【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
この発明は、FK−565物質を含有するリポソー
ム製剤に関するものである。
FK−565物質は、化学構造式：
で表わされる化合物であり、抗腫瘍作用および
感染防御作用等を有することが知られている（特
開昭56−45449号）。
FK−565物質は、これを注射用蒸留水に溶解し
て注射剤として投与した場合、あるいはこれを錠
剤、顆粒剤、カプセル剤の如き固形製剤として経
口投与した場合でもある程度の抗腫瘍作用および
感染防御作用を示すが、この発明はこれらの生理
活性をより一層増強させる目的でなされたもので
ある。
この発明のFK−565物質含有リポソームは、リ
ン脂質等からなる皮膜でFK−565物質を内包した
構造を有する。
リポソーム膜を形成するリン脂質としては、卵
黄レシチン、大豆レシチン、スフインゴミエリ
ン、ホスフアチジルセリン、ホスフアチジルグリ
セロール、ホスフアチジルイノシトール、ジホス
フアチジルグリセロール、ホスフアチジルエタノ
ールアミン等の天然リン脂質、ジステアロイルホ
スフアチジルコリン、ジパルミトイルホスフアチ
ジルコリン、ジパルミトイルホスフアチジルエタ
ノールアミン等の合成リン脂質が挙げられる。こ
れらのリン脂質には通常の添加剤、例えばコレス
テロール類、ジセチルホスフエート、ホスフアチ
ジン酸、ステアリルアミン等の荷電脂質類あるい
はα−トコフエロールなどを適宜添加してもよ
い。
この発明のFK−565物質含有リポソームは、通
常の製法により製造することができる。
すなわち、上記のようなリポソーム膜形成物質
をクロロホルム、エタノール等の有機溶媒に溶解
し、これを適当な容器に入れ、減圧下に溶媒を留
去して容器内面に薄膜を形成させたのち、この容
器中にFK−565物質の水溶液を入れ、振とうする
か、あるいは超音波処理して微細粒子（リポソー
ム）の懸濁液を得る。なお、FK−565物質の水溶
液を調製する際の溶媒としては水のほかに生理食
塩水、リン酸緩衝液、トリスアミノメタン緩衝液
等の緩衝液、ブドウ糖、ソルビトールなどの水溶
液、あるいはこれらの混合液を使用してもよい。
また、この発明のリポソームは、リポソーム膜
形成物質をジエチルエーテル、ジイソプロピルエ
ーテル等の有機溶媒に溶解した溶液に、FK−565
物質の水溶液を加え、超音波処理などによつて乳
化させたのち、減圧下に有機溶媒を留去しても製
造することができる。そのほか、界面活性剤除去
法（Detergent removal）、エーテル注入法
（Ether injection）などによつてもこの発明のリ
ポソームを製造することができ、リポソームの製
造法は特に限定されない。
このようにして製造されるリポソームは、遠心
分離のような常用の手段によつて単離される。単
離されたリポソームは、これをFK−565物質溶解
用の水性溶媒中に再分散させたのち遠心分離する
ことにより精製される。
このようにして得られるリポソームは、適当な
溶媒中に懸濁させるか、あるいは一旦凍結乾燥し
たものを適当な溶媒中に再分散させて使用に供さ
れる。
この発明のFK−565物質含有リポソームは次の
試験結果からも明らかなように、すぐれた抗腫瘍
作用および感染防御作用を有する。
試験例 １：P388肝転移抑制作用
試験方法：
腹水型として継代維持されている担癌動物
〔DBA／２マウスにP388（マウスリンパ性白血病
細胞）を１×106個／マウスの割合で移植し、そ
の１週間後のマウス〕から、５ml容注射筒で腹腔
細胞（P388）を採取し、ハンクス液を加え、２
回遠心洗浄（1000rpm、５分間）する。これをハ
ンクス液に懸濁し、５×105／mlの細胞懸濁液を
調製した。この細胞懸濁液0.1mlをDBA／２マウ
ス（雌、８週令、１群５匹）の尾静脈より移植し
た（５×104／マウス）。移殖後１日目および３日
目に薬物を尾静脈内投与する。（0.1ml／マウス、
１日１回）。移殖後７日目に各マウスを断頭放血
し、ハンクス液中に肝臓を取り出す。実体顕微鏡
下で肝臓表面に出現しているP388コロニー数を
測定する。
試験結果：
This invention relates to liposome formulations containing the FK-565 substance. FK-565 substance has the chemical structural formula: It is a compound represented by the following formula, and is known to have anti-tumor and infection-preventing effects (Japanese Patent Application Laid-open No. 45449/1983). FK-565 substance has a certain degree of antitumor activity and infection even when it is dissolved in distilled water for injection and administered as an injection, or when it is orally administered as a solid preparation such as a tablet, granule, or capsule. Although they exhibit protective effects, this invention was made with the aim of further enhancing these physiological activities. The FK-565 substance-containing liposome of the present invention has a structure in which the FK-565 substance is encapsulated in a film made of phospholipid or the like. Examples of phospholipids that form liposome membranes include natural phospholipids such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, sphingomyelin, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, diphosphatidylglycerol, and phosphatidylethanolamine. Synthetic phospholipids such as lipids, distearoylphosphatidylcholine, dipalmitoylphosphatidylcholine, and dipalmitoylphosphatidylethanolamine are mentioned. Conventional additives such as cholesterol, charged lipids such as dicetyl phosphate, phosphatidic acid, and stearylamine, or α-tocopherol may be appropriately added to these phospholipids. The FK-565 substance-containing liposome of this invention can be produced by a conventional manufacturing method. That is, the liposome film-forming substance as described above is dissolved in an organic solvent such as chloroform or ethanol, placed in a suitable container, and the solvent is distilled off under reduced pressure to form a thin film on the inner surface of the container. Place an aqueous solution of FK-565 substance in a container and shake or sonicate to obtain a suspension of fine particles (liposomes). In addition to water, solvents used to prepare an aqueous solution of the FK-565 substance include buffers such as physiological saline, phosphate buffer, and trisaminomethane buffer, aqueous solutions of glucose and sorbitol, or mixtures thereof. Liquid may also be used. In addition, the liposome of the present invention can be prepared by adding FK-565 to a solution in which a liposome membrane-forming substance is dissolved in an organic solvent such as diethyl ether or diisopropyl ether.
It can also be produced by adding an aqueous solution of the substance, emulsifying it by ultrasonication, etc., and then distilling off the organic solvent under reduced pressure. In addition, the liposome of the present invention can also be produced by a surfactant removal method, an ether injection method, etc., and the method for producing the liposome is not particularly limited. Liposomes thus produced are isolated by conventional means such as centrifugation. The isolated liposome is purified by redispersing it in an aqueous solvent for dissolving the FK-565 substance and then centrifuging it. The liposome thus obtained is used by suspending it in an appropriate solvent, or by lyophilizing it and redispersing it in an appropriate solvent. As is clear from the following test results, the FK-565 substance-containing liposome of the present invention has excellent anti-tumor and infection-preventing effects. Test example 1: P388 liver metastasis inhibitory effect Test method: Tumor-bearing animals maintained as ascites type [P388 (mouse lymphocytic leukemia cells) were transplanted into DBA/2 mice at a rate of 1 x 10 6 cells/mouse One week later, peritoneal cells (P388) were collected from the mouse using a 5 ml syringe, Hank's solution was added,
Wash by centrifugation (1000 rpm , 5 minutes). This was suspended in Hank's solution to prepare a cell suspension of 5×10 5 /ml. 0.1 ml of this cell suspension was transplanted from the tail vein of DBA/2 mice (female, 8 weeks old, 5 mice per group) (5×10 4 /mouse). Drugs are administered intravenously in the tail vein on days 1 and 3 after transplantation. (0.1ml/mouse,
(once a day). Seven days after transplantation, each mouse is decapitated and exsanguinated, and the liver is removed into Hank's solution. Measure the number of P388 colonies appearing on the liver surface under a stereomicroscope. Test results:
【表】【table】
【表】
試験例 ２：P388およびP815固形癌に対する作
用
試験方法：
試験例１と同様にして、P388およびP815（マウ
ス・マストサイトーマ）の細胞懸濁液（２×
105／ml）を調製した。この細胞懸濁液0.05mlを
DBA／２マウス（雌、８週令、１群７匹）の皮
内に移殖した（１×104／マウス）。薬物は移殖の
３日前および移殖の４日後にそれぞれ皮下投与し
た（0.2ml／マウス、１日１回）移殖10日後
（P815）および11日後（P388）に、ノギスを用い
て腫瘍の長径および短径を測定し、次式により腫
瘍の体積を求めた。
体積（mm3）＝0.4×長径（mm）×短径（mm2）
試験結果：[Table] Test Example 2: Test method for the effect on P388 and P815 solid tumors: In the same manner as in Test Example 1, P388 and P815 (mouse mastocytoma) cell suspensions (2×
10 5 /ml) was prepared. 0.05ml of this cell suspension
The cells were implanted intradermally into DBA/2 mice (female, 8 weeks old, 7 mice per group) (1×10 4 /mouse). The drug was administered subcutaneously 3 days before transplantation and 4 days after transplantation (0.2ml/mouse, once a day). 10 days (P815) and 11 days (P388) after transplantation, the tumor was examined using calipers. The major axis and minor axis were measured, and the volume of the tumor was determined using the following formula. Volume (mm 3 ) = 0.4 x major axis (mm) x minor axis (mm 2 ) Test results:
【表】【table】
【表】
試験例 ３：カンジダ・アルビカンスに対する感
染防御作用
試験方法：
各薬物をddYマウス（雌、４週令、１群６匹）
の尾静脈内に投与する。投与１日後、カンジダ・
アルビカンスNo.65をサブロー液体培地で30℃、48
時間培養し、遠心集菌し（6000rpm.20分間）、菌
数が107／mlとなるように生理食塩水で調製した
菌液をマウス尾静脈より投与し（0.1ml／マウ
ス）、感染させた。感染７日後のマウスの生死に
より効果を判定した。
試験結果：[Table] Test example 3: Test method for protective effect against Candida albicans infection: Each drug was administered to ddY mice (female, 4 weeks old, 6 mice per group)
Administer into the tail vein of the patient. One day after administration, Candida
albicans No. 65 in Sabouraud liquid medium at 30℃, 48
After culturing for hours, the bacteria were collected by centrifugation (6000 rpm, 20 minutes), and a bacterial solution prepared with physiological saline so that the number of bacteria was 10 7 /ml was administered through the tail vein of the mouse (0.1ml/mouse) to infect the mouse. Ta. The efficacy was determined by whether the mice were alive or dead 7 days after infection. Test results:
【表】
なお、上記の試験例１〜３において使用された
FK−565物質のリポソーム製剤は、それぞれ後記
の実施例２、実施例１および実施例３により製造
したものである。
次に、この発明のFK−565物質含有リポソーム
の製造法を実施例により説明する。
実施例 １
Ｌ−α−ジステアロイルホスフアチジルコリン
（60μモル）をクロロホルム（4.74ml）に溶解した
溶液をナス型コルベン（100ml容量）に入れ、25
〜30℃の水浴中で減圧下にクロロホルムを留去
し、コルベン内壁に薄膜を形成させる。他方、
FK−565物質をPH7.4リン酸緩衝生理食塩水に溶
解し（4.3mg／ml）、0.45μメンブランフイルター
を用いて過する。この水溶液（４ml）を上記の
コルベン中に入れ、内壁の薄膜が剥がれるまで恒
温振盪器（60℃）で振盪する。得られる懸濁液に
リン酸緩衝生理食塩水を加え、これをポリエチレ
ン製遠心分離用試験管（20ml容量）に移し、４
℃、100000×ｇで15分間遠心分離する。上清を除
去し、沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（20ml）に
再分散し、遠心分離する操作を２回くり返す。得
られる沈殿物をリン酸緩衝生理食塩水（3.6ml）
に分散させて、FK−565物質のリポソーム製剤を
得る。このリポソーム製剤中のFK−565物質の濃
度は100μｇ／mlであり、リポソームの平均粒子
径は5μであつた。
なお、上記のリン酸緩衝生理食塩水は、塩化ナ
トリウム（80.07ｇ）、塩化カリウム（1.94ｇ）、
リン酸水素二ナトリウムの12水和物（22.92ｇ）
およびリン酸二水素カリウム（1.91ｇ）を蒸留水
に溶解して全量10としたものである。
実施例 ２
Ｌ−α−ジステアロイルホスフアチジルコリン
（42μモル）およびホスフアチジルセリン（18μモ
ル）をクロロホルム（5.1ml）に溶解した溶液、
およびFK−565物質のPH7.4リン酸緩衝生理食塩
水水溶液（600μｇ／ml）を0.45μメンブランフイ
ルターで過した水溶液（４ml）を用いて、実施
例１と同様に処理すると、FK−565物質のリポソ
ーム製剤を得る。このリポソーム製剤のFK−565
物質の濃度は20μｇ／mlであり、リポソームの平
均粒子径は2.5μであつた。
実施例 ３
卵黄レシチン（84μモル）およびホスフアチジ
ルセリン（36μモル）をクロロホルム（11.9ml）
に溶解した溶液を実施例１と同様に処理して、コ
ルベン内壁に薄膜を形成させる。他方、FK−565
物質のPH7.4リン酸緩衝生理食塩水溶液（500μ
ｇ／ml）を0.45μメンブランフイルターで過し
た水溶液（４ml）を、上記のコルベンに入れ、コ
ルベン内壁の薄膜が剥がれるまで室温で撹拌振と
うする。得られる懸濁液にリン酸緩衝生理食塩水
（20ml）を加え、これをポリエチレン製遠心分離
用試験管（50ml容量）に移し、４℃、100000×ｇ
で15分間遠心分離する。上清を除去し、沈殿物を
リン酸緩衝生理食塩水（25ml）再分散し、遠心分
離する操作を２回くり返す。得られる沈殿物をリ
ン酸緩衝生理食塩水（6.3ml）に分散させて、FK
−565物質のリポソーム製剤を得る。このリポソ
ーム製剤中のFK−565物質の濃度は20μｇ／mlで
あり、リポソームの平均粒子径は2.4μであつた。
実施例 ４
卵黄レシチン（26μモル）およびコレステロー
ル（13μモル）をジエチルエーテル（６ml）に溶
解した溶液をナス型コルベン（50ml容量）に入れ
る。これに、FK−565物質のリン酸緩衝生理食塩
水溶液（400μｇ／ml、２ml）を加え、４℃で５
分間超音波処理する。得られる乳化液から25℃水
浴中、減圧下にジエチルエーテルを留去する。得
られる懸濁液を透析用セルロース・チユーブに充
填し、約500倍量のリン酸緩衝生理食塩水中、４
℃で48時間透析する。なお、この間、透析効率を
高めるため、リン酸緩衝生理食塩水を５回交換す
る。透析終了後、チユーブ内よりFK−565物質の
リポソーム製剤を回収する。このリポソーム製剤
中のFK−565物質の濃度は100μｇ／mlであり、
リポソームの平均粒子径は2.6μであつた。[Table] In addition, the samples used in Test Examples 1 to 3 above
Liposomal formulations of the FK-565 substance were produced according to Example 2, Example 1, and Example 3, respectively, described below. Next, the method for producing the FK-565 substance-containing liposome of the present invention will be explained with reference to Examples. Example 1 A solution of L-α-distearoylphosphatidylcholine (60 μmol) dissolved in chloroform (4.74 ml) was placed in an eggplant-shaped colben (100 ml volume), and 25
Chloroform is distilled off under reduced pressure in a ~30°C water bath to form a thin film on the inner wall of the Kolben. On the other hand,
FK-565 substance is dissolved in PH7.4 phosphate buffered saline (4.3 mg/ml) and filtered using a 0.45μ membrane filter. This aqueous solution (4 ml) is placed in the above-mentioned Kolben and shaken in a thermostatic shaker (60°C) until the thin film on the inner wall is peeled off. Phosphate buffered saline was added to the resulting suspension, transferred to a polyethylene centrifugation test tube (20 ml capacity), and
Centrifuge at 100,000 x g for 15 minutes at °C. The supernatant was removed, the precipitate was redispersed in phosphate buffered saline (20 ml), and the procedure of centrifugation was repeated twice. Dissolve the resulting precipitate in phosphate buffered saline (3.6 ml)
to obtain a liposome formulation of FK-565 substance. The concentration of FK-565 substance in this liposome preparation was 100 μg/ml, and the average particle size of the liposome was 5 μ. The above phosphate buffered saline contains sodium chloride (80.07g), potassium chloride (1.94g),
Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (22.92g)
and potassium dihydrogen phosphate (1.91 g) were dissolved in distilled water to make a total amount of 10. Example 2 A solution of L-α-distearoylphosphatidylcholine (42 μmol) and phosphatidylserine (18 μmol) in chloroform (5.1 ml),
When treated in the same manner as in Example 1 using a PH7.4 phosphate buffered saline aqueous solution (600 μg/ml) of the FK-565 substance and an aqueous solution (4 ml) filtered through a 0.45 μ membrane filter, the FK-565 substance to obtain a liposome formulation. FK-565 of this liposome formulation
The concentration of the substance was 20μg/ml and the average particle size of the liposomes was 2.5μ. Example 3 Egg yolk lecithin (84 μmol) and phosphatidylserine (36 μmol) were dissolved in chloroform (11.9 ml).
A solution dissolved in the above is treated in the same manner as in Example 1 to form a thin film on the inner wall of the Kolben. On the other hand, FK−565
Substance PH7.4 phosphate buffered saline solution (500μ
An aqueous solution (4 ml) filtered through a 0.45μ membrane filter (g/ml) is placed in the above-mentioned Colben, and stirred and shaken at room temperature until the thin film on the inner wall of the Colben peels off. Phosphate buffered saline (20 ml) was added to the resulting suspension, transferred to a polyethylene centrifugation test tube (50 ml capacity), and incubated at 4°C at 100,000 x g.
Centrifuge for 15 minutes at The supernatant was removed, the precipitate was redispersed in phosphate buffered saline (25 ml), and the procedure of centrifugation was repeated twice. The resulting precipitate was dispersed in phosphate buffered saline (6.3 ml) and FK
Obtain a liposome formulation of −565 substances. The concentration of FK-565 substance in this liposome preparation was 20 μg/ml, and the average particle size of the liposome was 2.4 μ. Example 4 A solution of egg yolk lecithin (26 μmol) and cholesterol (13 μmol) in diethyl ether (6 ml) is placed in an eggplant-shaped kolben (50 ml volume). To this was added a phosphate buffered saline solution of FK-565 substance (400 μg/ml, 2 ml), and
Sonicate for minutes. Diethyl ether is distilled off from the resulting emulsion under reduced pressure in a water bath at 25°C. The resulting suspension was filled into a cellulose tube for dialysis, and diluted with about 500 times the volume of phosphate buffered saline for 4 hours.
Dialyze for 48 hours at °C. During this time, the phosphate buffered saline was exchanged five times in order to increase the dialysis efficiency. After the dialysis is completed, the liposome preparation of FK-565 substance is recovered from the tube. The concentration of FK-565 substance in this liposome preparation is 100 μg/ml,
The average particle size of the liposomes was 2.6μ.