JPH0338270B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、使用後数ヶ月経過した土壌内に残存
量としてどの程度のアトラジンが残留しているか
を決定する際に有用である化合物に関する。

従来の技術 除草剤のトリアジン類の１種であるアトラジン
は数年来使用されておりかつ廉価かつ有効であ
り、従つて広範囲に使用される雑草防除用の化学
薬品である。しかしながら、アトラジンは土壌中
に残留するという問題点を有する。

アトラジン残存量を決定するための現在の技術
は不十分である。農業者自身が使用することので
きる、真に実用的と見なされうる唯一の方法は生
物定量法である。もう１つの方法は土壌試料を評
価のために営利的実験室に送ることである。

生物定量法は一般に残留アトラジンを分析する
ための認容技術として見なされる。秋まきこむぎ
を害すると知られているアトラジンレベルの高濃
度を検出する小型生物定量装置を構成することは
公知である。しかしながら、この場合には有利に
は５〜10個のオート麦の種を植付けた多数の温室
ポツトと共に十分に採光されかつ換気される適当
なスペースが必要である。また、分析を実施しか
つその結果の精度を確認するためには熟練、時間
及び訓練を必要とする。この場合には、種の発芽
及びエマージエンスに引続き、夫々のポツトが均
等な寸法のほぼ３本の植物を有するように間引
し、該植物を引続き根こそぎ引抜き、任意の土壌
残留分を十分に洗い落しかつ予め精度まで計量す
る。この重量を記録しかつ系統的に分析すること
により、土壌中になお存在する残留アトラジンの
線状表示が得られる。

このような生物定量法には若干の欠点があり、
その重要な１つはたとえ全てが順調に進行したと
しても上記試験を実施するには最低20日間が必要
であることにある。生物定量法の感度の下限はほ
ぼ0.0458Kg／ヘクタール（0.25Ib／エーカ）であ
り、かつ少なくとも若干のタイプの土壌において
は、より低いレべルでコムギ栽培にとつては有害
であることが知られている。分析の一般的目的は
コムギを栽培するのに安全かどうかを決定するこ
とでありかつなお分析技術が信頼されうる決定が
なされないほどに低感度であれば、該試験法はほ
とんど無価値である。

農業者に開かれた第２の選択性は、土壌試料を
試験のための試験所に送ることである。これらの
試験所の若干は前記の生物分析技術を採用し、そ
の他は一般に若干の類型のガスクロマトグラフイ
ー又は高圧液体クロマトグラフイーを利用する方
法を採用している。

これらの技術を使用して実現される全ての結果
は土壌試料中の残留除草剤の極めて正確な決定で
あるが、しかしながら装置、材料及び実験のコス
トはいかなる生物検定を用いる場合よりもかなり
高く、かつ結果を得るためには数週間以上かか
る。更に、全体的残留除草剤レベルを決定するた
めには、１つの耕作地当り数個の試料を検出すべ
きであり、従つて該コストはかなり高価である。

最近まで、免疫技術は大規模に医学及び獣医学
的研究に制限された。しかしながら、最近では園
芸分野、特に種々の植物性ウイルスの識別及び制
御の分野で若干の注目すべき成果を上げている。
特に、いわゆる“マイクロプレート・エンツーム
ーリンクドΓイムミユノソルバントΓアセイ
（microplate enzyme−linked immunosorbant
assay）”は廉価であり、信頼できかつ極めて高
感度である。この技術が開発される前に、特定の
免疫学的方法は折々試みられたが、農業において
はほとんど無価値であると見なされていた、それ
というのも該方法を実施するためには高い費用及
び高度の技術的熟練を必要とするからである。こ
の見解はもはや不当でありかつ免疫学の分野は農
業のためにも多いに有望である。不運にも、免疫
技術が適用されるようにするには、所望の免疫反
応を喚起しかつ検定すべき分子に対して固有の抗
体を形成させる抗原を設計しかつ創造する問題が
未解決のままである。

ところで、本発明によれば、アトラジンに対し
て特異性であることが立証された抗原が合成され
た。しかも、該抗体を使用して得られる免疫検定
法は10億（10⁹）部当り数部の範囲のアトラジン
を定量的に検出することが可能である。この検定
法の特殊性は、著しく類似した化合物、例えばヒ
ドロキシアトラジン又はさらに別の代謝産物が存
在してもほとんど又は全く検出可能な免疫反応が
生じないことである。該抗原を製造した後、それ
をウサギに注射した。適当な抗体が形式されるま
で、一定の間隔で再注射しかつ採血した。得られ
た検定値は、ハプテンのヨーソ化したチロシンメ
チルエステルを使用した放射性免疫検定
（ELISA）並びにオバルブミン結合体を使用した
酸素結合免疫吸収体によつて測定した場合のアト
ラジンに対する高度の識別を示す。アトラジンの
若干の先駆物質、代謝物質及び分解生成物は、検
出において生じたとしても僅かな活性を示すにす
ぎない。試薬としてELISAを使用する場合には、
既知量のアトラジンを含有する若干の試料を良好
な対応結果を伴つて上記試薬の被検物体を形成す
る抗体を使用する検定にかけた。

発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の主要な目的は、生物学的試料
内に含有されるアトラジンを特異的に検出しかつ
また定量することのできる抗体を刺激するために
有効である蛋白結合ハプテンを提供することであ
る。

このような抗原は好ましくは極めて類似した誘
導体に対して不感性であるべきである。

本発明のもう１つの目的は、十億部当り数部の
範囲で感度を有するアトラジンの免逸検定法を提
供することである。

問題点を解決するための手段 本発明によれば、一般式（）： （式中、ｎは３〜13の整数でありかつＲは水素原
子又はメタル基である）で示される２−クロロ−
４−（イソプロピルアミノ）−６−（アミノカプロ
ン酸）−ｓ−トリアジン誘導体が提供される。

更に、アトラジンを検定するためにポリスチレ
ンELISAに直接的に結合することのできるリシ
ン富有蛋白質に結合したハプテンが提供される。

発明の背影として、ハプテンはそれ自体では小
さすぎ、又は若干の別の理由のために、免疫反応
を惹起し得ない分子である。従つて、これらの小
さな又は非免疫性分子は大きな蛋白質に結合させ
る必要があり、その後始めて得られた物質を、最
終的に抗体を形成する動物に注射することができ
る。一般に、1000ダルトン未満の分子量を有する
分子は坦持蛋白質に結合する必要がある。それら
の側鎖に結合された物質を有する蛋白質は、“結
合蛋白質”と称される。側基と蛋白質は一緒に、
抗原反応を決定する結合化合物を形成する。作用
性は蛋白質と反応するハプテンの分子上に存在す
ることが重要である。付加的に、もちろん別の類
似した化合物、特に有するとしても僅かな除草作
用又はその他の好ましくない効果を有する類似し
たヒドロキシアトラジンの存在に反応することな
くアトラジンに対して特異性を有するべきであ
る。

結合のため選択される有利なハプテンは、２−
クロロ−４−（イソプロピルアミノ）−６−（アミ
ノカプロン酸）−ｓ−トリアジンである。この化
合物は動物の免疫学機構又は適当な抗体形成細胞
系統による検出のために２位に露出された塩素と
４位又は６位にアミノ基との両者を有する。他面
では、ハプテンのアミノカプロン酸蛋白質はアト
ラジンのアミノエチルか又はアミノイソプロピル
基を置換しかつ蛋白質に結合するための位置にな
る。塩素は２位に暴露されて残留しなければなら
ないが、ハプテンは相当する機構、例えば生きて
いる動物又は細胞系統による検出のために暴露さ
れる別のアミノ基を残して、４位のアミノエチル
基又は６位のアミノイソプロピル基で結合するこ
とができる。同様に、アミノカプロン酸を除いた
別のアミノ酸を、アトラジン分子のエチルアミン
又はイソプロピルアミノ分を誘導するために使用
することができる。詳言すれば、例として、最小
４個の炭素原子から無効果である程に不溶性にな
る点、すなわち12〜15個の炭素原子を有する任意
の直鎖状アミノ酸は、ハプテンのアミノエチル又
はアミノイソプロピル基に対する置換基として有
効であり、従つて蛋白質に結合するための座を提
供する。

次に前記に定義したハプテンを製造しかつ結合
する手順を詳細に示す以下の実施例により本発明
を詳細に説明する。

実施例 塩化シアヌル9.22ｇ（0.05モル）を撹拌しなが
らトルエン100ml中に溶かした。これに
NaOH0.06モルを30％の溶液（８ml）として加
え、引続きイソプロピルアミン３ｇ（0.05モル）
を70％の水溶液として加えた。PH値を11〜12に維
持しかつ該混合物を室温で１時間撹拌した。次い
で、撹拌した反応混合物にNaOH溶液（水10ml
中２ｇ）中に溶かしたアミノカプロン酸6.56ｇ
（0.05モル）を加えた。PH値をチエツクしかつ11
〜12に調整しかつ30％のNaOHを加えることに
よつて１時間維持し、次いで該混合物を室温で１
晩撹拌した。トルエンを回転蒸発器で減圧下に除
去した。この残留分を水50mlを加えることによつ
て溶かしかつHCIでPH３に調整した。沈殿した酸
性材料をブフナーろうと上で真空で濾別しかつ塩
化ナトリウムを除去するために水で十分に洗浄し
た。この沈殿物をろうと上で真空を適用して数時
間乾燥させた。粗収量＝13.5ｇ（90％） 該粗製化合物２ｇを酢酸エチル中に回収しかつ
シリカゲルカラム（2.5×60cm）上に置きかつ酢
酸エチル：ヘキサン（80：20）で溶離した。20ml
のボイド容量後に、フラクシヨン50mlを捕集し
た。フラクシヨン１〜４を合しかつ蒸発器上で減
圧下に蒸発乾固した。固体残留物をクロロホルム
から２回及びアセトンから１回再結晶させた。再
結晶した物質（融点165〜166℃）の収量0.90ｇ
（45％） 薄層クロマトグラフイーをシリカゲル
（CF254）で実施しかつ酢酸エチル：ヘキサン
（80：20）で展開しかつＵ。Ｖ。及びヨウ素で可
視化した際にR_f＝0.65で単一スポツトを呈した。
赤外線スペクトルは所望の化合物と一致した。該
化合物の元素分析により、以下の結果が得られ
た：C47.89％、H6.89％、N22.97％及びCI11.89
％（理論値：C47.76％、H6.68％、N23.12％及び
CI11.75％）。

次いで、得られた化合物をウシの血清アルブミ
ン及びオバルブミンに対して混合無水物法で結合
させた。しかしながら、ウシの血清アルブミン又
はオバルブミンの代りに、別の普通のリシン富有
蛋白質を使用することもできる。結合度は蛋白質
1M当りハプテン10Mであつた。ハプテンを蛋白
質に結合させるためには、ハプテンの溶解性は強
塩性水溶液以外のいかなるものにおいても極めて
低いために、混合無水物法を使用した。他の方法
は水溶液中でのより低いPHでは、結合が起る前に
蛋白質溶液から物質を沈殿させる傾向を示した。

前記のハプテン150mg（0.5ミリモル）を乾燥
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド７ml中に溶かし
た。この溶液にトリ−ｎ−ブチルアミン0.240ml
（1.0ミリモル）を加えかつ該溶液を密栓したチユ
ーブ内で５〜10℃に冷却した。この混合物にイソ
ブチルクロロホルメート0.066ml（0.5ミリモル）
を加えかつ５〜10℃（氷冷）で30分間反応を進行
させ、次いでウシの血清アルブミン１ｇ（0.0165
ミリモル）、水3.6ml、1N NaOH1ml及びＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド20mlの撹拌し、冷却した
溶液に１度で加え、30分間撹拌を継続した。次い
で、1N NaOH1.8mlを加えかつ反応期間中PH値
を８に維持して１晩撹拌しながら室温にした。こ
の溶液を流動水に対して72時間透析しかつ1N
HCIでPH4.5に調整した。得られた沈殿物を数時
間放置し、遠心分離によつて捕集しかつ冷いアセ
トンで洗浄した。沈殿物を水中に懸濁させかつPH
7.8になるまで1N NaOHを添加することにより
再溶解した。該物質を流動水に対して８時間透析
しかつ凍結乾燥した。収量＝900mg。１個の蛋白
質に対して10個のハプテンが結合されたと推定さ
れる。この同じハプテンを同じ方法によつてオバ
ルブミンに結合させた。

また、ハプテンのチロシンメチルエステル結合
体を製造しかつI¹²⁵で放射性ヨウ素化した。

乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド0.450ml中
のハプテン15mg（0.05ミリモル）にトリ−ｎ−ブ
チルアミン0.024ml（0.01モル）を加えかつ該溶
液を氷冷した。この溶液にイソブチルクロロホル
メート0.007ml（0.05ミリモル）を加えかつ氷浴
中で30分間反応させ、次いで50％の水−ジメチル
ホルムアミド３ml及び1N NaOH0.065ml中のチ
ロシンメチルエステルHCI10mg（0.05ミリモル）
の冷い溶液に加えた。氷中での撹拌を継続しかつ
該溶液を１晩で室温に到達させ、次いで氷水10ml
で希釈した。乳白色の溶液を酢酸エチルで抽出し
かつ有機相を分離しかつ希HCIで２回、1N炭酸
ナトリウムで１回、次いで水で洗浄した。乾燥し
た溶液を減圧下で蒸発させた。固体残留分を酢酸
エチル中に溶解しかつシリカゲル（GF254、２
mm）上での分取薄層クロマトグラフイーによつて
精製した。該板は酢酸エチル：ヘキサン（80：
20）で展開し、１つのメジヤースポツト（R_f＝
0.48）を示した。これをエーテルで溶離かつ蒸発
させて生成物15mgを得た。

ニユージランド白ウサギにウシの血清アルブミ
ンに結合したハプテンを接種し、滴定量が確認さ
れるまで、予め決定した間隔で増強しかつ週に１
度採血した。もちろん、ウサギの代りに、抗体を
形成させるために適当な任意の動物を使用するこ
とができる。実際、抗体形成細胞系統でも、抗体
形成のためには完全に満足することができる。

滴定量はチロシンメチルエステル結合体を使用
した放射性免疫検及びオバルブミン結合ハプテン
を使用した酵素結合免疫吸収体によつて測定し
た。両者の方法は、約８週間及び４回の増強度に
アトラジンに対する高度の検出度を示した。アト
ラジンはオバルブミン結合したハプテンの必要性
を排除するポリスチレンELISA板に対して直接
的に結合させることができることが判明した。ア
トラジンの若干の先駆物質、代謝産物及び分解生
成物について架橋反応に関して調査した。少しで
も反応性が見出された場合には、血清を本発明の
背影となつた化合物を使用してCNBr活性化スー
パーローズ（superose）4Bカラム上で洗浄した。
既知量のアトラジンを含有する土壌試料を種々の
方法で抽出しかつELISAによつて調査した。検
定は土壌タイプで変動することがあるが、ウエル
ドΓシルトΓローム（Weld Silt Ioam）におけ
る実験室条件下では、十億部当り数部の範囲のア
トラジンを検出することが可能であつた。

抗原が形成されると、該抗原は特異性を分析す
るためだけではなく、付加的に実地においてこの
特異性を利用するための技術を開発するためにも
必要である。若干の形式の検定法を使用すること
ができる。放射性免疫検定は例えばハプテンは抗
原として機能することができる任意の物質を測定
するために使用することができる。放射性免疫検
定は、放射性同位元素、この場合には放射性ヨウ
化したチロシンメチルエステルを使用する拮抗的
結合試験である。この検定法はナノグラムレベル
（１×10^-9ｇ）に至るまで極めて高感度であるが、
但し当該の放射性材料を使用するためには特別の
免許を必要とする。農業者は放射性免疫検定によ
つて得られうるほどの精度を必要としないが、該
方法が開発されることにより、同程度の精度で検
出する別の実験室法よりも、多数の試験を実施す
る際により廉価になる。

酵素結合免疫吸収体分析法は当該分野、又は少
なくとも設備の悪い実験室において極めて前途有
望である。本方法を実施するには、最小の装置が
必要であり、かつ該技術が完成されたことによ
り、実施するに当つて熟練した技術者又は特殊な
安全手段を必要としない。分析用基剤は、非選択
的に多くの有機物質を結合するポリスチレンウエ
ルである。該ウエルに、呈色反応がアトラジンの
存在量を表示するまで、種々の層を“サンドウイ
ツチ”形式で入れる。その際、極めて廉価に試料
内に存在するアトラジンの量を測定するために、
廉価な光学読取器を使用することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式（）： （式中、ｎは３〜13の整数でありかつＲは水素原
   子又はメタル基である）で示される２−クロロ−
   ４−（イソプロピルアミノ）−６−（アミノカプロ
   ン酸）−ｓ−トリアジン誘導体。 ２ 式中のｎが５である、特許請求の範囲第１
   項記載の化合物。 ３ Ｒがメチル基である、特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の化合物。