JPH0334590B2 - - Google Patents
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- JPH0334590B2 JPH0334590B2 JP18689583A JP18689583A JPH0334590B2 JP H0334590 B2 JPH0334590 B2 JP H0334590B2 JP 18689583 A JP18689583 A JP 18689583A JP 18689583 A JP18689583 A JP 18689583A JP H0334590 B2 JPH0334590 B2 JP H0334590B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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Description
本発明は血漿中ヘモグロビン測定用試薬に関す
るものである。 一般に赤血球がこわれ溶血がおこると体内の各
部位への酸素の供給が低下して貧血となる。そし
てヘモグロビンは赤血球にのみ含まれるので溶血
の指標となる。溶血性貧血をおこす疾患としては
遺伝性球形赤血球症、赤血球グルコース−6−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、自己免疫溶血性貧
血などがあり、細菌感染あるいは鉛、ペンゼンな
どの化学薬品によつてもおこる。 溶血の検査としては、一般には尿中ヘモグロビ
ンの測定が行われているが、軽度の場合には検出
されない。つまり血漿中には100〜150mg/dlのハ
プトグロビンが存在し、赤血球がこわれてヘモグ
ロビンが血漿中に溶出した時、直ちに結合しハプ
トグロビン−ヘモグロビンの結合体を形成する
が、この結合体は腎糸球体を通過しないため、尿
中ヘモグロビンを検出できない。しかしハプトグ
ロビンには量的に上限があり、一般的には血漿ヘ
モグロビン値が135mg/dl以上に達した時に尿中
ヘモグロビンが検出される。したがつて軽度の溶
血を測定するためには血漿中のヘモグロビンを測
定する必要がある。 健康人の血漿中ヘモグロビンの正常範囲は0か
ら5mg/dlであり、臨床的には10mg/dl以上の測
定範囲が重要であるので、血漿ヘモグロビン濃度
は長年ベンチジン法により測定されてきた。しか
しベンチジンの発癌性が問題視され始めて以来、
ベンチジンにかわつてテトラメチルベンチジン
(TMB)、ジカルボキシベンチジン(DCB)を発
色剤として用いる方法(以下前者を用いるものを
TMB法、後者を用いるものをDCB法と称する。)
が行われているが、DCB法は感度は良いものの、
測定範囲が狭いため一般にはTMB法が用いられ
ている。しかしTMB法は、血漿の影響をうけて
値が低くなり検量線の直線性が得難い。また標準
液と検体は別の方法で、かつ経時的に操作を重ね
なければならないという欠点がある。そして、
TMB、DCBはベンチジンの誘導体であるため発
癌性の疑いはまつたくないわけではない。 そこで本発明者らは発色剤として発癌性がな
く、臨床診断薬に広く用いられている2,2′−ア
ジノービス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−
スルホン酸)(ABTS)の利用を考え、鋭意に研
究を重ねた結果、TMB法以上の感度をもち、血
漿の影響もうけなく、操作が簡単である本測定用
試薬を得ることに成功した。 本発明の要旨は過酸化水素の存在下でヘモグロ
ビンのパーオキシダーゼ様作用によりABTSが
酸化された青色を呈することよりヘモグロビン量
を測定するための血漿中ヘモグロビン測定試薬を
提供することにある。即ち、ABTSの酸化形態
は下記の反応式で示される。 さらにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
(EDTA)の添加は呈色の安定化に役立つ。また
本発明における反応溶液のPHは2〜3であるため
血漿タンパクが凝集する場合もあるが、1200〜
2000×gで5分間以上の遠心操作を行うことによ
り、その影響をとりのぞくことができる。 本発明において10mg/dlの血漿ヘモグロビン量
の吸光度は約0.12であり、検量線は2mg/dlから
100mg/dlまで良好な直線性を示し、再現性は高
い。反応は室温にて90分以内で終了する。次に副
反応が徐々に進行し、それに伴つて吸光度も徐々
に増加する(△A=0.0005/min)。しかしTMB
では反応溶液の吸光度を一時的に上昇させ、それ
から徐々に減少させるのに比較すると本発明では
誤差が生じ難く、反応後20分以内に測定するなら
ば誤差は単に0.005mg/dl程度である。 本発明の測定試薬は1.0〜4.0mMのABTSの
酢酸溶液、0.5〜3.0%過酸化水素溶液、0.4〜
1.2mMEDTAを含む0.05〜0.2Mリン酸緩衝液
(PH6〜8)からなる。これらの試薬はそれぞれ
別個に調製され血漿中のヘモグロビンを定量する
時に順次混合される。 次に各試薬の調製法を示す。 ABTS溶液:ABTS50〜205mgを80〜100%
酢酸溶液100mlに溶解する。 過酸化水素溶液:30%過酸化水素水0.5〜3
mlを精製水で全量30mlに調製する。 EDTAを含むリン酸緩衝液:0.4〜
1.2mMEDTAを含む0.05〜0.2Mリン酸−カリ
ウム溶液2部、同一濃度のEDTAを含む0.05〜
0.2Mリン酸二ナトリウム溶液1〜3部を混合
した後、1N水酸化ナトリウム溶液でPH6〜8
に合わせる。 ABTS溶液2〜3部、過酸化水素溶液1部、
EDTAを含むリン酸緩衝液5〜15部をよく混
合し、血漿を加え、室温から50℃の温度で30分
から90分間放置した後、1200〜2000×gで5分
間以上の遠心操作を行い、波長400〜430nmに
おける上清の吸光度を測定する。 以下に本発明の測定用試薬の調製法および測定
方法を下記の実施例で具体的に例示する。 実施例 (1) 試薬の調製 ABTS溶液:ABTS150mgを90%酢酸100
mlに溶解する。 過酸化水素溶液:30%過酸化水素水1mlを
精製水29mlと混合する。 EDTAを含むリン酸緩衝液:EDTAを含
むリン酸緩衝液:EDTA32mgを含む0.1Mリ
ン酸一カリウム溶液128mlとEDTA25mgを含
む0.1Mリン酸二ナトリウム溶液100mlを混合
した後、1N水酸化ナトリウム溶液でPH7.6に
調節する。 ヘモグロビン標準液:1mlの赤血球を0.9
%塩化ナトリウム溶液で2回洗浄する。次に
10mlの精製水を加え−30℃で凍結させること
によつて溶血させた後に、室温で放置し融解
させる。その溶液を4000×gで10分間遠心
し、上清のヘモグロビン量をシアンメトヘモ
グロビン法によつて測定した後、1〜100
mg/mlとなるように希釈しヘモグロビン標準
液とする。 (2) 血漿中ヘモグロビンの定量 ABTS溶液2.5ml、過酸化水素溶液1ml、
EDTAを含むリン酸緩衝液8mlを試験管に入
れてよく混合し、ヘモグロビン標準液または血
漿5μlを加え、よく混合する。室温で90分間放
置した後に1500×gで5分間遠心し、上清の
410nmにおける吸光度を測定する。 吸光度からヘモグロビン量への換算はヘモグ
ロビン標準液により作成した検量線から読み取
ることにより行う。 実験例における同時再現性及び日差変動を表
に示す。
るものである。 一般に赤血球がこわれ溶血がおこると体内の各
部位への酸素の供給が低下して貧血となる。そし
てヘモグロビンは赤血球にのみ含まれるので溶血
の指標となる。溶血性貧血をおこす疾患としては
遺伝性球形赤血球症、赤血球グルコース−6−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、自己免疫溶血性貧
血などがあり、細菌感染あるいは鉛、ペンゼンな
どの化学薬品によつてもおこる。 溶血の検査としては、一般には尿中ヘモグロビ
ンの測定が行われているが、軽度の場合には検出
されない。つまり血漿中には100〜150mg/dlのハ
プトグロビンが存在し、赤血球がこわれてヘモグ
ロビンが血漿中に溶出した時、直ちに結合しハプ
トグロビン−ヘモグロビンの結合体を形成する
が、この結合体は腎糸球体を通過しないため、尿
中ヘモグロビンを検出できない。しかしハプトグ
ロビンには量的に上限があり、一般的には血漿ヘ
モグロビン値が135mg/dl以上に達した時に尿中
ヘモグロビンが検出される。したがつて軽度の溶
血を測定するためには血漿中のヘモグロビンを測
定する必要がある。 健康人の血漿中ヘモグロビンの正常範囲は0か
ら5mg/dlであり、臨床的には10mg/dl以上の測
定範囲が重要であるので、血漿ヘモグロビン濃度
は長年ベンチジン法により測定されてきた。しか
しベンチジンの発癌性が問題視され始めて以来、
ベンチジンにかわつてテトラメチルベンチジン
(TMB)、ジカルボキシベンチジン(DCB)を発
色剤として用いる方法(以下前者を用いるものを
TMB法、後者を用いるものをDCB法と称する。)
が行われているが、DCB法は感度は良いものの、
測定範囲が狭いため一般にはTMB法が用いられ
ている。しかしTMB法は、血漿の影響をうけて
値が低くなり検量線の直線性が得難い。また標準
液と検体は別の方法で、かつ経時的に操作を重ね
なければならないという欠点がある。そして、
TMB、DCBはベンチジンの誘導体であるため発
癌性の疑いはまつたくないわけではない。 そこで本発明者らは発色剤として発癌性がな
く、臨床診断薬に広く用いられている2,2′−ア
ジノービス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−
スルホン酸)(ABTS)の利用を考え、鋭意に研
究を重ねた結果、TMB法以上の感度をもち、血
漿の影響もうけなく、操作が簡単である本測定用
試薬を得ることに成功した。 本発明の要旨は過酸化水素の存在下でヘモグロ
ビンのパーオキシダーゼ様作用によりABTSが
酸化された青色を呈することよりヘモグロビン量
を測定するための血漿中ヘモグロビン測定試薬を
提供することにある。即ち、ABTSの酸化形態
は下記の反応式で示される。 さらにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
(EDTA)の添加は呈色の安定化に役立つ。また
本発明における反応溶液のPHは2〜3であるため
血漿タンパクが凝集する場合もあるが、1200〜
2000×gで5分間以上の遠心操作を行うことによ
り、その影響をとりのぞくことができる。 本発明において10mg/dlの血漿ヘモグロビン量
の吸光度は約0.12であり、検量線は2mg/dlから
100mg/dlまで良好な直線性を示し、再現性は高
い。反応は室温にて90分以内で終了する。次に副
反応が徐々に進行し、それに伴つて吸光度も徐々
に増加する(△A=0.0005/min)。しかしTMB
では反応溶液の吸光度を一時的に上昇させ、それ
から徐々に減少させるのに比較すると本発明では
誤差が生じ難く、反応後20分以内に測定するなら
ば誤差は単に0.005mg/dl程度である。 本発明の測定試薬は1.0〜4.0mMのABTSの
酢酸溶液、0.5〜3.0%過酸化水素溶液、0.4〜
1.2mMEDTAを含む0.05〜0.2Mリン酸緩衝液
(PH6〜8)からなる。これらの試薬はそれぞれ
別個に調製され血漿中のヘモグロビンを定量する
時に順次混合される。 次に各試薬の調製法を示す。 ABTS溶液:ABTS50〜205mgを80〜100%
酢酸溶液100mlに溶解する。 過酸化水素溶液:30%過酸化水素水0.5〜3
mlを精製水で全量30mlに調製する。 EDTAを含むリン酸緩衝液:0.4〜
1.2mMEDTAを含む0.05〜0.2Mリン酸−カリ
ウム溶液2部、同一濃度のEDTAを含む0.05〜
0.2Mリン酸二ナトリウム溶液1〜3部を混合
した後、1N水酸化ナトリウム溶液でPH6〜8
に合わせる。 ABTS溶液2〜3部、過酸化水素溶液1部、
EDTAを含むリン酸緩衝液5〜15部をよく混
合し、血漿を加え、室温から50℃の温度で30分
から90分間放置した後、1200〜2000×gで5分
間以上の遠心操作を行い、波長400〜430nmに
おける上清の吸光度を測定する。 以下に本発明の測定用試薬の調製法および測定
方法を下記の実施例で具体的に例示する。 実施例 (1) 試薬の調製 ABTS溶液:ABTS150mgを90%酢酸100
mlに溶解する。 過酸化水素溶液:30%過酸化水素水1mlを
精製水29mlと混合する。 EDTAを含むリン酸緩衝液:EDTAを含
むリン酸緩衝液:EDTA32mgを含む0.1Mリ
ン酸一カリウム溶液128mlとEDTA25mgを含
む0.1Mリン酸二ナトリウム溶液100mlを混合
した後、1N水酸化ナトリウム溶液でPH7.6に
調節する。 ヘモグロビン標準液:1mlの赤血球を0.9
%塩化ナトリウム溶液で2回洗浄する。次に
10mlの精製水を加え−30℃で凍結させること
によつて溶血させた後に、室温で放置し融解
させる。その溶液を4000×gで10分間遠心
し、上清のヘモグロビン量をシアンメトヘモ
グロビン法によつて測定した後、1〜100
mg/mlとなるように希釈しヘモグロビン標準
液とする。 (2) 血漿中ヘモグロビンの定量 ABTS溶液2.5ml、過酸化水素溶液1ml、
EDTAを含むリン酸緩衝液8mlを試験管に入
れてよく混合し、ヘモグロビン標準液または血
漿5μlを加え、よく混合する。室温で90分間放
置した後に1500×gで5分間遠心し、上清の
410nmにおける吸光度を測定する。 吸光度からヘモグロビン量への換算はヘモグ
ロビン標準液により作成した検量線から読み取
ることにより行う。 実験例における同時再現性及び日差変動を表
に示す。
【表】
図面は本発明の実施例における標準曲線を示す
グラフであり、既知濃度標準ヘモグロビン量を横
軸に、吸光度を縦軸に示したものである。
グラフであり、既知濃度標準ヘモグロビン量を横
軸に、吸光度を縦軸に示したものである。
Claims (1)
- 1 1.0〜4.0mM2,2′−アジノ−ビス(3−エ
チルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)の酢酸
溶液、0.5〜3.0%過酸化水素溶液、0.4〜
1.2mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを
含む0.05〜0.2Mリン酸緩衝液(PH6〜8)より
なる血漿中ヘモグロビン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18689583A JPS6079271A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 血漿中ヘモグロビン測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18689583A JPS6079271A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 血漿中ヘモグロビン測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6079271A JPS6079271A (ja) | 1985-05-07 |
| JPH0334590B2 true JPH0334590B2 (ja) | 1991-05-23 |
Family
ID=16196560
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18689583A Granted JPS6079271A (ja) | 1983-10-07 | 1983-10-07 | 血漿中ヘモグロビン測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6079271A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111766233B (zh) * | 2020-07-22 | 2021-03-30 | 中临健康科技产业有限公司 | 一种血清总抗氧化物状态测定试剂盒 |
-
1983
- 1983-10-07 JP JP18689583A patent/JPS6079271A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6079271A (ja) | 1985-05-07 |
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