JPH0321154B2 - - Google Patents
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- JPH0321154B2 JPH0321154B2 JP57227911A JP22791182A JPH0321154B2 JP H0321154 B2 JPH0321154 B2 JP H0321154B2 JP 57227911 A JP57227911 A JP 57227911A JP 22791182 A JP22791182 A JP 22791182A JP H0321154 B2 JPH0321154 B2 JP H0321154B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- chloramphenicol
- paj43
- brevibacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
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- Genetics & Genomics (AREA)
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- Biophysics (AREA)
Description
この発明はプラスミドベクターpAJ43に関す
る。pAJ43は、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌を宿主として増殖できるものである。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、大量の
Ｌ−グルタミン酸を生産することが知られてい
る。またその変異株はリジン等のアミノ酸、イノ
シン酸のプリンヌクレオチド等を生産するものが
知られていて、工業的に有用な微生物である。一
方、最近DNA組換え技術による工業微生物の育
種、改良がエシエリヒア・コリ等により試みられ
ているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌に
ついては、これらの微生物を宿主とするに適した
ベクターが開発されておらず、DNA組換えによ
るコリネホルム・グルタミン酸生産菌の育種、改
良の妨げとなつていた。 本発明者らは、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌を宿主として増殖するプラスミドである、分
子量３，４メガダルトンであつて、第３図に示す
制限酸素地図を有するプラスミドベクターpAJ43
を造成することに成功した。このプラスミドベク
ターは、クロラムフエニコール耐性の遺伝情報を
有しコピー数が大きく、更に制限酵素Xma、
Hind、BamH、Xba及びHaeでは１個
所しか切断されず、又これらの切断個所は上記ク
ロラムフエニコール耐性の遺伝情報はないので、
ベクターとして勝れている。 プラスミドベクターpAJ43は実施例１に示す方
法により造成した。 コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。本発明
の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野生株の例としては次のようなも
のがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン5′−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。 本発明の複合プラスミドまたは、異種遺伝子の
挿入された複合プラスミドの宿主として、上記の
ようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌を用い
る場合、制限活性を低める変異を常法により宿主
に与えておけば更に良好な結果が得られる。 このようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌
を、外来遺伝子の挿入された複合プラスミドを導
入するのに用いれば外来遺伝子に担われた遺伝情
報を発現せしめるのにより有利である。 実施例 １ (1) pAJ43造成の中間体となつたpAJ655を、プ
ラスミドpBR325とpAM330から造成した。 プラスミドpBR325はエシエリヒア・コリ内で
アンピシリン、クロラムフエニコール、テトラサ
イクリン耐性を発現する分子量3.6メガダルトン
のベクタープラスミドである〔Boliver，F.
Gene，４，121（1978）〕。実験に使用したプラス
ミドpBR325は（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リー）（BRL）から購入した。 プラスミドpAM330はブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムATCC13869から新たに我々
が分離した分子量3.0メガダルトンのプラスミド
であり、その制限酵素切断地図を第１図に、制限
酵素による切断個所の数を第１表にそれぞれ示
す。プラスミドpAM330DNAは次の様にして調
製した。
る。pAJ43は、コリネホルム・グルタミン酸生産
菌を宿主として増殖できるものである。 コリネホルム・グルタミン酸生産菌は、大量の
Ｌ−グルタミン酸を生産することが知られてい
る。またその変異株はリジン等のアミノ酸、イノ
シン酸のプリンヌクレオチド等を生産するものが
知られていて、工業的に有用な微生物である。一
方、最近DNA組換え技術による工業微生物の育
種、改良がエシエリヒア・コリ等により試みられ
ているが、コリネホルム・グルタミン酸生産菌に
ついては、これらの微生物を宿主とするに適した
ベクターが開発されておらず、DNA組換えによ
るコリネホルム・グルタミン酸生産菌の育種、改
良の妨げとなつていた。 本発明者らは、コリネホルム・グルタミン酸生
産菌を宿主として増殖するプラスミドである、分
子量３，４メガダルトンであつて、第３図に示す
制限酸素地図を有するプラスミドベクターpAJ43
を造成することに成功した。このプラスミドベク
ターは、クロラムフエニコール耐性の遺伝情報を
有しコピー数が大きく、更に制限酵素Xma、
Hind、BamH、Xba及びHaeでは１個
所しか切断されず、又これらの切断個所は上記ク
ロラムフエニコール耐性の遺伝情報はないので、
ベクターとして勝れている。 プラスミドベクターpAJ43は実施例１に示す方
法により造成した。 コリネホルム・バクテリアは好気性、グラム陽
性桿菌であり、非抗酸性でバーヂース・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブバクテリオロジー
第８版599頁（1974）に記載されている。本発明
の宿主菌として利用しうるコリネホルム・グルタ
ミン酸生産菌の野生株の例としては次のようなも
のがあげられる。 ブレビバクテリウム・デイバリカタム
ATCC14020 ブレビバクテリウム・サツカロリテイクム
ATCC14066 ブレビバクテリウム・インマリオフイルム
ATCC14068 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
ATCC19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフイルム
ATCC13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム
ATCC15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフイラム
ATCC15354 コリネホルム・グルタミン酸生産菌にはグルタ
ミン酸生産性を失なつた変異株、あるいは、リジ
ン、アルギニン等のアミノ酸、イノシン等のプリ
ンヌクレオシド、イノシン5′−モノりん酸等のプ
リンヌクレオチド、又はその他の生産物を生産す
る変異株も含まれる。 本発明の複合プラスミドまたは、異種遺伝子の
挿入された複合プラスミドの宿主として、上記の
ようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌を用い
る場合、制限活性を低める変異を常法により宿主
に与えておけば更に良好な結果が得られる。 このようなコリネホルム・グルタミン酸生産菌
を、外来遺伝子の挿入された複合プラスミドを導
入するのに用いれば外来遺伝子に担われた遺伝情
報を発現せしめるのにより有利である。 実施例 １ (1) pAJ43造成の中間体となつたpAJ655を、プ
ラスミドpBR325とpAM330から造成した。 プラスミドpBR325はエシエリヒア・コリ内で
アンピシリン、クロラムフエニコール、テトラサ
イクリン耐性を発現する分子量3.6メガダルトン
のベクタープラスミドである〔Boliver，F.
Gene，４，121（1978）〕。実験に使用したプラス
ミドpBR325は（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リー）（BRL）から購入した。 プラスミドpAM330はブレビバクテリウム・ラ
クトフアーメンタムATCC13869から新たに我々
が分離した分子量3.0メガダルトンのプラスミド
であり、その制限酵素切断地図を第１図に、制限
酵素による切断個所の数を第１表にそれぞれ示
す。プラスミドpAM330DNAは次の様にして調
製した。
【表】
ス
【表】
蒸留水１あたりペプトン10ｇ、粉末酵母エキ
ス10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース５ｇを
含むCMG培地（pH7.2）１中に温度30℃でブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を、リゾチームとSDSに
より溶菌させる簡便法により溶菌せしめた後、
30000×ｇで30分間遠心分離し64mlの上澄液を得
た。上澄液中のプラスミドDNAは、上澄液にポ
リエチレングリコール（最終濃度10％）を添加し
沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に溶解した。 DNAをリボヌクレアーゼで処理した後（リボ
ヌクレアーゼ150μg／mlで37℃、30分間反応）、
フエノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを
加え−20℃℃でDNAを沈澱させ、沈澱を１mlの
TEN緩衝液に溶解した。このDNA溶液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ゲルから約74μgの純
粋なプラスミドDNAを分離した。 プラスミドpBR325 0.2μgに１ユニツトの制限
酵素BamH （BRLから購入）を37℃で60分
間反応させ、DNAを充分分解した。 プラスミドpAM330（1.2μg）に0.2ユニツトの
制限酵素Mboを37℃で15分間反応させ、DNA
を部分分解した。 得られたDNA断片を混合し制限酵素を不活化
するため65℃で10分間熱処理した後、ATPとジ
チオスレイトール存在下22℃で２時間0.01ユニツ
トのT4 DNAリガーゼを作用させた。T4 DNA
リガーゼを65℃、10分間の処理で不活化し、２倍
量のエタノールを加えた後、15000×ｇ 15分間
の遠心分離によりDNAを回収した。 このようにして得た複合プラスミドをトランス
フオーメイシヨンに使用した。 エシエリヒア・コリＣ−600（thr-，leu-，
thiamine-，r-，m-）（Meselson，M.and
Yuan，R.Nature，217，1110（1968））を20mlの
CMG培地に30℃で対数増殖期中期まで培養し、
菌体を集めた。Kushner等（“Genetic
Engineering”，p.17（1978），Elsevier／North
Holland Biomedical Press）の方法にしたがつ
て、得られたDNAを用いてＣ−600を形質転換し
た。 形質転換株は20μg／mlのクロラムフエニコー
ルを含むCMG培地で37℃、24時間培養し選択し
た。形質転換株の中からAJ11882（FERM−
BP136）を選択し、次の実験に用いた。 複合プラスミドpAJ655は、次のような方法に
よりAJ11882の溶菌液から分離した。AJ11882を
CMG培地で培養後、簡便法（TamaKa et al.，
J.Bacteriol.，121，354（1975））により溶菌せし
め、溶菌液をアガロースゲルにかけ、電気泳動に
かけた（Sharp et al.，Biochemistry12，3055
（1973））。分子量マーカーとの比較により、プラ
スミドの分子量は6.6メガダルトンと計算された。
プラスミドの制限酵素切断地図を第２図に示し
た。プラスミドはpBR325とpAM330のフラグメ
ントから成ることを、K.J.Dannaの方法
（Methods in Enzymology 65，449，
Academic Press（1980））により確認した。 pAJ655を、ブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムATCC13869を親株とする三重栄養要
求（リジン、メチオニン、スレオニン）突然変異
株ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）に以下のようにして導入した。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64を５mlのCMG培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンG0.6ユニツト／mlを添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地
（pH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時
間プロトプラスト化を図つた。6000×ｇ 10分間
遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し
0.5mlのSMMPに再度懸濁した。 得られたプロトプラストを、pAJ655DNA2μg
と混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になるように添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませるために室温に２分間放置し
た。細胞をSMMP培地１mlで洗浄後、DNAを取
り込んだプロトプラストをSMMP培地１ml中に
再懸濁し、薬剤耐性を発現させるために、30℃で
３時間培養した。この培養液をpH7.0のプロトプ
ラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再
生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン12g、KCl 0.5g、グルコース
10g、MgCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、
ペプトン4g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸
（Difco社）1g、K2HPO4 0.2g、コハク酸ナトリ
ウム135g、寒天18g及びクロラムフエニコール
5μg／mlを含む。 30℃で３〜10日間培養後に出現したコロニー中
の５株を選びこれらを20μg／mlのクロラムフエ
ニコールを含むCMG培地で培養し、薬剤（クロ
ラムフエニコール）耐性株であることを確認し
た。 さらにプラスミドの存在を確認するため、ここ
で生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌せ
しめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
PAJ655と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つ
プラスミドを認めた。 pAJ655より次のようにしてpAJ43を造成した。
pAJ655を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64はクロラムフエニコール
100μg／mlを含むCMG寒天培地（ペプトン10g／
、酵母エキス10g／、グルコース5g／、
NaCl5g／、寒天20g／を含みpH7.2に調製し
たもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG
培地で培養後、クロラムフエニコール100μg／
を含むCMG液体培地に接種し、30℃で一晩培養
後、同濃度のクロラムフエニコールを含むCMG
培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養すること
によりクロラムフエニコール100μg／mlに耐性を
示す株を１株得た。本株のクロラムフエニコール
耐性度をCMG培地で調べたところ200μg／mlま
で耐性を示した。 上記の結果、得られたクロラムフエニコール高
濃度耐性株からpAJ43DNAを次のようにして調
製した。まず本株をクロラムフエニコールを
10μg／ml含む１のCMG液体培地に接種し、30
℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌した。常法
によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた後、
30000×ｇ、30分の超遠心により上清を得た。こ
れにポリエチレングリコール（最終濃度10％）を
添加してDNAを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈
澱物をTEN緩衝液10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ
50μg／mlで37℃、30分間反応）後、フエエノー
ル抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−20
℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を１mlのTEN緩衝
液に溶解した。このDNA溶液をアガロースゲル
電気泳動法（電圧ゲル１cm当り5V、15時間）に
よつて最終150μgの純粋なpAJ43プラスミドDNA
を分画採取した。 (3) pAJ43 DNAの性質 pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳
動によつた。 アガロースゲル電気泳動はシヤープ（P.A.
Sharp）らの方法（Biochemistry 12，3055
（1973））により、0.8％ゲルを用い、ゲル長さcm
当り、5Vで15時間、定電圧で泳動した。分子量
はpAJ43を１ヶ所切断する制限酵素Hind0.5ユ
ニツトをpAJ43 0.5μgに37℃、１時間反応させ、
切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マ
ーカー、λフアージのHindフラグメント
（BRLから購入）との移動度の比較によつて算出
し、3.4メガダルトンと計算された。 pAJ43DNAによるブレビバクテリウム・フア
ーメンタムNo.64の形質転換 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）を５mlのCMG培地で対数増殖
期の初期まで培養し、0.6ユニツト／mlになるよ
うにペニシリンＧを添加後さらに1.5時間振盪培
養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を0.5M
シユークロース、20mMマレイン酸、20mM塩化
マグネシウム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）
からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗浄した。
次いで10mg／mlのリゾチームを含むSMMP培地
に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図つ
た。6000×ｇにて10分間遠心分離後、プロトプラ
ストをSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁
した。このようにして得たプロトプラスト
pAJ43DNA1μgと混合し、ポリエチレングリコー
ルを最終濃度が30％になるように添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。プロトプラストをSMMP
培地１mlで洗浄後再度１mlのSMMPに懸濁し、
薬剤耐性を発現させるため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をpH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、MgCl2・
6H2O8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、ペプトン4g、酵
母エキス4g、カザミノ酸（Difco）1g、
K2HPO40.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g
及びクロラムフエニコール3μg／mlを含む。30℃
で10日間培養後に出現したコロニー中の５株を選
び、これを100μg／mlのクロラムフエニコールを
含むCMG培地で培養し、pAJ655保持株よりも高
いクロラムフエニコール耐性を示すことを確認し
た。さらにプラスミドの存在を確認するため、こ
こで生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌
せしめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にか
け、pAJ43と同じ分子量を持つプラスミドが存在
することを認めた。 pAJ43DNAの制限酵素切断地図の作成 制限酵素はBRLの市販品を使用し、制限酵素
によるpAJ43DNAの切断は、少なくとも３倍過
剰以上の酵素を使用して、各酵素毎に指定された
条件で行なつた。制限酵素切断地図作成のために
プラスミドDNAを２種以上の制限酵素で切断す
る場合には、第１の制限酵素切断断片を分離用ア
ガロースゲルよりタナカらの方法（Ｔ・
Tanaka.，B.Weisblum.J.Bacteriol.，121，354
（1975）により単離後、エタノール沈澱により濃
縮し第２の制限酵素で切断した。切断断片を実施
例(3)の方法によりアガロースゲル電気泳動にか
け、分子量を算出し、制限酵素切断地図を作成し
た。この結果からpAJ43はpAJ655からin vivoで
deletionにより生じたpBR325のクロラムフエニ
コール耐性遺伝子領域を含む約１メガダルトンと
pAM330の複製維持に必須の領域を含む約2.4メ
ガダルトンのフラグメントから成る小型プラスミ
ドであることが判明した。 pAJ43のコピー数の測定 pAJ43を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64（AJ 11997、FERM−
P6857）をクロラムフエニコール10μg／mlを含む
５mlのCMZG液体培地に接種し、30℃で一晩培
養後その0.1mlをクロラムフエニコール10μg／ml
を含む５mlのCMG液体培地に再度接種した。30
℃で対数増殖期の初期まで培養し1000μg／mlに
なるようにアンピシリンを添加後さらに２時間培
養し、遠心分離により菌体を集め10mg／mlのリゾ
チームを含むTEN緩衝液1.5mlに懸濁し37℃で２
時間インキユベート後、SDS（最終濃度４％）を
添加し65℃、20分間溶菌した。プロトプラストは
完全に溶菌したことを確認した後、フエノール抽
出し、ついで２倍量のエタノールの加え−20℃で
DNA沈澱させ、沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸
濁した。このDNA溶液をリボヌクレアーゼで処
理（リボヌクレアーゼ50μg／mlで37℃、60分
間反応）後、再度フエノール抽出し、ついで２倍
量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、
沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸濁後0.8％のアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、泳動ネガフイルムを
デンシトメーターにかけ、染色体DNAとプラス
ミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量
を3.0×109ダルトン、pAJ43を3.4×106ダルトン
として計算によりコピー数を求めたところ、染色
体あたり24コピー存在することが判明した。同様
の方法で求めたpAJ655のコピー数は11コピーで
あり、小型化することによりコピー数が倍増した
ことを認めた。
ス10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース５ｇを
含むCMG培地（pH7.2）１中に温度30℃でブ
レビバクテリウム・ラクトフアーメンタム
ATCC13869を対数増殖期後期まで培養し、菌体
を集めた。得られた菌体を、リゾチームとSDSに
より溶菌させる簡便法により溶菌せしめた後、
30000×ｇで30分間遠心分離し64mlの上澄液を得
た。上澄液中のプラスミドDNAは、上澄液にポ
リエチレングリコール（最終濃度10％）を添加し
沈降させた後、10mlのTEN緩衝液に溶解した。 DNAをリボヌクレアーゼで処理した後（リボ
ヌクレアーゼ150μg／mlで37℃、30分間反応）、
フエノール抽出し、ついで２倍量のエタノールを
加え−20℃℃でDNAを沈澱させ、沈澱を１mlの
TEN緩衝液に溶解した。このDNA溶液をアガロ
ースゲル電気泳動にかけ、ゲルから約74μgの純
粋なプラスミドDNAを分離した。 プラスミドpBR325 0.2μgに１ユニツトの制限
酵素BamH （BRLから購入）を37℃で60分
間反応させ、DNAを充分分解した。 プラスミドpAM330（1.2μg）に0.2ユニツトの
制限酵素Mboを37℃で15分間反応させ、DNA
を部分分解した。 得られたDNA断片を混合し制限酵素を不活化
するため65℃で10分間熱処理した後、ATPとジ
チオスレイトール存在下22℃で２時間0.01ユニツ
トのT4 DNAリガーゼを作用させた。T4 DNA
リガーゼを65℃、10分間の処理で不活化し、２倍
量のエタノールを加えた後、15000×ｇ 15分間
の遠心分離によりDNAを回収した。 このようにして得た複合プラスミドをトランス
フオーメイシヨンに使用した。 エシエリヒア・コリＣ−600（thr-，leu-，
thiamine-，r-，m-）（Meselson，M.and
Yuan，R.Nature，217，1110（1968））を20mlの
CMG培地に30℃で対数増殖期中期まで培養し、
菌体を集めた。Kushner等（“Genetic
Engineering”，p.17（1978），Elsevier／North
Holland Biomedical Press）の方法にしたがつ
て、得られたDNAを用いてＣ−600を形質転換し
た。 形質転換株は20μg／mlのクロラムフエニコー
ルを含むCMG培地で37℃、24時間培養し選択し
た。形質転換株の中からAJ11882（FERM−
BP136）を選択し、次の実験に用いた。 複合プラスミドpAJ655は、次のような方法に
よりAJ11882の溶菌液から分離した。AJ11882を
CMG培地で培養後、簡便法（TamaKa et al.，
J.Bacteriol.，121，354（1975））により溶菌せし
め、溶菌液をアガロースゲルにかけ、電気泳動に
かけた（Sharp et al.，Biochemistry12，3055
（1973））。分子量マーカーとの比較により、プラ
スミドの分子量は6.6メガダルトンと計算された。
プラスミドの制限酵素切断地図を第２図に示し
た。プラスミドはpBR325とpAM330のフラグメ
ントから成ることを、K.J.Dannaの方法
（Methods in Enzymology 65，449，
Academic Press（1980））により確認した。 pAJ655を、ブレビバクテリウム・ラクトフア
ーメンタムATCC13869を親株とする三重栄養要
求（リジン、メチオニン、スレオニン）突然変異
株ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）に以下のようにして導入した。 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64を５mlのCMG培地で対数増殖期の初期まで培
養し、ペニシリンG0.6ユニツト／mlを添加後、
さらに1.5時間振盪培養し、遠心分離により菌体
を集め、菌体を0.5Mシユークロース、20mMマ
レイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナ
ツセイブロス（Difco）からなるSMMP培地
（pH6.5）0.5mlで洗浄した。次いで10mg／mlのリ
ゾチームを含むSMMP培地に懸濁し30℃で20時
間プロトプラスト化を図つた。6000×ｇ 10分間
遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄し
0.5mlのSMMPに再度懸濁した。 得られたプロトプラストを、pAJ655DNA2μg
と混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になるように添加した後、DNAをプロトプ
ラストに取り込ませるために室温に２分間放置し
た。細胞をSMMP培地１mlで洗浄後、DNAを取
り込んだプロトプラストをSMMP培地１ml中に
再懸濁し、薬剤耐性を発現させるために、30℃で
３時間培養した。この培養液をpH7.0のプロトプ
ラスト再生培地上に塗布した。プロトプラスト再
生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン12g、KCl 0.5g、グルコース
10g、MgCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、
ペプトン4g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸
（Difco社）1g、K2HPO4 0.2g、コハク酸ナトリ
ウム135g、寒天18g及びクロラムフエニコール
5μg／mlを含む。 30℃で３〜10日間培養後に出現したコロニー中
の５株を選びこれらを20μg／mlのクロラムフエ
ニコールを含むCMG培地で培養し、薬剤（クロ
ラムフエニコール）耐性株であることを確認し
た。 さらにプラスミドの存在を確認するため、ここ
で生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌せ
しめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にかけ、
PAJ655と同じ分子量と制限酵素切断地図を持つ
プラスミドを認めた。 pAJ655より次のようにしてpAJ43を造成した。
pAJ655を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64はクロラムフエニコール
100μg／mlを含むCMG寒天培地（ペプトン10g／
、酵母エキス10g／、グルコース5g／、
NaCl5g／、寒天20g／を含みpH7.2に調製し
たもの）上で生育不可能であるが、本菌をCMG
培地で培養後、クロラムフエニコール100μg／
を含むCMG液体培地に接種し、30℃で一晩培養
後、同濃度のクロラムフエニコールを含むCMG
培地に適当量塗布し30℃１〜２日間培養すること
によりクロラムフエニコール100μg／mlに耐性を
示す株を１株得た。本株のクロラムフエニコール
耐性度をCMG培地で調べたところ200μg／mlま
で耐性を示した。 上記の結果、得られたクロラムフエニコール高
濃度耐性株からpAJ43DNAを次のようにして調
製した。まず本株をクロラムフエニコールを
10μg／ml含む１のCMG液体培地に接種し、30
℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌した。常法
によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた後、
30000×ｇ、30分の超遠心により上清を得た。こ
れにポリエチレングリコール（最終濃度10％）を
添加してDNAを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈
澱物をTEN緩衝液10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼ
50μg／mlで37℃、30分間反応）後、フエエノー
ル抽出し、ついで２倍量のエタノールを加え−20
℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を１mlのTEN緩衝
液に溶解した。このDNA溶液をアガロースゲル
電気泳動法（電圧ゲル１cm当り5V、15時間）に
よつて最終150μgの純粋なpAJ43プラスミドDNA
を分画採取した。 (3) pAJ43 DNAの性質 pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳
動によつた。 アガロースゲル電気泳動はシヤープ（P.A.
Sharp）らの方法（Biochemistry 12，3055
（1973））により、0.8％ゲルを用い、ゲル長さcm
当り、5Vで15時間、定電圧で泳動した。分子量
はpAJ43を１ヶ所切断する制限酵素Hind0.5ユ
ニツトをpAJ43 0.5μgに37℃、１時間反応させ、
切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マ
ーカー、λフアージのHindフラグメント
（BRLから購入）との移動度の比較によつて算出
し、3.4メガダルトンと計算された。 pAJ43DNAによるブレビバクテリウム・フア
ーメンタムNo.64の形質転換 ブレビバクテリウム・ラクトフアーメンタムNo.
64（ATCC39134）を５mlのCMG培地で対数増殖
期の初期まで培養し、0.6ユニツト／mlになるよ
うにペニシリンＧを添加後さらに1.5時間振盪培
養し、遠心分離により菌体を集め、菌体を0.5M
シユークロース、20mMマレイン酸、20mM塩化
マグネシウム、3.5％ペナツセイブロス（Difco）
からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗浄した。
次いで10mg／mlのリゾチームを含むSMMP培地
に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図つ
た。6000×ｇにて10分間遠心分離後、プロトプラ
ストをSMMPで洗浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁
した。このようにして得たプロトプラスト
pAJ43DNA1μgと混合し、ポリエチレングリコー
ルを最終濃度が30％になるように添加した後、
DNAをプロトプラストに取り込ませるために室
温に２分間放置した。プロトプラストをSMMP
培地１mlで洗浄後再度１mlのSMMPに懸濁し、
薬剤耐性を発現させるため、30℃で２時間培養し
た。この培養液をpH7.0のプロトプラスト再生培
地上に塗布した。プロトプラスト再生培地は蒸留
水１あたりトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、MgCl2・
6H2O8.1g、CaCl2・2H2O2.2g、ペプトン4g、酵
母エキス4g、カザミノ酸（Difco）1g、
K2HPO40.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g
及びクロラムフエニコール3μg／mlを含む。30℃
で10日間培養後に出現したコロニー中の５株を選
び、これを100μg／mlのクロラムフエニコールを
含むCMG培地で培養し、pAJ655保持株よりも高
いクロラムフエニコール耐性を示すことを確認し
た。さらにプラスミドの存在を確認するため、こ
こで生育したクロラムフエニコール耐性株を溶菌
せしめ、溶菌液をアガロースゲル電気泳動にか
け、pAJ43と同じ分子量を持つプラスミドが存在
することを認めた。 pAJ43DNAの制限酵素切断地図の作成 制限酵素はBRLの市販品を使用し、制限酵素
によるpAJ43DNAの切断は、少なくとも３倍過
剰以上の酵素を使用して、各酵素毎に指定された
条件で行なつた。制限酵素切断地図作成のために
プラスミドDNAを２種以上の制限酵素で切断す
る場合には、第１の制限酵素切断断片を分離用ア
ガロースゲルよりタナカらの方法（Ｔ・
Tanaka.，B.Weisblum.J.Bacteriol.，121，354
（1975）により単離後、エタノール沈澱により濃
縮し第２の制限酵素で切断した。切断断片を実施
例(3)の方法によりアガロースゲル電気泳動にか
け、分子量を算出し、制限酵素切断地図を作成し
た。この結果からpAJ43はpAJ655からin vivoで
deletionにより生じたpBR325のクロラムフエニ
コール耐性遺伝子領域を含む約１メガダルトンと
pAM330の複製維持に必須の領域を含む約2.4メ
ガダルトンのフラグメントから成る小型プラスミ
ドであることが判明した。 pAJ43のコピー数の測定 pAJ43を保持するブレビバクテリウム・ラクト
フアーメンタムNo.64（AJ 11997、FERM−
P6857）をクロラムフエニコール10μg／mlを含む
５mlのCMZG液体培地に接種し、30℃で一晩培
養後その0.1mlをクロラムフエニコール10μg／ml
を含む５mlのCMG液体培地に再度接種した。30
℃で対数増殖期の初期まで培養し1000μg／mlに
なるようにアンピシリンを添加後さらに２時間培
養し、遠心分離により菌体を集め10mg／mlのリゾ
チームを含むTEN緩衝液1.5mlに懸濁し37℃で２
時間インキユベート後、SDS（最終濃度４％）を
添加し65℃、20分間溶菌した。プロトプラストは
完全に溶菌したことを確認した後、フエノール抽
出し、ついで２倍量のエタノールの加え−20℃で
DNA沈澱させ、沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸
濁した。このDNA溶液をリボヌクレアーゼで処
理（リボヌクレアーゼ50μg／mlで37℃、60分
間反応）後、再度フエノール抽出し、ついで２倍
量のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、
沈澱物を少量のTEN緩衝液に懸濁後0.8％のアガ
ロースゲル電気泳動にかけ、泳動ネガフイルムを
デンシトメーターにかけ、染色体DNAとプラス
ミドDNAの割合を測定し、染色体DNAの分子量
を3.0×109ダルトン、pAJ43を3.4×106ダルトン
として計算によりコピー数を求めたところ、染色
体あたり24コピー存在することが判明した。同様
の方法で求めたpAJ655のコピー数は11コピーで
あり、小型化することによりコピー数が倍増した
ことを認めた。
第１図は、プラスミドpAM330の制限酵素切断
地図である。第２図は、プラスミドpAJ655の制
限酵素切断地図である。第３図は、プラスミド
pAJ43の制限酵素切断地図である。
地図である。第２図は、プラスミドpAJ655の制
限酵素切断地図である。第３図は、プラスミド
pAJ43の制限酵素切断地図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 分子量3.4メガダルトンであつて下記の第３
図に示す制限酵素地図を有するプラスミドベクタ
ーpAJ43 〔第３図〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57227911A JPS59120090A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | プラスミドベクタ−ｐＡＪ４３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57227911A JPS59120090A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | プラスミドベクタ−ｐＡＪ４３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59120090A JPS59120090A (ja) | 1984-07-11 |
| JPH0321154B2 true JPH0321154B2 (ja) | 1991-03-22 |
Family
ID=16868228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57227911A Granted JPS59120090A (ja) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | プラスミドベクタ−ｐＡＪ４３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59120090A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2165546B (en) * | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
-
1982
- 1982-12-27 JP JP57227911A patent/JPS59120090A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS59120090A (ja) | 1984-07-11 |
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