JPH0336508B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は複数の分極性微粒体、特に、細胞を
不均一電界内において互いに接触状態に集合させ
る方法および装置に関する。

技術背景 一般に、生体細胞を電界中におくと細胞膜部分
に電気二重層が形成され、即ち、分極される。従
来、このような分極性微粒体を不均一電界内に置
いて電束密度もしくは電気変位が極大となる極点
に向けて移動、即ち、誘電泳動させ、該極点にお
いて分極性微粒体を互いに接触状態に集合させる
ことが知られている。

上記集合方法を用いる一具体例として誘電泳動
を利用する電気的細胞融合法が公知である。即
ち、マンニトール溶液等の非電解質溶液に細胞を
懸濁し、この懸濁液を、例えば、平板状電極−棒
状電極あるいは棒状電極−棒状電極間等に形成さ
れる不均一電界内に置くと、該溶液中の各細胞が
誘電泳動し、当該不均一電界における電気変位が
極大となる棒状電極の先端部およびその表面に数
珠状に連なり、次いで、接触細胞に適当な電気パ
ルスによる刺激を加えて細胞融合が成就される。

しかしながら、上記従来の方法においては、接
触状態に集合させようとする分極性微粒体が電極
表面に直接接触する方式のものであるため、電極
表面が汚損され、当該電界の強さを一定に維持す
ることが出来ず、連続的に安定して集合操作を行
うことが困難であつた。特に、細胞融合等におい
て細胞の集合操作を行うときには、電極表面の汚
損のみならず、電極表面に直接接触する細胞が破
損する危険性が大いにあつた。また、互いに接触
させられた細胞対の組み合わせは不規則的なもの
であり、たとえば、異種細胞ＡおよびＢの細胞融
合を行うにあたり、電極表面の近傍に配列される
細胞の組み合わせは、Ａ−Ａ、Ｂ−Ｂ、Ａ−Ｂ等
が不規則に現れ、所要の細胞対Ａ−Ｂのみを得難
く、このため、たとえば、顕微鏡等を使用して所
要の細胞対Ａ−Ｂを選別するようにしており、こ
のような余分の選別工程が必要なため融合操作全
体の作業能率が良くなかつた。

解決しようとする課題 この発明は、上述した種々の問題点を解消する
ためになされたものであり、原理的に、電界発生
用の一対の電極間の中間部に電気変位あるいは電
束密度が極大となる極大点を形成する一方、該極
点の少なくとも２つ以上の相対向する側方位置か
ら当該不均一電界内にそれぞれ接触させようとす
る分極性微粒体を装入して、各電極表面から離間
した極点において所望の組み合わせの分極性微粒
体群を得るようにした分極性微粒体の集合方法を
提供しようとするものである。

更に、この発明は、電気絶縁性の容器内に設置
された電界発生用の一対の平板状電極間に電気絶
縁体を介在させて該電極間の中間部において断面
積が極小となる導通路を形成し、これにより該導
通路の狭隘部に電気変位あるいは電束密度が極大
となる極大点を形成する一方、上記導通路におけ
る狭隘部の相対向する側方位置にそれぞれ分極性
微粒体の装入口部を形成した分極性微粒体の集合
装置を提供しようとするものである。

なお、この発明は、特に、異種細胞融合用とし
て非常に有用なものであるが、これに限らず、マ
イクロカプセルにDNA（デオキシリボ核酸）等の
所要の物質を封入し、このマイクロカプセルと細
胞とを溶液内で互いに接触させて該細胞に上記物
質を導入する、いわゆる、カプセル法による物質
の導入とか、溶液中での細胞へのDNA−ベクタ
ーの導入等に有用なものである。

この明細書において細胞とは、前後の文章から
矛盾のない限り、完全な細胞のみならず、細胞融
合の目的で予め所定の処理を施した細胞、たとえ
ば、プロトプラストなどを包含するものとする。

又、用語“細胞融合”は便宜上、細胞と、例え
ばDNAを封入したマイクロカプセルとの融合、
さらには細胞へのDNA−ベクターの導入をも意
味するものとする。このマイクロカプセルは、人
工および天然のいずれのものであつてもよい。

実施例 この発明を、実施例を示す添付図面とともに説
明する。なお、この実施例は植物プロトプラスト
の集合および融合に適用するものである。

第１図および第２図において、１はアクリル樹
脂により外形が略矩形板状に一体成形された枠体
である。この枠体１の対向する２つの長辺側壁に
それぞれ対称形の４角錐台形状の突起部２−１，
２−２が互いに対向するように形成されている。
両突起部２−１，２−２のテーパー面３，３およ
び先端面４は断面積が枠体１の中心部で最小とな
るテーパー状の導通路５を形成している。なお、
突起部２−１，２−２は枠体１とは個別のものと
してもよい。また、これらの突起部２−１，２−
２はアクリル樹脂に限らず、高電気絶縁性のテフ
ロン（米国デユポン社の商品名）、マイラ（米国
デユポン社の商品名）等、他の合成プラスツチツ
ク材またはセラミツクス、マイカ等から形成した
ものであつてもよい。

上記枠体１の底面１−１には電気絶縁性の透明
ガラス板８が接着される一方、上面１−２には電
気絶縁材料から成る蓋体９が取り付けられる。こ
のようにして、枠体１の側壁と透明ガラス板８と
蓋体９とにより対称形の２つの密閉チヤンバ６−
１，６−２が形成されている。両密閉チヤンバ６
−１，６−２は枠体１の中央部で収束する導通路
５を介して接続されている。導通路５における断
面積の極小となる部分を狭隘部７という。第１図
および第２図に示すように、この狭隘部７の長さ
ｌ、幅ｄおよび高さｈは集合させようとする細胞
に応じて適宜な寸法とされる。

上記密閉チヤンバ６−１，６−２内に互いに平
行にかつ対向状に平板電極１１−１，１１−２が
設置される。両平板電極１１−１，１１−２は共
に白金（Pt）から形成され、それらの平面形状
および面積は同等とされる。なお、電極材料とし
て、たとえば、ステンレス、銀−塩化銀、あるい
はアザブリツジ等の液絡電極などを使用するよう
にしてもよい。そして、両平板電極１１−１，１
１−２は詳細に後述するように電界発生用交流
（AC）電源回路１３と接続され、該交流電源回路
１３から交流電圧が印加されると、平板電極１１
−１，１１−２間におけるチヤンバ６−１，６−
２および導通路５の内部領域に電界を発生する。
この電界は枠体１、透明ガラス板８および蓋体９
により該チヤンバ６−１，６−２および導通路５
の内部領域に有効に閉じ込められるとともに電気
絶縁体の突起部２−１，２−２により、第３図に
示すように導通路５における断面積が最小もしく
は極小となる位置で電束密度あるいは電気変位が
極大となる。このようにして、密閉チヤンバ６−
１，６−２および導通路５の内部領域に不均一電
界が形成される。

上記密閉チヤンバ６−１，６−２の側壁部にそ
れぞれの細胞装入口２１−１，２１−２が設けら
れる。そして、各装入口２１−１，２１−２にそ
れぞれコンジツト２２−１，２２−２が接続され
るとともに図示しないポンプによりバルブ２３−
１，２３−２を介して細胞懸濁液が注入されるよ
うになつている。さらに、導通路５の狭隘部７を
形成する一方の突起部、たとえば、２−１の先端
面に融合細胞取出口２５が設けらる。この取出口
２５にコンジツト２６が接続され、図示しないポ
ンプによりバルブ２７を介して融合細胞が取り出
されるようになつている。融合しようとする細胞
は、好ましくは、浸透圧および比重調整用として
マンニトール、ソルビトール、グルコースまたは
シユクロース等と、細胞安定性および伝導度調整
剤として塩化カルシユウム（CaCl₂）等並びに
pH緩衝塩等を含む電解質溶液に懸濁され、懸濁
液の状態で上記不均一電界内に導入される。

一方、上記対向平板電極１１−１，１１−２
は、リード線１２およびスイツチ手段１４を介し
て交流（AC）電源回路１３と接続されるととも
にリード線１２およびスイツチ手段１６を介して
パルス発生器１５と接続される。両スイツチ手段
１４および１６は、たとえば、トランジスタ等か
ら成る電子スイツチが用いられ、公知の方法によ
り制御回路１７に設定された所定のタイムチヤー
トに従つてオン・オフ制御される。この構成によ
り、交流電源回路１３からスイツチ手段１４を介
して平板電極１１−１，１１−２に周波数約10K
Hz〜500KHz、ピーク電圧約5V〜2000V（ボルト）
の正弦波交流電圧が約１秒〜600秒間加えられ、
前述したようにチヤンバ６−１，６−２および導
通路５の内部領域に、該導通路５の狭隘部７にお
いて電気変位を最大もしくは極大とする不均一電
界が形成される。なお、交流電源回路１３の出力
波形は正弦波に限らず、三角波、方形波あるいは
鋸歯状波等であつてもよい。また、上記狭隘部７
に細胞が接触状態に集合した後、パルス発生器１
５からスイツチ手段１６を介して平板電極１１−
１，１１−２にパルス幅約1.0μsec（マイクロ秒）
〜10ｍsec（ミリ秒）、ピーク電圧約10V（ボルト）
〜5KV（キロボルト）の方形状パルスが約１ｍ
sec（ミリ秒）〜数ｍsec（数ミリ秒）の間隔で１〜
数回加えられる。このようにして、上記狭隘部７
に集合した細胞対に電気パルスによる刺激が加え
られ、公知の成長過程をもつて細胞融合が成就さ
れる。なお、このパルス発生器１５の出力パルス
は上記交流電源回路１３の出力電圧に重畳して平
板電極１１−１，１１−２に加えるようにしても
よい。これにより、細胞融合処理の所要時間の短
縮化を図ることができる。

次に、上記構成の装置を使用して異種細胞Ａ、
Ｂの融合を行う操作について説明する。

まず、バルブ２３−１を開いて装入口２１−１
からチヤンバ６−１内に細胞Ａを懸濁した懸濁液
を注入するとともにバルブ２３−２を開いて装入
口２１−２からチヤンバ６−２に上記懸濁液と同
様の細胞Ｂを懸濁した懸濁液を注入する。

次いで、制御回路１７により公知の方法でスイ
ツチ手段１４を閉じ、交流電源回路１３から該ス
イツチ手段１４を介して平板電極１１−１，１１
−２間に、たとえば、周波数約100KHz（キロヘ
ルツ）、ピーク電圧約40V〜80Vの正弦波、三角
波または方形波等の交流電圧を印加する。この場
合、電極間距離は２ミリメートル（mm）であつ
た。両平板電極１１−１，１１−２、枠体１およ
び突起部２−１，２−２により区画された領域、
即ち、密閉チヤンバ６−１，６−２および導通路
５の内部領域には該導通路５の狭隘部７における
電気変位を最大とする不均一電界が形成される。
以下に、この狭隘部７における電気変位の最大と
なる部分を極大点という。なお、上記装置の平板
電極間距離、平板電極寸法、導通路寸法は次のと
おりであつた。： 平板電極間距離；2.0mm、 平板電極寸法（幅×高さ）；0.8mm×0.5mm、 導通路寸法（ｄ×ｈ×ｌ）；（0.1〜0.25mm）×（0.5
mm）×（0.01mm） 上記不均一電界がチヤンバ６−１，６−２およ
び導通路５内の細胞Ａ、Ｂに作用すると、各細胞
Ａ、Ｂの細胞膜部分に電気二重層が誘起され、即
ち、分極される。これらの分極された細胞Ａ、Ｂ
は当該不均一電場のエネルギーに基づき狭隘部７
の極大点に向かつて移動、いわゆる、誘電泳動す
る。ある瞬時における誘電泳動の様子を模擬的に
第３図に示す。即ち、チヤンバ６−１内の細胞Ａ
は平板電極１１−１側から極大点に向かつて移動
する一方、チヤンバ６−２内の細胞Ｂは上記細胞
Ａの移動方向とは逆方向に平板電極１１−２側か
ら極大点に向かつて移動する。そして、互いに近
接した細胞Ａ、Ｂは各細胞の異極性の分極電荷間
に作用するクーロン力に基づき互いに吸引され、
接触状態となる。この様子は、当該装置の透明ガ
ラス板８側に設置した図示しない顕微鏡を介して
観察することができる。

なお、上記狭隘部７において細胞Ａ、Ｂが３個
以上数珠状に連ねられる、たとえば、細胞対Ａ−
Ａ−Ｂ−Ｂ、Ａ−Ａ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ｂ等が生
じるようなときには、上記不均一電界発生用の交
流電圧印加時間を適宜調節することにより１個の
細胞Ａと１個の細胞Ｂとから成る細胞対Ａ−Ｂを
得ることができる。

次いで、スイツチ手段１６を閉じ、パルス発生
器１５から該スイツチ手段１６を介して平板電極
１１−１，１１−２間にピーク電圧約50V〜
200V、パルス幅約20ｍsec〜200μsecの方形状パ
ルスを１秒〜数秒の間隔をもつて１〜数回印加す
る。これにより、細胞懸濁溶液を介して導通路５
の狭隘部７に集合した細胞対Ａ−Ｂに電気パルス
刺激が加わり、これらの細胞対Ａ−Ｂはそれぞれ
融合する。

次ぎに、バルブ２７を開き、図示しないポンプ
よりそれぞれコンジツト２２−１および２２−２
を介して細胞ＡおよびＢの懸濁液をチヤンバ６−
１，６−２内に導入する。これで細胞融合操作の
１サイクルが完了する。

その後、再び上述したように、不均一電界の発
生、細胞Ａ、Ｂの集合、細胞対Ａ−Ｂへの電気刺
激の印加、融合細胞の取り出しおよび新しい細胞
Ａ、Ｂの導入操作を繰り返し行う。

なお、上述したと同様にして、３個以上の細胞
を集合させて融合することもできる。

次ぎに、上記装置の幾つかの変形例を第４図〜
第８図とともに説明する。なお、これらの図面に
おいて、第１図および第２図の装置における構成
部分と等価の部分には同一符号を付してその説明
を省略する。

第４図の装置は、突起部２−１，２−２に代
え、複数の貫通孔３１を有する電気絶縁板体３０
を平等電界発生用平板電極１１−１，１１−２間
に設置して構成したものである。各貫通孔３１
は、上記突起部２−１，２−２により形成される
導通路５と同様、中央部で断面積が最小もしくは
極小となるテーパー面を形成している。このよう
にして、両平板電極１１−１，１１−２間に電圧
を印加した際に各貫通孔３１の狭隘部３２で電気
変位が極大となる。又、両平板電極１１−１，１
１−２と当該電気絶縁板体３０との間部はチヤン
バ６−１，６−２として使用される。この構成に
より異種細胞の細胞融合を効能率に行うことがで
きる。

上記電気絶縁板体３０および平板電極１１−
１，１１−２は、第５図に示すように、水平状に
配置するようにしてもよい。これにより、融合細
胞の自重を有効に利用して下側のチヤンバ６−１
に誘導し、該チヤンバ６−１を融合細胞の取り出
し用コンジツトとしても兼用することができる。

また、第６図および第７図に示すように、電気
絶縁板体３３の下端部３４を凸状に形成し、該下
端部３６と当該装置の底面部の透明ガラス板８と
で中央部の断面積が最小もしくは極小となる導通
路３５を形成するようにしてもよい。この電気絶
縁板体３３は融合しようとする細胞の大きさに応
じて白抜き矢印で示すように上・下に移動調整可
能とされる。これにより第７図の表面に沿つて
上・下方向に、即ち、当該狭隘部３７において水
平にかつ単層状に整列して互いに接触した直鎖状
の複数の細胞群を生成することができる。

さらに、第８図の装置においては、上記透明ガ
ラス板８に代えて、貫通長穴３９を有する電気絶
縁板３８が設置されるとともに該貫通長穴３９の
下側開口を閉塞するように電極板４１が設置され
る。上記貫通長穴３９の上側開口４０は上記電気
絶縁板体３３の下端部３４の凸状部と相似形態と
され、該開口４０に下端部３４の凸状部を突入さ
せることにより当該貫通長穴３９が密閉され、こ
の密閉部は細胞取り出し用コンジツトとして使用
される。細胞集合用の不均一電界は第６図および
第７図の装置におけると同様にして対向平板電極
１１−１，１１−２間に電圧を印加することによ
り形成される一方、細胞融合誘発用の電圧は平板
電極１１−１および１１−２と電極板４１との間
に印加される。

なお、上述した実施例において、チヤンバ６−
１，６−２は好ましくは溶液装填を容易にすべく
密閉状とされるが、蓋体の無い解放状のものとし
てもよい。

上述した実施例において、対向電極間に交流電
圧に代えて直流電圧を印加して不均一電界を形成
し、負の平板電極側のチヤンバに負電荷を有する
ベクターを装入する一方、正の平板電極側のチヤ
ンバに細胞を装入し、細胞を導通路５の狭隘部７
に向けて誘電泳動させる一方、負電荷を有するベ
クターを直流電界に基づき狭隘部７に向けて電気
泳動させる。このようにして、狭隘部７において
細胞とベクターを互いに接触させて該細胞にベク
ターを導入することができる。

また、チヤンバ６−１と６−２にそれぞれ細胞
と所定の物質、例えば、DNA等が封入されたマ
イクロカプセルを装入し、前述した異種の細胞融
合と同様にして細胞とマイクロカプセルとを互い
に接触させ、次いで両者を融合させて該細胞に所
定の物質を導入することもできる。

発明の効果 この発明によれば、対向電極間領域の中間位置
に電気変位または電束密度が最大もしくは極大と
なる極大点を形成し、上記極大点の相対向する側
方位置から装入した分極性微粒体を該不均一電界
に基づき誘電泳動させて該極大点で互いに接触さ
せるものであるから、従来方式のものにおけるよ
うに誘電泳動される分極性微粒体が直接電極に接
触することもなく、したがつて、電極を汚損する
こともなく安定した不均一電界を形成でき、それ
だけ安定した集合操作を行うことができる。特
に、分極性微粒体が細胞である場合、電極の汚損
を防止できるのみならず、細胞自体の傷損を有効
に防止することができる。

また、異種の分極性微粒体を種類毎に極大点の
相対向する側方位置から極大点に向けて集合する
ようにしたから、確実に互いに接触した所定の組
み合わせの分極性微粒体群を得ることができる。
特に、互いに異なつた２種の細胞を融合するのに
用いた場合、極大点の相対向する側方位置から種
類毎に細胞を当該不均一電界内に装入すれば異種
の組み合わせの細胞対のみが得られ、したがつ
て、選別作業を必要としないので高能率に異種細
胞の融合を達成することができる。

なお、本発明は、細胞融合に限らず、他の分極
性微粒体の集合操作、例えば、マイクロカプセル
法による細胞への所定物質の導入とか、DNA−
ベクターの導入等に使用すれば非常に高能率に導
入操作を達成することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例の装置の構成を示
す一部断面図、第２図は第１図の−線断面
図、第３図は上記装置に形成される不均一電界の
説明図、第４図はこの発明の変形例の部分断面
図、第５図はこの発明のもう１つの変形例の要部
断面図、第６図はさらにもう１つの変形例の一部
切欠した部分断面図、第７図は第６図の−線
断面図、第８図は更にもう１つの変形例の要部断
面図である。 １……電気絶縁材製枠体、２−１，２−２……
突起部、３……テーパー面（傾斜面）、５……導
通路、６−１，６−２……チヤンバ、７……狭隘
部、８……透明ガラス板、９……蓋体、１１−
１，１１−２……平板電極、１２……リード線、
１３……交流電源回路、１４……スイツチ手段、
１５……直流パルス発生器、１６……スイツチ手
段、２１−１，２１−２……装入口部、２２−
１，２２−２，２６……コンジツト、２３−１，
２３−２，２７……バルブ、２５……融合細胞取
出し口部、３０……電気絶縁板体、３１……貫通
孔、３２……狭隘部、３３……電気絶縁板体、３
４……凸状の下端部、３５……導通路、３７……
狭隘部、３９……貫通長穴、４０……開口。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 不均一電界内で複数の分極性微粒体を誘電泳
   動させて該不均一電界における電気変位の極大と
   なる位置に互いに接触状態に集合させるにあた
   り、 電界発生用の対向電極間領域における中間位置
   に電気変位の極大点を有する不均一電界を発生さ
   せる一方、該極大点と上記両電極との中間位置か
   ら当該不均一電界内に分極性微粒体を装入するこ
   とを特徴とする集合方法。 ２ 異種の分極性微粒体が種類毎に極大点と電界
   発生用の対向電極との相対向する中間位置から当
   該不均一電界内に装入される特許請求の範囲第１
   項に記載の集合方法。 ３ 対向電極間に電解質溶液を装填し、該電解質
   溶液に異種の分極性微粒体を懸濁する特許請求の
   範囲第１項または第２項に記載の集合方法。 ４ 異種の分極性微粒体が互いに異なる２種の細
   胞である特許請求の範囲第３項に記載の集合方
   法。 ５ 不均一電界内において集合により互いに接触
   させられた複数の細胞に電気パルスを印加して細
   胞融合を行わせる特許請求の範囲第４項に記載の
   集合方法。 ６ 電解質溶液が細胞融合誘発剤を含みかつ異種
   の分極性微粒体が細胞である特許請求の範囲第３
   項に記載の集合方法。 ７ 異種の分極性微粒体が細胞と所定の物質を包
   含するマイクロカプセルである特許請求の範囲第
   ３項に記載の集合方法。 ８ 異種の分極性微粒体が細胞とDNA−ベクタ
   ーである特許請求の範囲第３項に記載の集合方
   法。 ９ 不均一電界内で複数の分極性微粒体を誘電泳
   動させて該不均一電界における電気変位の極大と
   なる位置に互いに接触状態に集合させる装置にお
   いて、 電気絶縁性の容器、 上記容器内に互いに平行に所定の間隔をもつて
   対向させられた電界発生用の平板状電極、 上記平板状電極と接続させた電源回路、 上記平板状電極間の電界形成空間に介在させら
   れ、該両平板状電極間の中間位置において断面積
   が極小となる導通路を形成する電気絶縁体、およ
   び 上記導通路における狭隘部の相対向する両側方
   位置にそれぞれ該導通路と連絡した複数の分極性
   微粒体装入口部を備え、 上記電源回路から平板状電極間に所定電圧を印
   加することにより上記導通路の狭隘部において電
   気変位が極大となる不均一電界を形成せしめるこ
   とを特徴とする装置。 １０ 電気絶縁体が板状体とされ、該板状体の両
   面からそれぞれ内方に向けて開口断面積の漸減す
   るテーパー面を形成した少なくとも１つの貫通部
   を設けた特許請求の範囲第９項に記載の装置。 １１ 導通路が電気絶縁性板体の一端面に凸状に
   形成された傾斜もしくは円曲面と該面と対向した
   もう１つの電気絶縁性板体の一方の面とで形成さ
   れる特許請求の範囲第９項に記載の装置。 １２ 電源回路が対向平板電極間に約5KHz〜
   10MHz、電界の強さ約10V／cm〜2KV／cmの電界
   を発生する交流電圧を出力する特許請求の範囲第
   ９項〜第１１項のいづれかに記載の装置。 １３ 容器の平板状電極間の中間領域に所定の電
   解質溶液が装填されるとともに該電解質溶液に細
   胞が懸濁される一方、 もう１つのパルス電源回路が設けられ、該パル
   ス電源回路から対向平板状電極を介して導通路に
   おいて互いに接触状態とされた複数の細胞にパル
   ス電圧を印加して細胞融合を行わせる特許請求の
   範囲第９項〜第１２項のいづれかに記載の装置。 １４ 導通路の狭隘部に融合細胞取出し手段を設
   けた特許請求の範囲第１３項に記載の装置。