrates are shown in Table 1. 1) H.Arg(NO 2 )-DEAA Boc-Arg(NO 2 )-OH and p-(N,N-diethylamino)aniline are dehydrated and condensed with water-soluble carbodiimide (WSC) to form Boc-Arg.
(NO 2 ) - Obtain DEAA. tert of this compound
Butyloxycarbonyl group (Boc-) with HCl/
Hydrolyzed with AcOEt (Ac represents an acetyl group, Et represents an ethyl group, hereinafter the same will be expressed hereinafter) system, H・Arg(NO 2 )-DEAA...
Obtain (1). 2) Boc-Leu-Gly-OH Boc-Leu-OH and glycine ethyl ester are dehydrated and condensed with water-soluble carbodiimide,
Obtain Boc-Leu-Gly-OEt. this compound
Perform ester hydrolysis with NaOH alkali and Boc
Obtain -Leu-Gly-OH. 3) Boc-Leu-Gly-Arg-DEAA Boc-Leu-Gly-OH and H・Arg(NO 2 )-
DEAA was dehydrated and condensed in butanol in the presence of water-soluble carbodiimide, and Boc-Leu-Gly
- Arg (NO 2 ) - Obtain DEAA. Palladium-catalyzed reduction of this compound cleaves the -NO group .
Obtain Boc-Leu-Gly-Arg-DEAA. The result of elemental analysis (f) is shown below. The calculated value (c) is
It was determined as C 29 H 50 O 5 N 8 ·AcOH·H 2 O. [Table] 4) Bz-Leu-Gly-OH Bz-Leu-OH and H-Gly-OEt are dehydrated and condensed with water-soluble carbodiimide in butanol to obtain Bz-Leu-Gly-OEt. This compound was subjected to ester hydrolysis with NaOH alkalinity, and Bz
Obtain -Leu-Gly-OH. 5) Bz-Leu-Gly-Arg-DEAA Bz-Leu-Gly-OH and H-Arg(NO 2 )-
Bz-Leu-Gly-Arg was dehydrated and condensed with DEAA using water-soluble carbodiimide in butanol.
(NO 2 ) - Obtain DEAA. By palladium-catalyzed reduction of this compound, the -NO 2 group was cleaved and Bz-
Obtain Leu-Gly-Arg-DEAA. The result of elemental analysis (f) is shown below. The calculated value (c) is
It was determined as C 31 H 46 O 4 N 8 ·AcOH·H 2 O. [Table] 6) Boc-Val-Leu-Gly-OH Boc-Val-OH and H-Leu-Gly-OEt are dehydrated and condensed with aqueous carbodiimide in butanol to obtain Boc-Val-Leu-Gly-OEt. . This compound was subjected to NaOH alkaline hydrolysis and Boc-Val
Obtain -Leu-Gly-OH. 7) Boc-Val-Leu-Gly-Arg-DEAA Boc-Val-Leu-Gly-OH and H-Arg
(NO 2 )-DEAA is dehydrated and condensed with water-soluble carbodiimide in butanol to form Boc-Val-Leu.
- Gly - Arg (NO 2 ) - Obtain DEAA. This compound was subjected to palladium-catalyzed reduction to cleave the -NO 2 group and form Boc-Val-Leu-Gly-Arg-DEAA.
get. The result of elemental analysis (f) is shown below. Calculated value
(c) was determined as C 34 H 59 O 6 N 9 ·AcOH·H 2 O. [Table] 8) Bz-Val-Leu-Gly-Arg-DEAA Bz-Val-Leu-Gly-OEt obtained by dehydration condensation of Bz-Val-OH and H-Leu-Gly-OEt
is subjected to alkaline hydrolysis, then H-Arg(NO 2 )-
It undergoes dehydration condensation with DEAA and reductively cleaves the -NO 2 group to obtain Bz-Val-Leu-Gly-Arg-DEAA. The result of elemental analysis (f) is shown below. Note that the calculated value (c) was obtained as C 36 H 55 O 5 N 9 ·AcOH·H 2 O. [Table] 9) Boc-Ser(OBz)-Gly-OH Boc-Ser(OBz)-OH and glycine ethyl ester are dehydrated and condensed to form Boc-Ser(OBz)-
Obtain Gly-OEt. This compound is subjected to alkaline hydrolysis to obtain Boc-Ser(OBz)-Gly-OH. 10) Bz―Ser(OBz)Gly―OH Bz―Ser(OBz)―OH and glycine ethyl ester are dehydrated and condensed to form Bz―Ser(CBz)―Gly―
Get OEt. This compound is subjected to alkaline hydrolysis,
Obtain Bz-Ser (OBz)-Gly-OH. 11) Boc-Val-Ser(OBz)-Gly-OH Boc-Ser(OBz)-Gly-OEt was removed with HCl in ethyl acetate, and then Boc-
Dehydration condensation with Val-OH, Boc-Val-Ser
(OBz) - Gly - OEt. this compound
NaOH alkaline saponification in MeOH, Boc-
Obtain Val-Ser (OBz)-Gly-OH. 12) Bz―Val―Ser(OBz)―Gly―OH Boc―Ser(OBz)―Gly―OEt was hydrolyzed with HCl in ethyl acetate solvent to form H―Ser(OBz)―
Obtain Gly-OEt. This compound and Bz―Val―
Bz-Val-Ser(OBz)-Gly-
OEt, NaOH hydrolysis in MeOH, Bz―Val―
Obtain Ser(OBz)-Gly-OH. 13) Boc-Val-Ser-Gly-Arg-DEAA Boc-Val-Ser (OBz)-Gly-OH and H-
Boc-Val-Ser(OBz)-Gly-Arg was formed by dehydration condensation of Ag(NO 2 )-DEAA in dimethylformamide/butanol solvent using WSC.
(NO 2 ) - Obtain DEAA. This compound was reduced under palladium catalyst to cleave the -ON 2 groups and -OBz group, and Boc-Val-Ser-Gly-Arg-
Get DEAA. The result of elemental analysis (f) is shown below.
The calculated value (c) is C 31 H 53 O 7 N 9・AcOH・H 2 O
I asked for it as. [Table] 14) Bz-Val-Ser-Gly-Arg-DEAA Bz-Val-Ser (OBz)-Gly-OH and H-
Arg(NO 2 )−DEAA in DMF/HOBt solvent
Dehydrated and condensed in WSC, Bz―Val―Se(OBz)―
Obtain Gly-Arg(NO 2 )-DEAA. This compound was reduced under a palladium catalyst to cleave the -NO 2 and -OBz groups to form Bz-Val-Ser-Gly.
-Arg- Get DEAA. The result of elemental analysis (f) is shown below. The calculated value (c) is C 33 H 49 O 6 N 9・
It was determined as AcOH 3/2 ·H 2 O. [Table] [Table] Test Example 1 Japanese horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) lysate obtained in Preparation Example 1, ALT-
F1 is the method of M. Niwa et al. (Japan.J.Med.Sci.Biol.
26, 20, 1973) was applied to the newly synthesized substrate obtained in Example 1, and endotoxin activation was performed on each substrate. The water decomposition rate of the enzyme was determined. These values are shown in Table 2. Various substrates are 0.2M tris-HCl PH8.0, 0.005M
A 2.5mM solution containing CaCl2 was also prepared and used. The rate of water dissolution was determined by prewarming 0.2 ml of the substrate solution at 37°C for 2.5 minutes, adding 20 μl of the enzyme solution, and measuring the amount of p-(N,N-diethylamino)aniline released from the substrate after 30 minutes with 0.6 mM of the reagent. Naphthol-2-sulfonic acid sodium salt, 0.05M sodium borate
NaOH buffer PH10.01ml, reagent 0.2%
Using NaIO 4 0.05M borate buffer PH8.62ml
The absorbance at 675 nm was measured, and the water decomposition rate per enzyme protein absorbance (A 280 ) was calculated. [Table] [Table] Test Example 2 Comparative Example 1 Using the North American horseshoe crab (Limulus polyphemus) amebocyte lysate (ALL) obtained in Preparation Example 2, endotoxin in patient plasma was detected. 0.2M Tris-0.02M CaCl 2 , PH8 to 0.1ml
Add 20μl of ALL, then add 20μl of a physiological saline solution of known concentration endotoxin (0.1-0.5ng/ml) and 0.4mM Boc-Leu-Gly-Arg- as a substrate.
Add 0.1ml of DEAA and incubate at 37℃ for 30 minutes, then add 1ml of 0.6M potassium 1-naphthol-2-sulfonate-0.05M borate PH8.6 and 2ml of 0.2% periodic acid-0.05M Borate PH8.6. In addition,
After 30 minutes of reaction, the calibration curve shown in FIG. 1 was obtained by measuring the absorbance at 675 nm. Next, in the same procedure as above, patient plasma was added as a test solution instead of endotoxin with a known concentration, the absorbance was measured, and the amount of endotoxin in the plasma was calculated using a calibration curve. The results are shown in Table 3. As a comparative example, the substrate Boc-Leu-Gly-Arg-
A similar operation was performed using Boc-Leu-Gly-Arg-pNA instead of DEAA, as shown in FIG. 2 and Table 3. [Table] It is well known that there are factors in plasma that inhibit the enzymatic activity of the amidase precursor in amebocyte lysate, and various methods have been devised to remove the inhibitory factors. In this example, plasma was diluted 3 times and then heated to 100°C for 10 minutes to remove inhibitory factors (Lancet, June 7 issue).
1272 pages 1975). As seen in Table 3, the color of plasma varies depending on the disease or symptom, from light yellow to dark yellow, and when this is measured with a PNA substrate, the blank value will be high, and therefore the sample The absorbance reading will also be high, which will undesirably increase the error in the colorimeter reading. However, if the DEAA substrate is used, it is clear that the blank will be uniformly small to the extent that it can be ignored in any plasma, and the detection accuracy will be increased, and in this respect, the effect of the DEAA substrate is clearly demonstrated.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
図１はエンドトキシン濃度に対する吸光度の検
量線を示す図で、図２はpNA残基を有する基質
を用いた場合の検量線を示す図である。
FIG. 1 is a diagram showing a calibration curve of absorbance versus endotoxin concentration, and FIG. 2 is a diagram showing a calibration curve when using a substrate having a pNA residue.