JPH032874B2 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はガングリオシドの分子内エステル誘導
体の製造方法に関する。ガングリオシドの分子内
エステル誘導体は、神経系に何らかの損傷を与え
る疾患や事故に起因する神経系統の疾病を治療す
るのに使用される。 ガングリオシドはグリコスフインゴリピドの一
員であつて、シアリン酸部分およびセラミドに結
合している炭水化物部分を有する構造を持つてい
る。この炭水化物部分は、少なくとも１個のガラ
クトースまたはグルコース部分および少なくとも
１個のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセ
チルガラクトサミン部分を含んでいる。従つて、
ガングリオシドの一般的な構造は次の一般式で表
すことができる： １分子のシアリン酸｛−１モルのセラミド−少
なくとも１モルのガラクストースまたはグルコー
ス−少なくとも１モルのＮ−アセチルグルコサミ
ンまたはＮ−アセチルガラクトサミン｝ ここで、全ての部分はグリコシド結合によつて
結合している。 多数のガングリオシドが確認されており、それ
らは特に神経組織、とりわけ脳組織に豊富にある
ことが知られている。種々の研究の結果、ガング
リオシド中の最も重要なシアリン酸はＮ−アセチ
ルノイラミン酸（NANA）であり、Ｎ−グリコ
リルノイラミン酸はさほど重要でないことがわか
つた。確認されている多数のガングリオシドの
内、国際的な記号で標織された以下のガングリオ
シドが、牛の脳組織から抽出されたガングリオシ
ド混合物中に多量存在することがわかつた： 【表】 〓２〓 〓２〓
NANA NANA
ここでGlcはグルコース、GalNACはＮ−アセ
チルガラクトサミン、Galはガラクトース、Cer
はセラミ、ド、NANAはＮ−アセチル−ノイラ
ミン酸を表し、（ ）の中の％は牛の脳組織から
抽出されたガングリオシド混合物中の各ガングリ
オシドの含有量を表す。 ガングリオシド神経系で重要な役割を果たして
いることはよく知られており、また最近、ガング
リオシドが中枢神経系の病変および末梢神経系の
疾病の治療に有用であることが報告された
（Actapsychiat.Scand.，55102，1977；Eur.Med.
phys.，13１，1977；Ric.Sci.Educ.Perm.９115，
1978；Adv.Exp.Biol.71275，1976；
Electromyogr.Clin，Neurophysiol.，19353，
1979；Minerva Medica，693277，1978；
Minerva Stomat.，27177，1978；Med，del
Lavoro，68（1977）；Brain Res.197236，1980。） ガングリオシドの治癒作用は、主として神経組
織における成長現象を刺激すること、および神経
刺激伝達に関連する膜酵素、例えば酵素（Na+，
K+）ATPアーゼを活性化することにあると考え
られている（Brain Res.，197，236，1980；
Leonら、J.of Neurochem.，37350，1981）。 ガングリオシドで刺激された神経成長は、損傷
を受けた神経組織の治癒および再生を促進するこ
とになろう。 神経系の疾病を治癒するに当たり、ガングリオ
シドより効果の大きい化合物を見い出そうとする
研究がなされて来た。 本発明者らは、ガングリオシドのある種の誘導
体が、神経成長刺激において、および神経刺激伝
達に関係している膜酵素、例えば酵素（Na+，
K+）ATPアーゼを活性化する点に於て、ガング
リオシドより活性が強いことを見い出した。具体
的には、ガングリオシドの分子内エステル誘導体
が神経系の疾病を治療するのに特に有効であり、
もとのガングリオシドより活性が強いことを見い
出した。インビボおよびインビトロ実験の結果、
神経成長刺激において、そしてまた、神経伝達に
関与している（Na+，K+）ATPアーゼ膜酵素を
活性化する点において、この分子内エステル誘導
体はもとのガングリオシドよりも優れていること
がわかつた。 これまでに、ガングリオシドの分子内エステル
誘導体と思われる極く僅かな物質が、極く少量、
脳組織から分離されている。ガングリオシドの分
子内エステルは、シアリン酸のカルボキシル基
と、炭水化物部分の１つの炭水化物または同じガ
ングリオシド分子内のもう１つの隣接するシアリ
ン酸の水酸基との反応によつて形成される（J.oF
Neurochemistry，34，1351，1980，Bull.of
Molecular Biology and Medicine，３，170，
1978）。ガングリオシドの分子内エステル誘導体
の構造は、例えば次の様に表わすことが出来る
が、これは勿論１つの例示に過ぎない。 上記式〔〕において、シアリン酸部分のＲは
ＨまたはOH、セラミド基中のR1はオレイン酸、
ステアリン酸またはリノール酸の様な脂肪酸を表
わす。 式〔〕のガングリオシド分子内エステル誘導
体は、シアリン酸のカルボキシル基が炭水化物部
分の１つ、具体的にはガラクトースの水酸基とエ
ステル結合しているものである。この分子内エス
テル結合が形成すると、シアリン酸と炭水化物部
分との間の通常のグリコシド結合と一緒になつ
て、通常５または６員環のラクトン環が形成され
る。これがガングリオシドの分子内エステル誘導
体の構造の特徴である。式〔〕は例示的に示し
たものであり、シアリン酸のカルボキシル基が炭
水化物部分の１つの水酸基とエステル結合するこ
とによつて５員環またはそれより大きいその他の
ラクトン環が形成し得ることに注意すべきであ
る。 既述した様に、シアリン酸のカルボキシル基
が、もとのガングリオシドにおいてはそのシアリ
ン酸がグリコシド結合によつて結合している隣接
するシアリン酸とエステル結合した場合にも、ガ
ングリオシドの分子内エステル誘導体が形成され
る。この場合の構造は下式で表わすことができ
る： ここでR2はシアリン酸部分にグリコシド結合
している炭水化物部分を表わす。 もう１つのガングリオシド分子内エステル誘導
体は下記〔〕で表わすことができる： ここでR3は隣接するシアリン酸がエステル結
合している炭水化物部分を表わす。従つて、式
〔〕は、シアリン酸がそれに隣接するシアリン
酸にエステル結合しており、そしてそれ自体は炭
水化物部分にエステル結合しているガングリオシ
ド分子内誘導体を表わしている。従つて、一般
に、炭水化物部分、少なくとも１個のセラミドお
よび少なくとも１個のシアリン酸部分から形成さ
れており、１個またはそれ以上のシアリン酸が炭
水化物部分にエステル結合しており、そして／ま
たは１個またはそれ以上のシアリン酸が隣接する
シアリン酸にエステル結合しているガングリオシ
ド分子内エステル誘導体であつて、上記した化合
物の種々の類縁体を形成させることができる。即
ち、ガングリオシドには多数の分子内エステル誘
導体が可能であつて、前記したものはその例示に
過ぎない。 ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造方
法としては、以下のものが知られている： １ ガングリオシドを酢酸またはトリクロロ酢酸
溶液中に入れて放置するだけで分子内エステル
を生成せしめるもの（Sphingolipids，
Sphingolipidoses and Allied Disorders，
Adv.Exp.Med.Biol.1995，1972；Neurochem.
281133，1977）。この方法によれは、ガングリ
オシドに対して非常に高い比率の酢酸を使用し
なければならず、また、ガングリオシドを完全
に変換することはできない。従つて、最終的に
精製工程が必要であり、これは通常イオン交換
樹脂、例えばセフアデツクスを用いて行われ
る。 ２ 水性媒質中での水溶性カルボジイミドとガン
グリオシドとの反応（Carbohydr.Res.41 344，
1975）。この方法は、反応が水性媒質中で行わ
れるので、ガングリオシドを完全に変換するこ
とはできない。この方法は収率が非常に悪く、
最終的に分子内エステル生成物を精製しなけれ
ばならない。 本発明は、高収率でガングリオシド分子内エス
テル誘導体を製造するための新規な方法、特に完
全にラクトン化されたガングリオシド分子内エス
テル誘導体の製造方法を提供するものである。即
ちその方法は、ガングリオシドまたはその塩を非
水性有機溶媒中、ラクトン化試薬と無水条件下で
反応させることからなる。さらに詳しくは、哺乳
動物から得たガングリオシドまたはガングリオシ
ド混合物をイオン交換樹脂で処理して該ガングリ
オシドのカルボキシレート基をカルボキシル基ま
たはその塩（３級窒素塩）に変換し、得られたガ
ングリオシドまたはガングリオシド混合物を、非
水性有機溶媒中、無水条件下、ラクトン化試薬と
反応させ、次いでガングリオシド分子内エステル
誘導体をアセトンで沈澱せしめることからなる。
本発明で使用される適当な有機溶媒はジメチルス
ルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド
（DMF）、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタ
ン、ピリジンおよびスルホラン並びにそれらの混
合物などである。好適なラクトン化試薬として
は、有機溶媒に可溶のカルボジイミド類、例えば
ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンジルイソ
プロピルカルボジイミド、およびベンジルエチル
カルボジイミド、２−クロロ−１−メチル−ピリ
ジニウム塩類、エトキシアセチレンおよびウツド
ワード試薬（Ｎ−エチル−５−フエニルイソオキ
サゾリウム−3′−スルホネート）などが含まれ
る。ガングリオシドを水性媒質中でカルボジイミ
ドと反応させる先行技術の方法では、分子内エス
テル誘導体の収率は非常に低いが、非水性媒質中
でガングリオシドを反応させる本発明方法では、
所望の分子内エステル誘導体の収率は先行技術に
おける可能な収率よりも高く、実質的に定量的で
あることがわかつた。本発明方法に於いて使用さ
れる出発物質としてのガングリオシドは、哺乳動
物、最も好ましくは牛の脳組織から抽出される。
以下の実施例は、本発明方法によるガングリオシ
ドの分子内エステル誘導体の製造法を例示するも
のである。 実施例 １ 牛の脳からガングリオシド混合物を抽出し、そ
の５ｇをDMSO50mlに溶解する。次いで無水の
スチレン型樹脂（スルホン酸）（50〜100メツシ
ユ、H+型）４ｇをこの混合物に加え、全体を室
温で30分間撹拌する。イオン交換樹脂によるこの
処理でガングリオシドの全てのカルボキシレート
はカルボキシル基（−COOH）に変換される。
適当な物理的分析、例えば原子吸光分析により全
てのカルボキシレート基が変換されたかどうかを
確認する。次いで樹脂を吸引濾過し、溶液をジシ
クロヘキシルカルボジイミド1.5ｇで処理し、１
時間放置する。沈澱したジシクロヘキシルウレア
を濾過して除き、残つた溶液をアセトン100mlで
処理するとガングリオシドの分子内エステル誘導
体が沈澱する。収量4.6ｇ（理論値の約90〜95
％）。 分子内エステル誘導体は赤外吸収スペクトルお
よび薄層クロマトグラフイーで確認する。 IR（KBr法） このエステル−ラクトン結合は
1750cm-1に吸収を示す。 薄層クロマトグラフイー シリカゲルプレートを
用い、CHCl3／MeOH／0.3％CaCl2（容量比：
55／45／10）で展開した時の分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85の範囲にある。この目的生
成物のRf値は、出発物質混合物のRf値より高い。
このクロマトグラフイーの結果、出発物質が存在
しないことがわかる。0.1N Na2CO3溶液を用い
て60℃で１時間処理するとエステル結合が開裂
し、出発物質として用いたガングリオシドの混合
物が得られる。 実施例 ２ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50w×８（100〜200
メツシユのトリエチルアンモニウム型）20ｇを充
填したカラムを通す（この処理でガングリオシド
の全てのカルボキシレート基はトリエチルアンモ
ニウム塩に変換される）。高減圧下で脱水したこ
の生成物を、超音波処理浴を使つて、トリエチル
アミン８mlを含む無水テトラヒドロフラン200ml
に溶かす。この溶液を、40mMの２−クロロ−１
−メチル−ピリジニウム塩（アニオンは、例えば
沃素、トルエン−４−スルホネート、トリフルオ
ロメタンスルホネートなどであつてよい）を含有
している無水テトラヒドロフラン600mlに、絶え
ず撹拌し、45℃の一定の温度に保ちながら、４時
間で徐々に添加する。この反応を45℃で18時間行
う。 過剰の試薬を濾過し、混合物を窒素気流下で濃
縮し、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物90mlに再溶解し、アセトン450ml中
で沈澱させる。最後に生成物を高減圧下で乾燥す
る。収量7.9ｇ（89.7％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85の範囲にあつた。この目的
生成物のRf値は、出発化合物混合物のRf値より
も高い。クロマトグラフイーにより、出発物質の
存在しないことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液に
より、60℃で１時間処理するとエステル結合が開
裂して、もとのガングリオシド化合物が得られ
る。 ガングリオシド混合物の分子内エステルまたは
内部エステルの1RスペクトルをKBr法で測定し
たところ、1750cm-1に典型的なエステル吸収を示
した。 実施例 ３ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex 50wx ８（100〜200メツシユのトリ
エチルアンモニウム型）10ｇを充填したカラムに
通す。高減圧下で脱水したこの生成物を、超音波
処理浴を用いて、トリエチルアミン４mlを含有し
ている無水テトラヒドロフラン200mlに溶解する。 この溶液を、20mMの２−クロロ−１−メチル
−ピリジニウム塩（ここで、アニオンは、例えば
沃素、トルエン−４−スルホネート、トリフルオ
ロメタンスルホネートなどであつてよい）を含有
している無水テトラヒドロフラン600mlに、絶え
ず撹拌し、45℃の一定温度に保ちながら４時間で
徐々に添加する。この反応を45℃で18時間行う。 過剰の試薬を濾過し、混合物を窒素気流中で濃
縮し、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で
沈澱させる。最後に生成物を高減圧下で乾燥す
る。収量7.0ｇ（収率88.4％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.7）は出発物質のそれ（0.65）より高かつた。
このクロマトグラフイーの結果から、出発物質が
含まれていないことがわかる。Na2CO3の0.1N溶
液により60℃で１時間処理すると、エステル結合
が開裂し、もとのガングリオシドが得られる。
GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr法
により測定すると、1750cm-1に典型的なエステル
吸収が見られた。 実施例 ４ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50wx8（100〜200メ
ツシユのピリジニウム型）20ｇを充填したカラム
に通す（この処理でガングリオシドの全てのカル
ボキシレート基はピリジニウム塩に変換される）。
高減圧下で脱水したこの生成物を無水テトラヒド
ロフラン800mlとエトキシアセチレン4.2ｇ
（60mM）に溶解する。この混合物を３時間還流
する（還流器は−10℃に冷却し、脱水バルブを備
えつける）。溶媒および過剰のエトキシアセチレ
ンを除去した後、残留物をクロロホルム／メタノ
ール（１：１）の混合物80mlに溶解し、アセトン
400ml中で沈澱させる。収量8.1ｇ（収率92.0％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85であつた。最終生成物のRf
値は出発物質の混合物のRf値より高い。クロマ
トグラフイーの結果、出発物質が含まれていない
ことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液を用いて、60
℃で１時間処理すると、エステル結合が開裂し、
もとのガングリオシド混合物が得られる。 ガングリオシド混合物の分子内エステルのIR
スペクトルをKBr法で測定したところ、1750cm-1
に典型的なエステル吸収が観察された。 実施例 ５ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex50wx8（100〜200メツシユのピリジニ
ウム型）10ｇを充填したカラムに通す。この生成
物の高減圧下で脱水し、無水テトラヒドロフラン
800mlとエトキシアセチレン2.1ｇ（30mM）に溶
解する。この混合物を３時間還流する（還流管を
−10℃に冷却し、脱水バルブを取り付ける）。 溶媒と過剰のエトキシアセチレンを除去した
後、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で
沈澱させる。収量7.2ｇ（収率91.0％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.70）は出発物質のRf値（0.65）より高いこと
がわかつた。クロマトグラフイーにより、出発物
質は含まれていないことがわかる。Na2CO3の
0.1N溶液で、60℃で１時間処理すると、エステ
ル結合が開裂し、もとのガングリオシドが得られ
る。 GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr
法で測定すると、1750cm-1に典型的なエステルの
吸収が観察される。 実施例 ６ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50wx8（100〜200メ
ツシユのピリジニウム型）20ｇを充填したカラム
に通す。この生成物を高減圧下で脱水し、無水ピ
リジン200mlに溶解し、これを、無水ピリジン200
mlにツビツターイオン・ウツドワード試薬（Ｎ−
エチル−５−フエニルイソオキサゾリウム−3′−
スルホネート、Woodward etal.，J.Am.chem.
Soc.831010−1012，1961）5.52ｇ（10mM）を入
れた懸濁液に加える。この反応混合物を室温で10
日間撹拌する。 過剰の試薬を濾過し、溶媒を完全に除去した
後、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）90mlに溶解し、アセトン450ml中で沈澱させ
る。収量7.2ｇ（収率81.8％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85であつた。この目的生成物
のRfは出発物質のRf値よりも高い。クロマトグ
ラフイーの結果から、出発物質は含まれていない
ことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液で60℃で１時
間処理すると、エステル結合合が開裂し、もとの
ガングリオシド化合物が得られる。 ガングリオシド混合物の分子内エステルのIR
スペクトルをKBr法で測定したところ、1750cm-1
に典型的なエステル吸収が観察された。 実施例 ７ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex50wx8（100〜200メツシユのピリジニ
ウム型）10ｇを充填したカラムに通す。この生成
物を高減圧下で脱水し、無水ピリジン200mlに溶
解し、これを、無水ピリジン200mlにツビツター
イオン・ウツドワード試薬1.26ｇ（5mM）を入
れた懸濁液に加える。この反応混合物を室温で10
日間撹拌する。 過剰の試薬を濾過し、溶媒を完全に除去してか
ら残留物をクロロホルム／メタノール（１：１）
混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で沈澱を
析出させる。収量6.3ｇ（収率：79.5％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.70）は出発物質Rf値（0.65）より高いことが
わかつた。このクロマトグラフイーにより、出発
物質は含まれていないことがわかる。Na2CO3の
0.1N溶液で、60℃で１時間処理すると、エステ
ル結合が開裂し、もとのガングリオシドが得られ
る。 GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr
法で測定したところ、1750cm-1に典型的なエステ
ル吸収が観察された。 薬理学的性質 ガングリオシドの分子内エステル誘導体および
その製造方法は先行文献に記載されているが、こ
の分子内エステル誘導体の生物学的活性または医
薬としての利用可能性については何ら記載されて
いない。本発明者らは、ガングリオシドの分子内
エステル誘導体は神経系の疾病を治癒する極めて
高い活性を有し、その活性はガングリオシド自体
よりもずつと高いことを見い出した。即ち、ガン
グリオシドの分子内エステル誘導体は、病気また
は事故に起因する末梢系および中枢神経系の疾病
を含包する種々の神経障害の治療に使用すること
ができる。この化合物はまた、神経に影響を与え
る手術、例えば痔核手術の後の術後療法に使用す
ることができる。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体の優れた薬理学的性質を、以下に列挙する試
験法により、ガングリオシドと比較、評価するこ
とができる：1.好クローム性セルライン（PC12）
における軸索成長、2.ノイロン膜（Na+K+）
ATPアーゼ活性、3.眩輝（dazzling）後のエレク
トロレチノグラムの回復。 １ PC12の軸索成長に及ぼすガングリオシド分
子内エステル誘導体の影響 実験材料および方法 軸索の成長は局在化したノ
イロンの分化と考えられており、ガングリオシド
分子が上記効果を発揮する生化学的機構はインビ
トロで細胞培養モデルを評価することにより研究
することができる（PC12はDr.P.Calissano（C.N.
R−Laboratorio di Biologia Cellulare−ロー
マ、イタリヤ国）から供給された1Aサブクロー
ンから誘導した）（“Gangliosides，in
Neurological and Neuromuscullar Function，
Development and Repair”，Ed.by M.M.
Rapport and A.Gorio，Raven Press，New
York，1981）。このモデルでは、ガングリオシド
またはガングリオシド分子内エステル誘導体を神
経成長因子（NGF）、軸索成長を刺激するための
PC12分化の特異的誘導物質と共にPC12培養培地
に添加する。次いでガングリオシドによつて刺激
される軸索成長をガングリオシド分子内エステル
誘導体によつて刺激されるそれと比較することが
できる。 具体的には、セル（100000／プレート）をヘラ
ウス（Heraeus）インキユベータ（５％CO2、95
％の水分を含んだ空気）中、37℃に保持し、コラ
ーゲン被覆組織培養、60mmのインテグリド・フア
ルコン・プレート（Integrid Falcon Pltes）に
置いた（以下の培養培地の存在下：85％
RPM1640（Gibco）、10％加熱不活性化馬血清
（Gibco）、５％牛胎児血清（Gibco）、50U／mlペ
ニシリンおよび25mg／mlストレプトマイシン）。
培地は48時間毎に交換した。 この様な条件下では、細胞は分裂するが軸索を
形成しない。NGF（50nｇ／ml）を添加すると細
胞は増殖をやめ、５〜10日以内に軸索を形成し、
分化する。この効果を、５日目およびその後１日
おきに軸索を有する細胞の数を数えることにより
評価した。 ガングリオシドおよびその誘導体（1mM）を
NGFと同時に培養培地に添加し、７日目および
９日目に軸索を有する細胞の数を数えることによ
りその効果を評価した。 結果 軸索成長についての比較実験の結果を表１
に示す。 【表】 以上の結果、本発明に係るガングリオシドの分
子内エステルはノイロン成長刺激作用を有し、こ
の作用は７日目においても９日目においてもガン
グリオシドよりも強いことがわかつた。 ２ ノイロン膜（Na+，K+）ATPアーゼ活性に
及ぼすガングリオシド誘導体の影響 ガングリオシドまたはガングリオシド分子内エ
ステルの膜酵素（Na+，K+）ATPアーゼ活性化
能を、インビトロのノイロン膜標本で評価するこ
とができる（J.of Neurochem.前記）。 実験材料および方法 ａ ラツト脳の粗ミトコンドリアフラクシヨン
（P2フラクシヨン）の調製 P2フラクシヨンの調製はMorganらの方法に従
つて行つた（Biochem.Biophys.Acta241737，
1971）（全ての操作は０〜４℃で行つた。Xg値は
平均遠心力を示す）。チヤールスリバー系のスプ
ラギユードウレイ（Sprague Dawley）雄ラツト
（体重150〜175ｇ）を断頭し、脳を素早く摘出し
て氷冷等張液で洗浄した。小脳を切除した後、脳
を４倍容量のホモジナイズ溶液（0.32Mシユクロ
ース含有1mM燐酸カリウム緩衝液および0.1nM
EDTA二ナトリウム、PH7.27）を用い、12上下ス
トロークのモータ駆動テフロン−ガラスホモジナ
イザー（表示半径すきま、0.25mm；800r.p.m）で
ホモジナイズし。ホモジネートをホモジナイズ用
溶液で10％に希釈し、あらい綿布４枚で濾過し、
1000×ｇで15分間遠心分離した。 得られたペレツトを同じ量のホモジナイズ用溶
液で洗浄し、上記と同じ様に遠心分離した。上澄
液を合わせて17500×ｇで25分間遠心分離し（こ
の重力条件は、フラクシヨンが最も多量の神経終
末を含有する様にするために選択した）、ペレツ
トを９倍容量のホモジナイズ溶液で４回洗浄し、
その都度17500×ｇで25分間遠心分離した。「P2
フラクシヨン」と呼ぶ最後のペレツトは、主成分
として、破壊されていないミトコンドリアと神経
終末を含んでいる。この最後のペレツトを、適量
のホモジナイズ用溶液に、前記のテフロン−ガラ
スホモジナイザーを用いて均一に再懸濁し、直ち
に分析に使用した。貯蔵による不都合を避けるた
めに、常に使用直前に新鮮なP2フラクシヨンを
調製した。このP2フラクシヨン標本はNeuAc／
mg蛋白質に結合した33.9±2.8（S.D.）のガングリ
オシド含量を有していた。 ｂ ATPアーゼ検定 ATPアーゼ活性はWallickらの方法（J.
Pharm.Exptl.Therap.189434，1974）に従い、分
光光度法によつて測定した。特に記載しない限
り、反応混合物は50mMシユクロース、0.2mM
EDTA二ナトリウム（PH7.4に調節）、100mM
NaCl、5mM MgCl2、10mM KCl、2mMホスホ
（エノール）ピルベート・モノカリウム塩
（PEP）（PH7.4に調節）、3mM ATP、50mMトリ
ス塩酸PH7.4、0.33mM NADH、ピルベート−キ
ナーゼ（PK）（30μｇ／ml）およびラクテート−
デヒドロゲナーゼ（LDH）（10μｇ／ml）からな
り、最終容量は３ml、最終PHは7.2であつた。P2
フラクシヨン50〜75μｇ（蛋白質として）を添加
することにより反応を開始した。（Na+，K+）
ATPアーゼ活性は、全ATPアーゼと３×10-5ウ
ーアバインの存在下で測定したMg2+依存性ATP
アーゼとの差から求めた。個々の検定に要する時
間は３〜５分であつた。 ATPアーゼ活性は国際単位（IU）（加水分解
されたATPのμモル／蛋白質ｍｇ／分）で表わ
した。 ガングリオシド誘導体の活性（50nM）はノイ
ロン膜と37℃で２時間インキユベートした後測定
した。 結果 ATPアーゼ活性に関する比較実験の結果
を表２に示す。 【表】 以上の実験の結果、本発明に係るガングリオシ
ド分子内エステル誘導体はノイロン膜酵素
（Na+，K+）ATPアーゼ活性化能を有し、その
活性は同じモル濃度条件下のガングリオシドより
ずつと高いことがわかつた。 ３ 眩輝によつて損傷を受けたエレクトロレチノ
グラムの回復に及ぼすガングリオシド誘導体の
影響 ガングリオシドまたはガングリオシド分子内エ
ステル誘導体の、網膜電気活性回復促進能は、家
兎に物理的損傷（眩輝）を与える方法で評価する
ことができる。このモデルに於いては、ガングリ
オシドまたはガングリオシド分子内エステル誘導
体を非経口的に（静脈内に）投与する（“Int.
Symposium on the Neurochemistry of the
Retina”，Athens，August 28−September １，
1979，（Communication））（“Satellite Meeting
on Biochemical and Pharmacological
Implications of Gangliosides Functions”，
Cortona，August 28−31，1975，
（Communications））。 実験材料および方法 体重1.9〜２Kgのニユージ
ーランド産雄家兎を使用した（“Int.Symp on
the Neurochemistry of the Retina，Athens，
August 28−September １，1979）。 0.4％ノベシン（novesine）を局所投与して角
膜麻酔を行つた。弱い吸盤を備えた各膜電極
（Henkesによる）を付けてエレクトロレチノグラ
ム（網膜電位図）を記録した。対照電極は前頭域
に皮下挿入した針であつた。以下の装置を使用し
た：AC前増幅器5A22N Tektronics（10HzDCフ
イルター）：Neuroaverager 1172 OTE
Biomedica分析器：XY plotter 1800 Linseis記
録針：1273 OTE Biomedica光刺激装置。 光刺激は、周波数0.5ヘルツ、10秒間の0.2ワツ
ト／秒の５回の閃光で行つた。記録のベースタイ
ムは100msecであつた（pre−set＝５）。 動物を暗所に30分間入れ、一定の空気、温度お
よび音の条件下で暗さに順応させ、以下の測定を
行つた。 １ 全ての動物について15分毎に、３回ベースコ
ントロールを測定した。波ａ＋ｂ（ピークから
ピークの）平均を計算した。 ２ 次いで角膜電極から１cmの距離に置いた
Schott Mainz KL150Bランプを使つて、20分
間動物を眩輝（めくらまし）した。 この後、眩輝後20、40および60分後のエレク
トロレチノグラム（ERG）の強さを測定する
ことにより、ERG回復を調べた。これによつ
て、あるべき動物の基礎状態を査定することが
できた。 次いで動物を被験化合物で処理し、30分後に
再び眩輝に付し、前記と同じ条件下でERGを
記録した。被験化合物は33ナノモル／Kgの割合
で静脈内注射した。 結果 エレクトロレチノグラム回復に関する比較
実験の結果を以下の表３に示す。 【表】 ＊ 使用動物：家兎
投与量：33nmole／Kg(静脈注射)
以上の結果から、本発明に係る分子内エステル
誘導体はエレクトロレチノグラムに於ける回復を
促進すること、およびその活性は全実験期間中を
通じてガングリオシドより強いことがわかつた。
より詳しくは、本発明に係る分子内エステルガン
グリオシド誘導体は、外傷性、圧迫性、退化性ま
た毒性感染性の障害であつて、神経再生刺激およ
び神経筋肉機能の回復が必要である末梢神経系の
障害、および外傷性、酸素欠乏性、退化性または
毒素感染性の障害であつて、機能回復のためにノ
イロン成長の刺激が必要である中枢神経系の障害
の治療に使用することができる。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体は神経系、特に末梢神経障害および中枢神経
系の疾病を治すための種々の治療に医薬として使
用することができる。これらの障害には、以前は
ガングリオシドが使われて来たが、上記の実験の
結果、ガングリオシドの分子内エステル誘導体が
ガングリオシド自体よりもずつと活性の強いこと
がわかつた。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内注射または
インフユージヨン用医薬製剤の形にして、ヒトお
よび動物に投与することができる。この製剤は、
本発明の化合物の溶液であつてもよく、本発明化
合物の凍結乾燥粉末であつてもよく、そしてま
た、それらは薬学的に許容し得る担体や希釈剤を
含んでいてもよく、さらに生体液と等張であつ
て、同じPHの緩衝液の形に調節されていてもよ
い。投与量は所望の薬効および所望の投与ルート
によつて変わる。投与量は、例えば、１日当たり
体重１Kg当たり活性化合物0.05〜５mgとし、単位
投与量を体重１Kg当たり0.05〜２mg／Kgとするこ
とができるが、勿論これに限定されるものではな
い。 本発明に係る医薬製剤は、通常種々のガングリ
オシド分子内エステル誘導体の混合物を使つて製
造されるが、単一の活性成分だけを含むものであ
つてもよい。 以下に、神経系の障害の治療用として溶液の形
に製剤化される医薬製剤の例を挙げる。 製剤例１ ２mlのアンプル 活性成分５mgおよび塩化ナトリウム16mgにパイ
ロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩緩
衝液（PH６）を加えて２mlとする。 製剤例２ ２mlのアンプル 活性成分50mgおよび塩化ナトリウム16mgにパイ
ロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩緩
衝液（PH６）を加えて２mlとする。 製剤例３ ４mlのバイアル 活性成分100mgおよび塩化ナトリウム32mgにパ
イロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩
緩衝液（PH６）を加えて４mlとする。 以上の製剤は、前記ルートのいずれかで、ヒト
及び動物に直接投与することができる。更に、こ
の製剤は活性物質を約２％から約50％含ませるこ
とができる。 神経系の障害の治療に使用できるその他の医薬
組成物の例を更に以下に示す。以下の製剤は２本
のバイアルからなつている。活性成分を含んでい
る１番目のバイアルには、薬学的に許容し得る賦
形剤、例えばグリシンおよびマンニツトと共に、
約10〜約90重量％の活性成分の凍結乾燥粉末が入
つている。２番目の溶媒用バイアルには、所望量
の溶媒、例えば塩化ナトリウムおよびクエン酸塩
緩衝液を入れる。投与直前に２本のバイアルの内
容物を混合し、凍結乾燥活性物質粉末を素早く溶
解して注射溶液とする。ガングリオシド分子内エ
ステル誘導体は溶液状態より凍結乾燥状態の方が
安定であるので、この様な剤型は前記したものよ
り、より好ましいものである。 製剤例 ４ ａ 活性物質５mgおよびグリシン30mgの凍結乾燥
物を入れた２mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム16mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて２
mlとした液を入れた２mlアンプル。 製剤例 ５ ａ 活性物質５mgおよびマンニツト40mgの凍結乾
燥物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム16mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて２
mlとした液を入れた２mlアンプル。 製剤例 ６ ａ 活性物質50mgおよびグリシン25mgの凍結乾燥
物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム24mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて３
mlとした液を入れた３mlアンプル。 製剤例 ７ ａ 活性物質50mgおよびマンニツト20mgの凍結乾
燥物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム24mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて３
mlとした液を入れた３mlアンプル。 製剤例 ８ ａ 活性物質100mgおよびグリシン50mgの凍結乾
燥物を入れた５mlバイアル。 ｂ 塩化ナトリウム32mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液（PH６）を
加えて４mlとした液を入れた４mlアンプル。 製剤例 ９ ａ 活性物質100mgおよびマンニツト40mgの凍結
乾燥物を入れた50mlバイアル。 ｂ 塩化ナトリウム32mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液（PH６）を
加えて４mlとした液を入れた４mlアンプル。
体の製造方法に関する。ガングリオシドの分子内
エステル誘導体は、神経系に何らかの損傷を与え
る疾患や事故に起因する神経系統の疾病を治療す
るのに使用される。 ガングリオシドはグリコスフインゴリピドの一
員であつて、シアリン酸部分およびセラミドに結
合している炭水化物部分を有する構造を持つてい
る。この炭水化物部分は、少なくとも１個のガラ
クトースまたはグルコース部分および少なくとも
１個のＮ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセ
チルガラクトサミン部分を含んでいる。従つて、
ガングリオシドの一般的な構造は次の一般式で表
すことができる： １分子のシアリン酸｛−１モルのセラミド−少
なくとも１モルのガラクストースまたはグルコー
ス−少なくとも１モルのＮ−アセチルグルコサミ
ンまたはＮ−アセチルガラクトサミン｝ ここで、全ての部分はグリコシド結合によつて
結合している。 多数のガングリオシドが確認されており、それ
らは特に神経組織、とりわけ脳組織に豊富にある
ことが知られている。種々の研究の結果、ガング
リオシド中の最も重要なシアリン酸はＮ−アセチ
ルノイラミン酸（NANA）であり、Ｎ−グリコ
リルノイラミン酸はさほど重要でないことがわか
つた。確認されている多数のガングリオシドの
内、国際的な記号で標織された以下のガングリオ
シドが、牛の脳組織から抽出されたガングリオシ
ド混合物中に多量存在することがわかつた： 【表】 〓２〓 〓２〓
NANA NANA
ここでGlcはグルコース、GalNACはＮ−アセ
チルガラクトサミン、Galはガラクトース、Cer
はセラミ、ド、NANAはＮ−アセチル−ノイラ
ミン酸を表し、（ ）の中の％は牛の脳組織から
抽出されたガングリオシド混合物中の各ガングリ
オシドの含有量を表す。 ガングリオシド神経系で重要な役割を果たして
いることはよく知られており、また最近、ガング
リオシドが中枢神経系の病変および末梢神経系の
疾病の治療に有用であることが報告された
（Actapsychiat.Scand.，55102，1977；Eur.Med.
phys.，13１，1977；Ric.Sci.Educ.Perm.９115，
1978；Adv.Exp.Biol.71275，1976；
Electromyogr.Clin，Neurophysiol.，19353，
1979；Minerva Medica，693277，1978；
Minerva Stomat.，27177，1978；Med，del
Lavoro，68（1977）；Brain Res.197236，1980。） ガングリオシドの治癒作用は、主として神経組
織における成長現象を刺激すること、および神経
刺激伝達に関連する膜酵素、例えば酵素（Na+，
K+）ATPアーゼを活性化することにあると考え
られている（Brain Res.，197，236，1980；
Leonら、J.of Neurochem.，37350，1981）。 ガングリオシドで刺激された神経成長は、損傷
を受けた神経組織の治癒および再生を促進するこ
とになろう。 神経系の疾病を治癒するに当たり、ガングリオ
シドより効果の大きい化合物を見い出そうとする
研究がなされて来た。 本発明者らは、ガングリオシドのある種の誘導
体が、神経成長刺激において、および神経刺激伝
達に関係している膜酵素、例えば酵素（Na+，
K+）ATPアーゼを活性化する点に於て、ガング
リオシドより活性が強いことを見い出した。具体
的には、ガングリオシドの分子内エステル誘導体
が神経系の疾病を治療するのに特に有効であり、
もとのガングリオシドより活性が強いことを見い
出した。インビボおよびインビトロ実験の結果、
神経成長刺激において、そしてまた、神経伝達に
関与している（Na+，K+）ATPアーゼ膜酵素を
活性化する点において、この分子内エステル誘導
体はもとのガングリオシドよりも優れていること
がわかつた。 これまでに、ガングリオシドの分子内エステル
誘導体と思われる極く僅かな物質が、極く少量、
脳組織から分離されている。ガングリオシドの分
子内エステルは、シアリン酸のカルボキシル基
と、炭水化物部分の１つの炭水化物または同じガ
ングリオシド分子内のもう１つの隣接するシアリ
ン酸の水酸基との反応によつて形成される（J.oF
Neurochemistry，34，1351，1980，Bull.of
Molecular Biology and Medicine，３，170，
1978）。ガングリオシドの分子内エステル誘導体
の構造は、例えば次の様に表わすことが出来る
が、これは勿論１つの例示に過ぎない。 上記式〔〕において、シアリン酸部分のＲは
ＨまたはOH、セラミド基中のR1はオレイン酸、
ステアリン酸またはリノール酸の様な脂肪酸を表
わす。 式〔〕のガングリオシド分子内エステル誘導
体は、シアリン酸のカルボキシル基が炭水化物部
分の１つ、具体的にはガラクトースの水酸基とエ
ステル結合しているものである。この分子内エス
テル結合が形成すると、シアリン酸と炭水化物部
分との間の通常のグリコシド結合と一緒になつ
て、通常５または６員環のラクトン環が形成され
る。これがガングリオシドの分子内エステル誘導
体の構造の特徴である。式〔〕は例示的に示し
たものであり、シアリン酸のカルボキシル基が炭
水化物部分の１つの水酸基とエステル結合するこ
とによつて５員環またはそれより大きいその他の
ラクトン環が形成し得ることに注意すべきであ
る。 既述した様に、シアリン酸のカルボキシル基
が、もとのガングリオシドにおいてはそのシアリ
ン酸がグリコシド結合によつて結合している隣接
するシアリン酸とエステル結合した場合にも、ガ
ングリオシドの分子内エステル誘導体が形成され
る。この場合の構造は下式で表わすことができ
る： ここでR2はシアリン酸部分にグリコシド結合
している炭水化物部分を表わす。 もう１つのガングリオシド分子内エステル誘導
体は下記〔〕で表わすことができる： ここでR3は隣接するシアリン酸がエステル結
合している炭水化物部分を表わす。従つて、式
〔〕は、シアリン酸がそれに隣接するシアリン
酸にエステル結合しており、そしてそれ自体は炭
水化物部分にエステル結合しているガングリオシ
ド分子内誘導体を表わしている。従つて、一般
に、炭水化物部分、少なくとも１個のセラミドお
よび少なくとも１個のシアリン酸部分から形成さ
れており、１個またはそれ以上のシアリン酸が炭
水化物部分にエステル結合しており、そして／ま
たは１個またはそれ以上のシアリン酸が隣接する
シアリン酸にエステル結合しているガングリオシ
ド分子内エステル誘導体であつて、上記した化合
物の種々の類縁体を形成させることができる。即
ち、ガングリオシドには多数の分子内エステル誘
導体が可能であつて、前記したものはその例示に
過ぎない。 ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造方
法としては、以下のものが知られている： １ ガングリオシドを酢酸またはトリクロロ酢酸
溶液中に入れて放置するだけで分子内エステル
を生成せしめるもの（Sphingolipids，
Sphingolipidoses and Allied Disorders，
Adv.Exp.Med.Biol.1995，1972；Neurochem.
281133，1977）。この方法によれは、ガングリ
オシドに対して非常に高い比率の酢酸を使用し
なければならず、また、ガングリオシドを完全
に変換することはできない。従つて、最終的に
精製工程が必要であり、これは通常イオン交換
樹脂、例えばセフアデツクスを用いて行われ
る。 ２ 水性媒質中での水溶性カルボジイミドとガン
グリオシドとの反応（Carbohydr.Res.41 344，
1975）。この方法は、反応が水性媒質中で行わ
れるので、ガングリオシドを完全に変換するこ
とはできない。この方法は収率が非常に悪く、
最終的に分子内エステル生成物を精製しなけれ
ばならない。 本発明は、高収率でガングリオシド分子内エス
テル誘導体を製造するための新規な方法、特に完
全にラクトン化されたガングリオシド分子内エス
テル誘導体の製造方法を提供するものである。即
ちその方法は、ガングリオシドまたはその塩を非
水性有機溶媒中、ラクトン化試薬と無水条件下で
反応させることからなる。さらに詳しくは、哺乳
動物から得たガングリオシドまたはガングリオシ
ド混合物をイオン交換樹脂で処理して該ガングリ
オシドのカルボキシレート基をカルボキシル基ま
たはその塩（３級窒素塩）に変換し、得られたガ
ングリオシドまたはガングリオシド混合物を、非
水性有機溶媒中、無水条件下、ラクトン化試薬と
反応させ、次いでガングリオシド分子内エステル
誘導体をアセトンで沈澱せしめることからなる。
本発明で使用される適当な有機溶媒はジメチルス
ルホキシド（DMSO）、ジメチルホルムアミド
（DMF）、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタ
ン、ピリジンおよびスルホラン並びにそれらの混
合物などである。好適なラクトン化試薬として
は、有機溶媒に可溶のカルボジイミド類、例えば
ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンジルイソ
プロピルカルボジイミド、およびベンジルエチル
カルボジイミド、２−クロロ−１−メチル−ピリ
ジニウム塩類、エトキシアセチレンおよびウツド
ワード試薬（Ｎ−エチル−５−フエニルイソオキ
サゾリウム−3′−スルホネート）などが含まれ
る。ガングリオシドを水性媒質中でカルボジイミ
ドと反応させる先行技術の方法では、分子内エス
テル誘導体の収率は非常に低いが、非水性媒質中
でガングリオシドを反応させる本発明方法では、
所望の分子内エステル誘導体の収率は先行技術に
おける可能な収率よりも高く、実質的に定量的で
あることがわかつた。本発明方法に於いて使用さ
れる出発物質としてのガングリオシドは、哺乳動
物、最も好ましくは牛の脳組織から抽出される。
以下の実施例は、本発明方法によるガングリオシ
ドの分子内エステル誘導体の製造法を例示するも
のである。 実施例 １ 牛の脳からガングリオシド混合物を抽出し、そ
の５ｇをDMSO50mlに溶解する。次いで無水の
スチレン型樹脂（スルホン酸）（50〜100メツシ
ユ、H+型）４ｇをこの混合物に加え、全体を室
温で30分間撹拌する。イオン交換樹脂によるこの
処理でガングリオシドの全てのカルボキシレート
はカルボキシル基（−COOH）に変換される。
適当な物理的分析、例えば原子吸光分析により全
てのカルボキシレート基が変換されたかどうかを
確認する。次いで樹脂を吸引濾過し、溶液をジシ
クロヘキシルカルボジイミド1.5ｇで処理し、１
時間放置する。沈澱したジシクロヘキシルウレア
を濾過して除き、残つた溶液をアセトン100mlで
処理するとガングリオシドの分子内エステル誘導
体が沈澱する。収量4.6ｇ（理論値の約90〜95
％）。 分子内エステル誘導体は赤外吸収スペクトルお
よび薄層クロマトグラフイーで確認する。 IR（KBr法） このエステル−ラクトン結合は
1750cm-1に吸収を示す。 薄層クロマトグラフイー シリカゲルプレートを
用い、CHCl3／MeOH／0.3％CaCl2（容量比：
55／45／10）で展開した時の分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85の範囲にある。この目的生
成物のRf値は、出発物質混合物のRf値より高い。
このクロマトグラフイーの結果、出発物質が存在
しないことがわかる。0.1N Na2CO3溶液を用い
て60℃で１時間処理するとエステル結合が開裂
し、出発物質として用いたガングリオシドの混合
物が得られる。 実施例 ２ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50w×８（100〜200
メツシユのトリエチルアンモニウム型）20ｇを充
填したカラムを通す（この処理でガングリオシド
の全てのカルボキシレート基はトリエチルアンモ
ニウム塩に変換される）。高減圧下で脱水したこ
の生成物を、超音波処理浴を使つて、トリエチル
アミン８mlを含む無水テトラヒドロフラン200ml
に溶かす。この溶液を、40mMの２−クロロ−１
−メチル−ピリジニウム塩（アニオンは、例えば
沃素、トルエン−４−スルホネート、トリフルオ
ロメタンスルホネートなどであつてよい）を含有
している無水テトラヒドロフラン600mlに、絶え
ず撹拌し、45℃の一定の温度に保ちながら、４時
間で徐々に添加する。この反応を45℃で18時間行
う。 過剰の試薬を濾過し、混合物を窒素気流下で濃
縮し、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物90mlに再溶解し、アセトン450ml中
で沈澱させる。最後に生成物を高減圧下で乾燥す
る。収量7.9ｇ（89.7％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85の範囲にあつた。この目的
生成物のRf値は、出発化合物混合物のRf値より
も高い。クロマトグラフイーにより、出発物質の
存在しないことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液に
より、60℃で１時間処理するとエステル結合が開
裂して、もとのガングリオシド化合物が得られ
る。 ガングリオシド混合物の分子内エステルまたは
内部エステルの1RスペクトルをKBr法で測定し
たところ、1750cm-1に典型的なエステル吸収を示
した。 実施例 ３ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex 50wx ８（100〜200メツシユのトリ
エチルアンモニウム型）10ｇを充填したカラムに
通す。高減圧下で脱水したこの生成物を、超音波
処理浴を用いて、トリエチルアミン４mlを含有し
ている無水テトラヒドロフラン200mlに溶解する。 この溶液を、20mMの２−クロロ−１−メチル
−ピリジニウム塩（ここで、アニオンは、例えば
沃素、トルエン−４−スルホネート、トリフルオ
ロメタンスルホネートなどであつてよい）を含有
している無水テトラヒドロフラン600mlに、絶え
ず撹拌し、45℃の一定温度に保ちながら４時間で
徐々に添加する。この反応を45℃で18時間行う。 過剰の試薬を濾過し、混合物を窒素気流中で濃
縮し、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で
沈澱させる。最後に生成物を高減圧下で乾燥す
る。収量7.0ｇ（収率88.4％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.7）は出発物質のそれ（0.65）より高かつた。
このクロマトグラフイーの結果から、出発物質が
含まれていないことがわかる。Na2CO3の0.1N溶
液により60℃で１時間処理すると、エステル結合
が開裂し、もとのガングリオシドが得られる。
GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr法
により測定すると、1750cm-1に典型的なエステル
吸収が見られた。 実施例 ４ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50wx8（100〜200メ
ツシユのピリジニウム型）20ｇを充填したカラム
に通す（この処理でガングリオシドの全てのカル
ボキシレート基はピリジニウム塩に変換される）。
高減圧下で脱水したこの生成物を無水テトラヒド
ロフラン800mlとエトキシアセチレン4.2ｇ
（60mM）に溶解する。この混合物を３時間還流
する（還流器は−10℃に冷却し、脱水バルブを備
えつける）。溶媒および過剰のエトキシアセチレ
ンを除去した後、残留物をクロロホルム／メタノ
ール（１：１）の混合物80mlに溶解し、アセトン
400ml中で沈澱させる。収量8.1ｇ（収率92.0％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85であつた。最終生成物のRf
値は出発物質の混合物のRf値より高い。クロマ
トグラフイーの結果、出発物質が含まれていない
ことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液を用いて、60
℃で１時間処理すると、エステル結合が開裂し、
もとのガングリオシド混合物が得られる。 ガングリオシド混合物の分子内エステルのIR
スペクトルをKBr法で測定したところ、1750cm-1
に典型的なエステル吸収が観察された。 実施例 ５ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex50wx8（100〜200メツシユのピリジニ
ウム型）10ｇを充填したカラムに通す。この生成
物の高減圧下で脱水し、無水テトラヒドロフラン
800mlとエトキシアセチレン2.1ｇ（30mM）に溶
解する。この混合物を３時間還流する（還流管を
−10℃に冷却し、脱水バルブを取り付ける）。 溶媒と過剰のエトキシアセチレンを除去した
後、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）の混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で
沈澱させる。収量7.2ｇ（収率91.0％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.70）は出発物質のRf値（0.65）より高いこと
がわかつた。クロマトグラフイーにより、出発物
質は含まれていないことがわかる。Na2CO3の
0.1N溶液で、60℃で１時間処理すると、エステ
ル結合が開裂し、もとのガングリオシドが得られ
る。 GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr
法で測定すると、1750cm-1に典型的なエステルの
吸収が観察される。 実施例 ６ ガングリオシド混合物（ナトリウム塩）９ｇを
蒸留水80mlに溶解し、Dowex50wx8（100〜200メ
ツシユのピリジニウム型）20ｇを充填したカラム
に通す。この生成物を高減圧下で脱水し、無水ピ
リジン200mlに溶解し、これを、無水ピリジン200
mlにツビツターイオン・ウツドワード試薬（Ｎ−
エチル−５−フエニルイソオキサゾリウム−3′−
スルホネート、Woodward etal.，J.Am.chem.
Soc.831010−1012，1961）5.52ｇ（10mM）を入
れた懸濁液に加える。この反応混合物を室温で10
日間撹拌する。 過剰の試薬を濾過し、溶媒を完全に除去した
後、残留物をクロロホルム／メタノール（１：
１）90mlに溶解し、アセトン450ml中で沈澱させ
る。収量7.2ｇ（収率81.8％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、分子内エステル混合
物のRf値は0.7〜0.85であつた。この目的生成物
のRfは出発物質のRf値よりも高い。クロマトグ
ラフイーの結果から、出発物質は含まれていない
ことがわかる。Na2CO3の0.1N溶液で60℃で１時
間処理すると、エステル結合合が開裂し、もとの
ガングリオシド化合物が得られる。 ガングリオシド混合物の分子内エステルのIR
スペクトルをKBr法で測定したところ、1750cm-1
に典型的なエステル吸収が観察された。 実施例 ７ GM1（ナトリウム塩）８ｇを蒸留水80mlに溶解
し、Dowex50wx8（100〜200メツシユのピリジニ
ウム型）10ｇを充填したカラムに通す。この生成
物を高減圧下で脱水し、無水ピリジン200mlに溶
解し、これを、無水ピリジン200mlにツビツター
イオン・ウツドワード試薬1.26ｇ（5mM）を入
れた懸濁液に加える。この反応混合物を室温で10
日間撹拌する。 過剰の試薬を濾過し、溶媒を完全に除去してか
ら残留物をクロロホルム／メタノール（１：１）
混合物80mlに溶解し、アセトン400ml中で沈澱を
析出させる。収量6.3ｇ（収率：79.5％） シリカゲル薄層クロマトグラフイー（溶媒＝ク
ロロホルム／メタノール／CaCl2（0.3％）（55：
45：10）の混合物）の結果、目的生成物のRf値
（0.70）は出発物質Rf値（0.65）より高いことが
わかつた。このクロマトグラフイーにより、出発
物質は含まれていないことがわかる。Na2CO3の
0.1N溶液で、60℃で１時間処理すると、エステ
ル結合が開裂し、もとのガングリオシドが得られ
る。 GM1の分子内エステルのIRスペクトルをKBr
法で測定したところ、1750cm-1に典型的なエステ
ル吸収が観察された。 薬理学的性質 ガングリオシドの分子内エステル誘導体および
その製造方法は先行文献に記載されているが、こ
の分子内エステル誘導体の生物学的活性または医
薬としての利用可能性については何ら記載されて
いない。本発明者らは、ガングリオシドの分子内
エステル誘導体は神経系の疾病を治癒する極めて
高い活性を有し、その活性はガングリオシド自体
よりもずつと高いことを見い出した。即ち、ガン
グリオシドの分子内エステル誘導体は、病気また
は事故に起因する末梢系および中枢神経系の疾病
を含包する種々の神経障害の治療に使用すること
ができる。この化合物はまた、神経に影響を与え
る手術、例えば痔核手術の後の術後療法に使用す
ることができる。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体の優れた薬理学的性質を、以下に列挙する試
験法により、ガングリオシドと比較、評価するこ
とができる：1.好クローム性セルライン（PC12）
における軸索成長、2.ノイロン膜（Na+K+）
ATPアーゼ活性、3.眩輝（dazzling）後のエレク
トロレチノグラムの回復。 １ PC12の軸索成長に及ぼすガングリオシド分
子内エステル誘導体の影響 実験材料および方法 軸索の成長は局在化したノ
イロンの分化と考えられており、ガングリオシド
分子が上記効果を発揮する生化学的機構はインビ
トロで細胞培養モデルを評価することにより研究
することができる（PC12はDr.P.Calissano（C.N.
R−Laboratorio di Biologia Cellulare−ロー
マ、イタリヤ国）から供給された1Aサブクロー
ンから誘導した）（“Gangliosides，in
Neurological and Neuromuscullar Function，
Development and Repair”，Ed.by M.M.
Rapport and A.Gorio，Raven Press，New
York，1981）。このモデルでは、ガングリオシド
またはガングリオシド分子内エステル誘導体を神
経成長因子（NGF）、軸索成長を刺激するための
PC12分化の特異的誘導物質と共にPC12培養培地
に添加する。次いでガングリオシドによつて刺激
される軸索成長をガングリオシド分子内エステル
誘導体によつて刺激されるそれと比較することが
できる。 具体的には、セル（100000／プレート）をヘラ
ウス（Heraeus）インキユベータ（５％CO2、95
％の水分を含んだ空気）中、37℃に保持し、コラ
ーゲン被覆組織培養、60mmのインテグリド・フア
ルコン・プレート（Integrid Falcon Pltes）に
置いた（以下の培養培地の存在下：85％
RPM1640（Gibco）、10％加熱不活性化馬血清
（Gibco）、５％牛胎児血清（Gibco）、50U／mlペ
ニシリンおよび25mg／mlストレプトマイシン）。
培地は48時間毎に交換した。 この様な条件下では、細胞は分裂するが軸索を
形成しない。NGF（50nｇ／ml）を添加すると細
胞は増殖をやめ、５〜10日以内に軸索を形成し、
分化する。この効果を、５日目およびその後１日
おきに軸索を有する細胞の数を数えることにより
評価した。 ガングリオシドおよびその誘導体（1mM）を
NGFと同時に培養培地に添加し、７日目および
９日目に軸索を有する細胞の数を数えることによ
りその効果を評価した。 結果 軸索成長についての比較実験の結果を表１
に示す。 【表】 以上の結果、本発明に係るガングリオシドの分
子内エステルはノイロン成長刺激作用を有し、こ
の作用は７日目においても９日目においてもガン
グリオシドよりも強いことがわかつた。 ２ ノイロン膜（Na+，K+）ATPアーゼ活性に
及ぼすガングリオシド誘導体の影響 ガングリオシドまたはガングリオシド分子内エ
ステルの膜酵素（Na+，K+）ATPアーゼ活性化
能を、インビトロのノイロン膜標本で評価するこ
とができる（J.of Neurochem.前記）。 実験材料および方法 ａ ラツト脳の粗ミトコンドリアフラクシヨン
（P2フラクシヨン）の調製 P2フラクシヨンの調製はMorganらの方法に従
つて行つた（Biochem.Biophys.Acta241737，
1971）（全ての操作は０〜４℃で行つた。Xg値は
平均遠心力を示す）。チヤールスリバー系のスプ
ラギユードウレイ（Sprague Dawley）雄ラツト
（体重150〜175ｇ）を断頭し、脳を素早く摘出し
て氷冷等張液で洗浄した。小脳を切除した後、脳
を４倍容量のホモジナイズ溶液（0.32Mシユクロ
ース含有1mM燐酸カリウム緩衝液および0.1nM
EDTA二ナトリウム、PH7.27）を用い、12上下ス
トロークのモータ駆動テフロン−ガラスホモジナ
イザー（表示半径すきま、0.25mm；800r.p.m）で
ホモジナイズし。ホモジネートをホモジナイズ用
溶液で10％に希釈し、あらい綿布４枚で濾過し、
1000×ｇで15分間遠心分離した。 得られたペレツトを同じ量のホモジナイズ用溶
液で洗浄し、上記と同じ様に遠心分離した。上澄
液を合わせて17500×ｇで25分間遠心分離し（こ
の重力条件は、フラクシヨンが最も多量の神経終
末を含有する様にするために選択した）、ペレツ
トを９倍容量のホモジナイズ溶液で４回洗浄し、
その都度17500×ｇで25分間遠心分離した。「P2
フラクシヨン」と呼ぶ最後のペレツトは、主成分
として、破壊されていないミトコンドリアと神経
終末を含んでいる。この最後のペレツトを、適量
のホモジナイズ用溶液に、前記のテフロン−ガラ
スホモジナイザーを用いて均一に再懸濁し、直ち
に分析に使用した。貯蔵による不都合を避けるた
めに、常に使用直前に新鮮なP2フラクシヨンを
調製した。このP2フラクシヨン標本はNeuAc／
mg蛋白質に結合した33.9±2.8（S.D.）のガングリ
オシド含量を有していた。 ｂ ATPアーゼ検定 ATPアーゼ活性はWallickらの方法（J.
Pharm.Exptl.Therap.189434，1974）に従い、分
光光度法によつて測定した。特に記載しない限
り、反応混合物は50mMシユクロース、0.2mM
EDTA二ナトリウム（PH7.4に調節）、100mM
NaCl、5mM MgCl2、10mM KCl、2mMホスホ
（エノール）ピルベート・モノカリウム塩
（PEP）（PH7.4に調節）、3mM ATP、50mMトリ
ス塩酸PH7.4、0.33mM NADH、ピルベート−キ
ナーゼ（PK）（30μｇ／ml）およびラクテート−
デヒドロゲナーゼ（LDH）（10μｇ／ml）からな
り、最終容量は３ml、最終PHは7.2であつた。P2
フラクシヨン50〜75μｇ（蛋白質として）を添加
することにより反応を開始した。（Na+，K+）
ATPアーゼ活性は、全ATPアーゼと３×10-5ウ
ーアバインの存在下で測定したMg2+依存性ATP
アーゼとの差から求めた。個々の検定に要する時
間は３〜５分であつた。 ATPアーゼ活性は国際単位（IU）（加水分解
されたATPのμモル／蛋白質ｍｇ／分）で表わ
した。 ガングリオシド誘導体の活性（50nM）はノイ
ロン膜と37℃で２時間インキユベートした後測定
した。 結果 ATPアーゼ活性に関する比較実験の結果
を表２に示す。 【表】 以上の実験の結果、本発明に係るガングリオシ
ド分子内エステル誘導体はノイロン膜酵素
（Na+，K+）ATPアーゼ活性化能を有し、その
活性は同じモル濃度条件下のガングリオシドより
ずつと高いことがわかつた。 ３ 眩輝によつて損傷を受けたエレクトロレチノ
グラムの回復に及ぼすガングリオシド誘導体の
影響 ガングリオシドまたはガングリオシド分子内エ
ステル誘導体の、網膜電気活性回復促進能は、家
兎に物理的損傷（眩輝）を与える方法で評価する
ことができる。このモデルに於いては、ガングリ
オシドまたはガングリオシド分子内エステル誘導
体を非経口的に（静脈内に）投与する（“Int.
Symposium on the Neurochemistry of the
Retina”，Athens，August 28−September １，
1979，（Communication））（“Satellite Meeting
on Biochemical and Pharmacological
Implications of Gangliosides Functions”，
Cortona，August 28−31，1975，
（Communications））。 実験材料および方法 体重1.9〜２Kgのニユージ
ーランド産雄家兎を使用した（“Int.Symp on
the Neurochemistry of the Retina，Athens，
August 28−September １，1979）。 0.4％ノベシン（novesine）を局所投与して角
膜麻酔を行つた。弱い吸盤を備えた各膜電極
（Henkesによる）を付けてエレクトロレチノグラ
ム（網膜電位図）を記録した。対照電極は前頭域
に皮下挿入した針であつた。以下の装置を使用し
た：AC前増幅器5A22N Tektronics（10HzDCフ
イルター）：Neuroaverager 1172 OTE
Biomedica分析器：XY plotter 1800 Linseis記
録針：1273 OTE Biomedica光刺激装置。 光刺激は、周波数0.5ヘルツ、10秒間の0.2ワツ
ト／秒の５回の閃光で行つた。記録のベースタイ
ムは100msecであつた（pre−set＝５）。 動物を暗所に30分間入れ、一定の空気、温度お
よび音の条件下で暗さに順応させ、以下の測定を
行つた。 １ 全ての動物について15分毎に、３回ベースコ
ントロールを測定した。波ａ＋ｂ（ピークから
ピークの）平均を計算した。 ２ 次いで角膜電極から１cmの距離に置いた
Schott Mainz KL150Bランプを使つて、20分
間動物を眩輝（めくらまし）した。 この後、眩輝後20、40および60分後のエレク
トロレチノグラム（ERG）の強さを測定する
ことにより、ERG回復を調べた。これによつ
て、あるべき動物の基礎状態を査定することが
できた。 次いで動物を被験化合物で処理し、30分後に
再び眩輝に付し、前記と同じ条件下でERGを
記録した。被験化合物は33ナノモル／Kgの割合
で静脈内注射した。 結果 エレクトロレチノグラム回復に関する比較
実験の結果を以下の表３に示す。 【表】 ＊ 使用動物：家兎
投与量：33nmole／Kg(静脈注射)
以上の結果から、本発明に係る分子内エステル
誘導体はエレクトロレチノグラムに於ける回復を
促進すること、およびその活性は全実験期間中を
通じてガングリオシドより強いことがわかつた。
より詳しくは、本発明に係る分子内エステルガン
グリオシド誘導体は、外傷性、圧迫性、退化性ま
た毒性感染性の障害であつて、神経再生刺激およ
び神経筋肉機能の回復が必要である末梢神経系の
障害、および外傷性、酸素欠乏性、退化性または
毒素感染性の障害であつて、機能回復のためにノ
イロン成長の刺激が必要である中枢神経系の障害
の治療に使用することができる。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体は神経系、特に末梢神経障害および中枢神経
系の疾病を治すための種々の治療に医薬として使
用することができる。これらの障害には、以前は
ガングリオシドが使われて来たが、上記の実験の
結果、ガングリオシドの分子内エステル誘導体が
ガングリオシド自体よりもずつと活性の強いこと
がわかつた。 本発明に係るガングリオシド分子内エステル誘
導体は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内注射または
インフユージヨン用医薬製剤の形にして、ヒトお
よび動物に投与することができる。この製剤は、
本発明の化合物の溶液であつてもよく、本発明化
合物の凍結乾燥粉末であつてもよく、そしてま
た、それらは薬学的に許容し得る担体や希釈剤を
含んでいてもよく、さらに生体液と等張であつ
て、同じPHの緩衝液の形に調節されていてもよ
い。投与量は所望の薬効および所望の投与ルート
によつて変わる。投与量は、例えば、１日当たり
体重１Kg当たり活性化合物0.05〜５mgとし、単位
投与量を体重１Kg当たり0.05〜２mg／Kgとするこ
とができるが、勿論これに限定されるものではな
い。 本発明に係る医薬製剤は、通常種々のガングリ
オシド分子内エステル誘導体の混合物を使つて製
造されるが、単一の活性成分だけを含むものであ
つてもよい。 以下に、神経系の障害の治療用として溶液の形
に製剤化される医薬製剤の例を挙げる。 製剤例１ ２mlのアンプル 活性成分５mgおよび塩化ナトリウム16mgにパイ
ロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩緩
衝液（PH６）を加えて２mlとする。 製剤例２ ２mlのアンプル 活性成分50mgおよび塩化ナトリウム16mgにパイ
ロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩緩
衝液（PH６）を加えて２mlとする。 製剤例３ ４mlのバイアル 活性成分100mgおよび塩化ナトリウム32mgにパ
イロジエンを含まない蒸留水を使つたクエン酸塩
緩衝液（PH６）を加えて４mlとする。 以上の製剤は、前記ルートのいずれかで、ヒト
及び動物に直接投与することができる。更に、こ
の製剤は活性物質を約２％から約50％含ませるこ
とができる。 神経系の障害の治療に使用できるその他の医薬
組成物の例を更に以下に示す。以下の製剤は２本
のバイアルからなつている。活性成分を含んでい
る１番目のバイアルには、薬学的に許容し得る賦
形剤、例えばグリシンおよびマンニツトと共に、
約10〜約90重量％の活性成分の凍結乾燥粉末が入
つている。２番目の溶媒用バイアルには、所望量
の溶媒、例えば塩化ナトリウムおよびクエン酸塩
緩衝液を入れる。投与直前に２本のバイアルの内
容物を混合し、凍結乾燥活性物質粉末を素早く溶
解して注射溶液とする。ガングリオシド分子内エ
ステル誘導体は溶液状態より凍結乾燥状態の方が
安定であるので、この様な剤型は前記したものよ
り、より好ましいものである。 製剤例 ４ ａ 活性物質５mgおよびグリシン30mgの凍結乾燥
物を入れた２mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム16mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて２
mlとした液を入れた２mlアンプル。 製剤例 ５ ａ 活性物質５mgおよびマンニツト40mgの凍結乾
燥物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム16mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて２
mlとした液を入れた２mlアンプル。 製剤例 ６ ａ 活性物質50mgおよびグリシン25mgの凍結乾燥
物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム24mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて３
mlとした液を入れた３mlアンプル。 製剤例 ７ ａ 活性物質50mgおよびマンニツト20mgの凍結乾
燥物を入れた３mlアンプル。 ｂ 塩化ナトリウム24mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液を加えて３
mlとした液を入れた３mlアンプル。 製剤例 ８ ａ 活性物質100mgおよびグリシン50mgの凍結乾
燥物を入れた５mlバイアル。 ｂ 塩化ナトリウム32mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液（PH６）を
加えて４mlとした液を入れた４mlアンプル。 製剤例 ９ ａ 活性物質100mgおよびマンニツト40mgの凍結
乾燥物を入れた50mlバイアル。 ｂ 塩化ナトリウム32mgにパイロジエンを含まな
い蒸留水を使つたクエン酸塩緩衝液（PH６）を
加えて４mlとした液を入れた４mlアンプル。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ガングリオシド分子内エステル誘導体の製造
法であつて、非水性有機溶媒中において、ガング
リオシドあるいはガングリオシド混合物、または
該ガングリオシドあるいはガングリオシド混合物
の塩をラクトン化試薬と反応させてガングリオシ
ド分子内に少なくとも１個のラクトン結合を形成
させることを特徴とする製造法。 ２ (a)哺乳動物から得たガングリオシドまたはガ
ングリオシド混合物を非水性有機溶媒に溶解し、
(b)該ガングリオシドまたはガングリオシド混合物
にイオン交換樹脂を加えることによつて該ガング
リオシドのカルボキシレート基をカルボキシル基
に変換し、(c)得られたガングリオシドまたはガン
グリオシド混合物をラクトン化試薬と反応させて
ガングリオシド分子内に少なくとも１個のラクト
ン結合を形成させることからなる特許請求の範囲
第１項に記載の製造法。 ３ (a)ガングリオシドまたはガングリオシド混合
物をイオン交換にかけて該ガングリオシドのカル
ボキシレート基をその塩に変換し、(b)このように
して調製したガングリオシドまたはガングリオシ
ド混合物の塩を非水性有機溶媒に溶解し、(c)該ガ
ングリオシドまたはガングリオシド混合物の塩を
ラクトン化試薬と反応させてガングリオシド分子
内に少なくとも１個のラクトン結合を形成させる
ことからなる特許請求の範囲第１項に記載の製造
法。 ４ 塩がガングリオシドまたはガングリオシド混
合物の３級窒素塩である特許請求の範囲第３項に
記載の製造法。 ５ 塩がトリエチルアンモニウムまたはピリジニ
ウムとの３級窒素塩である特許請求の範囲第４項
に記載の製造法。 ６ 有機溶媒がジメチルスルホキシド、ジメチル
ホルムアミド、スルホラン、テトラヒドロフラ
ン、ジメトキシエタンおよびピリジンからなる群
から選ばれる特許請求の範囲第１項〜第５項のい
ずれかに記載の製造法。 ７ ラクトン化試薬が有機溶媒に可溶のカルボジ
イミド類、２−クロロ−１−メチル−ピリジニウ
ム塩類、エトキシアセチレンおよびＮ−エチル−
５−フエニルイソオキサゾリウム−3′−スルホネ
ートからなる群から選ばれる特許請求の範囲第１
項〜第６項のいずれかに記載の製造法。 ８ カルボジイミドがジシクロヘキシルカルボジ
イミド、ベンジルイソプロピルカルボジイミドま
たはベンジルエチルカルボジイミドである特許請
求の範囲第７項に記載の製造法。 ９ ラクトン化試薬との反応の後、ガングリオシ
ド分子内エステル誘導体をアセトンで沈澱せしめ
る特許請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記
載の製造法。 １０ ラクトン化試薬との反応によつてガングリ
オシドまたはガングリオシド混合物を完全に変換
し、完全にラクトン化されたガングリオシド分子
内エステル誘導体を生成させる特許請求の範囲第
１項〜第９項のいずれかに記載の製造法。
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