JPH0322587B2

JPH0322587B2 -

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Publication number: JPH0322587B2
Application number: JP57107615A
Authority: JP
Inventors: Makoto Nakamura; Katsunobu Doi; Tokio Kano; Akira Tamagawa
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1982-06-24
Filing date: 1982-06-24
Publication date: 1991-03-27
Also published as: JPS58225354A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は免疫分析法に関するものである。

抗原−抗体反応は、特定の抗原と抗体との間に
起る特異的な反応であり、これを利用して定量し
た血液あるいは体液中の微量抗原（抗体）量は、
診断や治療に供されている。この抗原−抗体反応
による分析法には、測定対象の抗原または抗体を
定量する際に用いる標識物質の種類から、放射性
同位元素を用いるラジオイムノアツセイ、酵素を
用いるエンザイムノムノアツセイ、蛍光物質を用
いるフローイムノアツセイがありなかでもラジオ
イムノアツセイは高感度な分析法として知られて
いる。いずれの分析法においても測定対象である
抗原（抗体）を定量する際にその抗原（抗体）お
よび標識抗体（抗原）の結合物と、有利標識抗体
（抗原）とのいわゆるＢ・ｆ分離が必要となり、
例えばラジオイムノアツセイによる免疫分析装置
として、流入口と流出口とを有し、測定対象の抗
原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原
を固相化した反応容器（chamber）を用いてＢ・
ｆ分離を行なうようにした貫流形のものが知られ
ている。この装置においては、例えばサンプル中
の所定の抗原を定量する場合は、反応容器として
測定抗原に反応する抗体を固相化したものを用
い、先ずこの反応容器（antibody chamber）の
流入口に連結されたチユーブ内で第１図Ａに示す
ようにサンプルと放射性同位元素で標識された抗
原とを混合して、第１図Ｂに示す測定対象の抗原
に対応する固相化した抗体を有する反応容器に送
り、ここで第１図Ｃに示すようにサンプル内の抗
原と標識抗原とを競合させて固相化抗体に結合さ
せ、固相化抗体に捕捉されなかつた遊離抗原は、
反応容器の流出口を経てシンチレーシヨンカウン
タに送つて遊離標識抗原をその放射能によつて計
数する。次に、反応容器内の固相化抗体に捕捉さ
れた結合抗原を溶離緩衝液により固定化抗体から
溶離させ、この溶離した抗原を第１図Ｄに示すよ
うに反応容器の流出口を経てシンチレーシヨンカ
ウンタに送つて標識抗原をその放射能によつて計
数する。このようにして、第２図に示すような放
射能特性を得、その両ピーク値すなわち固相化抗
体に捕捉されなかつた遊離標識抗原の計数値のピ
ーク値と、捕捉されて溶離された標識抗原の計数
値のピク値との比較に基いてサンプル中の所定の
抗原を定量する。

しかし、かかる分析装置においては、サンプル
と標識抗原とを反応容器の流入口に連結したチユ
ーブ内で混合するため、比較的長いチユーブが必
要となり、このためのコンタミネーシヨンが発生
し易いと共に、混合液を反応容器に送るのに時間
がかかり、分析処理能力が低い欠点がある。ま
た、放射性同位元素で標識した化合物は通常不安
定であるため、標識物質を再三調整する必要があ
る。更に、放射性同位元素は人体に危険であり、
環境汚染の立場からその廃棄が困難であると共
に、その取扱いには一定の資格と一定の基準で認
可された高価な施設を必要とし、また測定機器も
高価となる等の欠点がある。

以上の観点から最近では放射性同位元素を酵素
に置き換えて標識したエンザイムイムノアツセイ
や、蛍光物質を用いたフローイムノアツセイが、
ラジオイムノアツセイに匹敵し得る感度と精度を
持ち、安全に実施できる優れた分析法として採用
されている。

一方、上記ラジオイムノアツセイ、エンザイム
イムノアツセイ、フローイムノアツセイにおける
抗原−抗体反応のステツプには比較的長い反応時
間を必要とし、この反応時間を短縮するためには
高濃度での均一な抗原−抗体反応の反応系が必要
となる。このような均一な反応系を得るために、
例えばエンザイムイムノアツセイにおいて、微細
なセルロース粒子を固体担体として用い、抗原−
抗体反応の場である反応液と、固相担体表面との
界面を増大させ、かつ均一に固相担体粒子を浮遊
させるようしたものがある。この分析法は用手法
により行なわれ、例えばサンプル中のα−フエト
プロテイン（α−fetoprotein）抗原を定量する
場合には、先ず第３図Ａに示すように、サンプル
１とセルロース粒子表面に固相化した抗α−フエ
トプロテイン（anti−α−fetoprotein）抗体を含
む試薬２とを試薬管３に分注して抗原−抗体反応
を行なわせ、α−フエトプロテインと抗α−フエ
トプロテインとを結合させる。次に、第３図Ｂに
示すように、試験管３内に洗浄用緩衝液４を加え
て、3000r.p.m.、30秒遠心分離した後、上清を吸
引除去してセルロース担体粒子を試験管３内に残
す。その後第３図Ｃに示すように、試験管３内に
酵素標識抗体である共役抗α−フエトプロテイン
（conjugated anti−α−fetoprotein）を含む試
薬５を加えて抗原−抗体反応を行なわせ、抗α−
フエトプロテイン−α−フエトプロテイン−共役
抗α−フエトプロテインの結合物を形成させる。
次に、第３図Ｄに示すように、試験管３内に洗浄
用緩衝液４を加えて、3000r.p.m.、30秒遠心分離
した後、上清を吸引除去してセルロース担体粒子
を試験管３内に残す。この第３図Ｄに示す洗浄工
程を３回繰返すことにより、第３図Ｃにおける抗
原−抗体反応において反応しなかつた酵素標識抗
体を洗浄除去してＢ・ｆ分離を行なう。その後、
第３図Ｅに示すように、試験管３内に酵素基質液
６を加えて、セルロース粒子表面に捕捉された標
識酵素との酵素−基質反応を行なわせ、これによ
り捕捉された標識酵素量に比例した量の発色物質
を生成する。この酵素−基質反応を所定時間行な
わせた後、試験管３を3000r.p.m.、30秒遠心分離
して発色物質を含む上清を、第３図Ｆに示すよう
に比色セル７に吸引吐出して分光光度計８により
吸光度を測定し、この測定値に基いて、既知濃度
のサンプルから求めた吸光度とα−フエトプロテ
イン抗原との検量線からサンプル１中のα−フエ
トプロテイン抗原を定量する。

上述したエンザイムイムノアツセイにおいて
は、固相担体粒子として通常用いられているビー
ズ、ボール状のものを用いるアツセイ系に比較し
て、セルロース粒子を用いることで、抗原−抗体
反応の場である反応液と固相担体との界面を増大
させ、かつ固相担体粒子を均一に浮遊させること
により均一な反応系を得ている。しかし、この分
析法においては、サンプル１と固相化した抗体を
有するセルロース粒子を含む試薬２との抗原−抗
体反応後にセルロース粒子とその反応液を分離す
るため、セルロース粒子と酵素標識抗体を含む試
薬５との抗原−抗体反応後にセルロース粒子とそ
の反応液を分離するため、およびセルロース粒子
と酵素基質液６との酵素−基質反応後に、その反
応液（発色物質を含む）を比色セル７に分離して
分取するために、それぞれ遠心分離が必要となる
ため、操作が面倒となる欠点がある。また、遠心
分離後その上清を吸引する際にセルロース粒子も
吸引してしまう技術的難点もある。更に、上述し
た分析法においては、発色物質を含む反応液を比
色セル７に移した後、試験管３内に残つたセルロ
ース粒子を除去するのが困難なため、試験管３を
ポリスチレン製でデイスポーザブルとしている
が、このように試験管３を使い捨てすると、サン
プルが血清、血漿等の体液で測定終了後反応液等
の廃棄物を消毒する場合には、反応液と試験管と
の両方を消毒しなければならないため、廃棄処理
が極めて繁雑となる欠点がある。

本発明の目的は上述した種々の欠点を除去し、
簡単かつ迅速に測定対象の抗原または抗体を定量
でき、特に自動化に適した免疫分析法を提供しよ
うとするものである。

本発明の免疫分析法は、測定対象の抗原または
抗体と特異的に反応する抗体または抗原を固相化
した懸濁性の粒子を含む第１試薬とサンプルとを
混合して抗原−抗体反応を行わせた後、その反応
液を前期粒子を通過させないフイルタに通して、
前記粒子をフイルタで分離する工程と、この分離された粒子と、前記測定対象の抗原ま
たは抗体と特異的に反応する抗体または抗原を結
合した標識物質を含む第２試薬とを反応させた
後、その反応液を前記フイルタに通して、前記粒
子をフイルタで分離する工程と、この分離された粒子と、前記標識物質の存在下
で特定の物質を生成し得る第３試薬とを反応させ
た後、その反応液を前記フイルタに通して該フイ
ルタを通過した液体中に含まれる前記特定の物質
を比色測定して前記サンプル中の測定対象の抗原
または抗体の定量を行う工程とを有することを特
徴とするものである。

さらに、本発明の免疫分析法は、測定対象の抗
原または抗体と特異的に反応する抗体または抗原
を固相化した懸濁性の粒子とサンプルとを混合し
て抗原−抗体反応を行わせた後、その反応液を、
上方に設けられた注入口と、該注入口の底に配置
された前記粒子を通過させないフイルタとを有す
る反応容器に通して、前記粒子をフイルタで分離
する工程と、前記測定対象の抗原または抗体と特異的に反応
する抗体または抗原を結合した標識酵素を、前記
注入口から前記反応容器中に注入して前記粒子と
反応させた後、該粒子をフイルタで分離する工程
と、前記標識酵素の存在下で特定の物質を生成し得
る基質溶液を、前記注入口から前記反応容器中に
注入して前記粒子に結合した前記標識酵素と反応
させ、これにより発生する発色物質を測定する工
程とを有することを特徴とするものである。

以下図面を参照して本発明を詳細に説明する。

第４図は本発明の免疫分析法に用いられる反応
容器の一例の構成を示す断面図である。この反応
容器１１は注入内１２と排出口１３とを有する。
注入口１２および排出口１３を結ぶ通路１４の一
部には該通路１４を閉塞するように、測定対象の
抗原または抗体と特異的に反応する抗体または抗
原を固相化した粒子の通過を阻止し、反応液等を
通過させる例えばガラスより成るフイルタ１５を
設ける。また、フイルタ１５の近傍で排出口１３
側には例えばステンレス製の金網より成るストツ
パ１６を設けると共に、これらフイルタ１５とス
トツパ１６との間に例えばシリコンゴムより成る
板弁１７を配置し、反応容器１１内の圧力方向に
応じて第５図Ａに示すように板弁１７をフイルタ
１５から離間させて反応液等をフイルタ１５を通
して排出口１３から排出させると共に、第５図Ｂ
に示すように板弁１７をフイルタ１５に密着させ
て反応液等のフイルタ１５の通過を阻止するよう
構成する。なお、フイルタ１５は強度的に許容さ
れる限り厚さを薄くするのが好適である。

第６図Ａ〜Ｉは第４図に示した反応容器１１を
用いる本発明の免疫分析法の一例の順次の工程を
説明するための線図であり、反応容器１１は模式
的に示してある。本例では反応容器１１の排出口
１３を二方弁２１を介して空気中に開放すると共
に、二方弁２２、ポンプ２３および二方弁２４を
介して空気中に開放する。先ず、第６図Ａにおい
て二方弁２１および二方弁２２を閉、二方弁２４
を開としてポンプ２３を吸引作動させて空気を吸
引した後、二方弁２２を開、二方弁２４を閉とし
てポンプ２３を排出作動させて吸引した空気を排
出口１３から反応容器１１内に供給し、これによ
り板弁１７を第５図Ｂに示すようにフイルタ１５
を密着させて反応容器１１内の通路１４を閉塞し
た状態（以下この状態を「板弁１７の閉」と称す
る）、サンプルカツプ２５に収容されたサンプル
２６をポンプ２７およびサンプルノズル２８を介
して注入口１２から反応容器１１内に分注すると
共に、試薬タンク２９に収容された測定対象の抗
原（抗体）と特異的に反応する抗体（抗原）を固
相化した粒子を含む第１試薬３０をポンプ３１お
よび分注ノズル３２を介して注入口１２から反応
容器１１内に分注して混合液３３を得、サンプル
２６中の抗原（抗体）と固相化した抗体（抗原）
との抗原−抗体反応を室温または恒温槽内で一定
時間行なわせる。

第１試薬３０は、本例では抗体（抗原）の固相
担体粒子として平均直径100μｍ、比重1.03〜1.05
の球状ナイロン粒子を用い、これを1NHCl溶液
で60℃、３時間加水分解した後純水で洗浄し、次
に１％グルタルアルデヒド中で24℃、１時間反応
させた後0.25Mリン酸ナトリウム緩衝液（PH7.5）
で洗浄し、その後1.0mg／mlの割合で測定対象の
抗原（抗体）と特異的に反応する抗体（抗原）を
加えた0.25Mリン酸ナトリウム緩衝液中で４℃、
24時間反応させて抗体（抗原）を固相化し、次に
その反応液を除去して0.25Mリン酸ナトリウム緩
衝液で洗浄した後0.1MNaCl、1mMMgCl₂、0.1
％牛血清アルブミン、0.1％NaN₃を含む0.01Mリ
ン酸ナトリウム緩衝液中に浮遊させて構成する。
この懸濁性の粒子からなる第１試薬３０は４℃で
保存する。

このように、固相担体粒子として、平均直径
100μｍ、比重1.03〜1.05の懸濁性の球状ナイロン
粒子を用いれば、抗原−抗体反応の場である混合
液と、固相担体表面との界面を大きくとることが
できると共に、これを混合液中に均一に浮遊させ
ることができ、したがつて均一な反応系を得るこ
とができる。

次に、第６図Ｂにおいて、二方弁２２が開、二
方弁２４が閉の状態下でポンプ２３を吸引作動さ
せ、これにより板弁１７を開いて反応容器１１内
の混合液３３をフイルタ１５を通してナイロン粒
子と分離して吸引した後、二方弁２１を開として
ポンプ２３を排出作動させて吸引した混合液を排
出する。

その後、第６図Ｃにおいて、板弁１７が閉とな
るように二方弁２１，２２，２４およびポンプ２
３を作動させた状態で、洗浄液タンク３４内に収
容された洗浄液３５をポンプ３６および分注ノズ
ル３７を介して注入口１２から反応容器１１内に
分注してから、第６図Ｂにおいて説明したように
二方弁２１，２２，２４およびポンプ２３を作動
させて板弁１７を開として分注した洗浄液を排出
し、これによりフイルタ１５およびナイロン粒子
を洗浄する。この洗浄工程は１回または複数回行
なう。

次に、第６図Ｄにおいて、板弁１７を開として
試薬タンク３８に収容された測定対象の抗原（抗
体）に対する抵抗（抗原）に酵素標識した第２試
薬３９を、ポンプ４０および分注ノズル４１を介
して注入口１２から反応容器１１内に分注して、
室温または恒温槽内で一定時間抗原−抗体反応を
行なわせ、これにより酵素標識抗体（抗原）−測
定抗原（抗体）−固相化抗体（抗原）を結合させ
る。この第２試薬３９の標識酵素としては、例え
ばマレートデヒドロゲナーゼ、グルコース・６・
リン酸脱水素酵素、グルコース酸化酵素、ホース
ラデイツシユパーオキシダーゼ、アセチルコリン
エステラーゼ、アルカリホスフアターゼ、ペルオ
キシダーゼ、コリコアミラーゼ、リゾチーム、β
−Ｄ・ガラクトシダーゼ等の高い活性を有し、使
用される基質が比較的安価でかつ安定な酵素を使
用することができる。

上記の抗原−抗体反応後は、第６図ＢおよびＣ
において説明した操作を行なつてフイルタ１５お
よびナイロン粒子を洗浄液で洗浄し、その後第６
図Ｅに示すように、板弁１７を閉として試薬タン
ク４２に収容された標識酵素に対する基質溶液で
ある第３試薬４３をポンプ４４および分注ノズル
４５を介して注入口１２から反応容器１１内に分
注し、室温または恒温槽内で一定時間酵素−基質
反応を行なわせ、これにより発色物質を生成す
る。この第３試薬４３の基質溶液は、第２試薬３
９の標識酵素が、アルカリホスフアターゼのとき
はフエニルリン酸・２・ナトリウムおよび４−ア
ミノアンチピリン、ベルオキシダーゼのときは０
−フエニレンジアミン、β−Ｄ−ガラクトシダー
ゼのときは０−ニトロフエノール・β−Ｄ−ガラ
クトシド、グルコース酸化酵素のときはβ−Ｄ−
グルコース等を用いることができる。

一定時間の酵素−基質反応を行なわせた後は、
第６図Ｆに示すように、板弁１７を閉じた状態で
反応停止液タンク４６内に収容した反応停止液４
７をポンプ４８および分注ノズル４９を介して注
入口１２から反応容器１１内に分注し、これによ
り酵素−基質反応を停止させて発色物質の増加を
停止させた反応液５０を得る。酵素−基質反応は
PHを変化させることで容易にその反応を停止させ
ることができるから、反応停止液４７としては
HCl、H₂SO₄溶液等を用いることができる。

その後、第６図Ｇにおいて、二方弁２２を開、
二方弁２４を閉としてポンプ２３を吸引作動さ
せ、これにより板弁１７を開いて反応容器１１内
の反応液５０をフイルタ１５を通してナイロン粒
子と分離して吸引した後、二方弁２１を開として
ポンプ２３を排出作動させて吸引した反応液５０
を比色セル５１内に収容する。

次に、第６図Ｈに示すように、比色セル５１内
に収容された反応液５０の吸光度を分光光度計５
２で測定し、この測定値に基いて、既知濃度のサ
ンプルから求めた吸光度と測定抗原（抗体）との
検量線からサンプル２２中の測定抗原（抗体）を
定量する。また、反応容器１１は第６図Ｂおよび
Ｃにおいて説明した操作を行なつて洗浄液で洗浄
した後、第６図Ｉに示すように反応容器１１内に
残存する洗浄液およびナイロン粒子を吸引ノズル
５３および吸引ポンプ５４を介して排出して次の
サンプルの分析に備える。

上述した吸引ノズル５３は、例えば第７図Ａお
よびＢに正面図および底面図をそれぞれ示すよう
に、ノズル先端の端面にナイロン粒子が通過し得
る切欠き５５を形成したものを用いる。このよう
な吸引ノズル５３を用いれば、その先端をフイル
タ１５を接触させて吸引することにより、ナイロ
ン粒子および残留する洗浄液を効果的に吸引除去
することができる。

第８図は本発明の免疫分析法に用いられる反応
容器の他の例の構成を示す断面図である。この反
応容器６１はフイルタ１５の注入口１２側の面を
凹面状に加工した点のみが第４図に示すものと異
なるものである。この反応容器６１を用いれば第
６図Ｉに示す吸引工程において、ナイロン粒子は
フイルタ１５の凹面の中心部に集まるから、これ
を容易かつ確実に吸引除去することができる。

なお、本発明は上述した例にのみ限定されるも
のではなく、幾多の変形または変更が可能であ
る。例えば、上述した反応容器１１，６１におい
てはいずれも板弁１７およびストツパ１６を設け
たが、フイルタ１５の孔径、反応容器の内径、反
応（混合）液等の量を適切に設定すれば、これら
板弁１７およびストツパ１６を用いることなく排
出口１３側からの空気圧により反応（混合）液等
を反応容器内に有効に保持することができる。ま
た、上述した例では測定対象の抗原（抗体）に特
異的に反応する抗体（抗原）の固相担体粒子とし
てナイロン粒子を用いたが、セルロース、ABS、
ポリスチレン、スチレン−ブタジエン樹脂等の粒
子、あるいは鉄粉のような比重の大きい芯物質の
表面を比重の小さい膜で被覆して比重をコントロ
ールしたマイクロカプセル等を用いることもでき
る。更に、上述した分析法においては、第６図Ｆ
において反応停止液４７を分注して酵素−基質反
応を停止させたが、一定時間の酵素−基質反応後
その反応液５０をフイルタ１５を通して比色セル
５１に吐出させるようにすれば、ナイロン粒子に
捕捉されている標識酵素はフイルタ１５によつて
ナイロン粒子と基質液とに分離され、これにより
基質は酵素作用を受けなくなつて反応が停止する
から、第６図Ｆの工程を除くことができる。更に
また、上述した例では反応液５０を比色セル５１
に移して測光したが、反応容器１１を通して直接
測光することもできる。

以上の実施例によれば、測定対象の抗原（抗
体）と特異的に反応する抗体（抗原）を固相化す
る固相担体粒子として、混合液と固相担体表面と
の界面が大きく、かつ均一に浮遊し得るようにそ
の比重、形状、大きさをコントロールしたものを
用いたから、均一な反応系を得ることができる。

以上詳述したように、第１の発明によれば、懸
濁性の粒子を用いて反応およびフイルタによる粒
子の分離を３回繰り返し、フイルタを通過した液
体中に含まれる特定物質を比色測定するようにし
たから、粒子の存在による比色測定への悪影響が
なく、サンプル中の測定対象の抗原または抗体の
定量を正確に行うことができる。

また、第２の発明によれば、上方に設けられた
注入口と、該注入口の底に配置された懸濁性の粒
子を通過させないフイルタとを有する反応容器を
用いて分析を行うようにしたので、遠心分離を行
うことなく粒子を分離することができ、したがつ
て分析操作が簡単になり、自動化が容易にでき
る。

【図面の簡単な説明】

第１図Ａ〜Ｄはラジオイムノアツセイによる順
次の工程を説明するための線図、第２図は第１図
に示すラジオイムノアツセイによる計数値の一例
を示す線図、第３図Ａ〜Ｆはエンザイムイムノア
ツセイによる従来の順次の工程を説明するための
線図、第４図は本発明の免疫分析法に用いられる
反応容器の一例の構成を示す断面図、第５図Ａお
よびＢは第４図に示す反応容器の板弁の動作を説
明するための線図、第６図Ａ〜Ｉは本発明の免疫
分析法の一例の順次の工程を説明するための線
図、第７図ＡおよびＢは第６図Ｉに示す吸引ノズ
ルの一例の構成を示す正面図および底面図、第８
図は本発明の免疫分析法に用いられる反応容器の
他の例の構成を示す断面図である。１１，６１……反応容器、１２……注入口、１
３……排出口、１４……通路、１５……フイル
タ、１６……ストツパ、１７……板弁、２１，２
２，２４……二方弁、２３，２７，３１，３６，
４０，４４，４８，５４……ポンプ、２５……サ
ンプルカツプ、２６……サンプル、２８……サン
プルノズル、２９，３８，４２……試薬タンク、
３０……第１試薬、３２，３７，４１，４５，４
９……分注ノズル、３３……混合液、３４……洗
浄液タンク、３５……洗浄液、３９……第２試
薬、４３……第３試薬、４６……反応停止液タン
ク、４７……反応停止液、５０……反応液、５１
……比色セル、５２……分光光度計、５３……吸
引ノズル、５５……切欠き。

Claims

【特許請求の範囲】１測定対象の抗原または抗体と特異的に反応す
る抗体または抗原を固相化した懸濁性の粒子を含
む第１試薬とサンプルとを混合して抗原−抗体反
応を行わせた後、その反応液を前記粒子を通過さ
せないフイルタに通して、前記粒子をフイルタで
分離する工程と、この分離された粒子と、前記測定対象の抗原ま
たは抗体と特異的に反応する抗体または抗原を結
合した標識物質を含む第２試薬とを反応させた
後、その反応液を前記フイルタに通して、前記粒
子をフイルタで分離する工程と、この分離された粒子と、前記標識物質の存在下
で特定の物質を生成し得る第３試薬とを反応させ
た後、その反応液を前記フイルタに通して該フイ
ルタを通過した液体中に含まれる前記特定の物質
を比色測定して前記サンプル中の測定対象の抗原
または抗体の定量を行う工程とを有することを特
徴とする免疫分析法。２前記第２試薬の標識物質として標識酵素を用
い、前記第３試薬として前記標識酵素に対する基
質溶液を用いることを特徴とする特許請求の範囲
第１項記載の免疫分析法。３測定対象の抗原または抗体と特異的に反応す
る抗体または抗原を固相化した懸濁性の粒子とサ
ンプルとを混合して抗原−抗体反応を行わせた
後、その反応液を、上方に設けられた注入口と、
該注入口の底に配置された前記粒子を通過させな
いフイルタとを有する反応容器に通して、前記粒
子をフイルタで分離する工程と、前記測定対象の抗原または抗体と特異的に反応
する抗体または抗原を結合した標識酵素を、前記
注入口から前記反応容器中に注入して前記粒子と
反応させた後、該粒子をフイルタで分離する工程
と、前記標識酵素の存在下で特定の物質を生成し得
る基質溶液を、前記注入口から前記反応容器中に
注入して前記粒子に結合した前記標識酵素と反応
させ、これにより発生する発色物質を測定する工
程とを有することを特徴とする免疫分析法。