JPH0338830B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 (a) 産業上の利用分野 本発明は細胞を培養増殖させるための装置に関
するものである。更に詳しくは細胞をサスペンジ
ヨン状態で培養するための装置に関するものであ
る。

細胞培養技術は、例えばウイルス、ワクチン、
インターフエロンの如き抗ウイルス剤或いはホル
モンの如き生物薬品の製造にとつて重要である。
更に近年特定タンパク質などを標的とするモノク
ローナル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマ
によるハイブリドーマの培養によるものであり、
その技術の解決は工業的に重要なテーマである。

(b) 従来技術 従来、細胞培養は一般にシヤーレ試験管、培養
びんなどを用いて実験室的規模で行なわれてい
る。

一方近年細胞の培養法及びそのための装置とし
て、いくつかの提案がなされている。これらの提
案は、大きく分けて付着培養（anchorage depen
−dent culture）と浮遊培養、つまりサスペンジ
ヨン培養（suspension culture）との２つの方式
に分類されるが、これらの方式は培養される細胞
の特性によつていずれかに決められる。

このうちサスペンジヨン培養に関して下記の提
案がなされている。例えばマグネテイツクスター
ラーもしくは機械的に駆動されるシヤフト上の羽
根車によつて、スピナーフラスコの中に調整され
た撹拌機内を設けた培養方法が提案されている
（米国特許第2958517号および同第3649465号明細
書参照）。

特開昭57−65180号公報には、回転可能なシヤ
フト上に支持される少なくとも１枚の比較的大表
面積の屈撓性シートを撹拌機とし、該撹拌機を回
転させて該シートを波立たせ、それによつてヒト
の２倍体細胞のような或る種の虚弱細胞に対し所
望の穏やかな撹拌を作り出すサスペンジヨン培養
装置が提案されている。

しかし、上記装置による培養方法においては、
細胞が一定量の栄養分の中で培養されるため細胞
の生長増殖は比較的低い密度で停止する。

細胞のサスペンジヨン培養において、細胞の生
長増殖が比較的低い密度で停止するのを防ぎ、細
胞を大量に且つ高密度で培養するために、一般に
新しい培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物
質を含んだ古い培養液を培養槽外へ排出しながら
培養する方式すなわち通常パーヒユージヨン方式
と言われる方式が提案されている（Annual
Repor−ts of Fermentation Processes，vol.6
参照）。この方式を用いて培養するに当つて重要
なことの１つは、サスペンジヨン液中の生細胞と
前記古い培養液とを効率よく分離し、古い培養液
を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞の生育環
境を最適条件下に維持することである。サスペン
ジヨン液から生細胞と古い培養液とを分離するた
めに種々のフイルターやまた種々の形式が提案さ
れているが、フイルターの目塞りや、装置の構造
の煩雑性などの点で工業的培養装置としてはいず
れも満足すべきものとは言い難い。

特開昭59−82083号公報および特開昭60−9482
号公報には、培養装置内に細胞沈澱管を兼ねた培
養上清排出管と新鮮倍地添加用の導管を設け、該
導管から倍地を添加し同時に上記排出管から培養
上清を排出しつつ培養を行うようにした浮遊細胞
の高濃度培養装置が提案されている。

一般に、浮遊性の動物細胞は数ミクロンないし
数10ミクロンと小さくしかもその比重は培地の比
重と大きな差がないため、浮遊細胞と培地とを重
力によつて分離する上記の如き装置では、細胞沈
降を有利に達成するために沈降面積を大きくする
必要があるが上記２件の特開昭に開示された装置
では沈降面積をあまり大きくとることはできな
い。

(c) 発明の目的 そこで本発明の目的は、簡単な構造でサスペン
ジヨン培養液から生細胞と培養液とを分離するこ
とが可能な装置を提供することにある。

本発明の他の目的は、フイルターなどを使用し
なくとも生細胞と古い培養液とを分離することが
可能な装置および方法、従つてフイルターの目塞
りなどによる問題の発生を解消した装置を提供す
ることにある。

本発明のさらに他の目的は、細胞沈降を有利に
達成するための沈降面積を非常に大きくとること
のできる工業的に有利なサスペンジヨン培養のた
めの装置を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、サスペンジヨン培養
においてしばしば問題となる死細胞およびその破
壊片を培養槽外へ容易に除去可能な装置を提供す
ることにある。

本発明の更に他の目的は、細胞の大量且つ同密
度の培養に適したパーヒユージヨン方式による工
業的装置を提供することにある。

更に他の目的および利点は、以下の説明から明
らかとなるであろう。

(d) 発明の構成および効果 すなわち、本発明者の研究によれば、前記した
本発明の目的および利点は、培養ユニツトの少な
くとも２個を含み、培養液の供給口を有するサス
ペンジヨン培養のための細胞培養装置であつて、
該培養ユニツトは細胞のサスペンジヨン培養ゾー
ン、細胞のセトリングゾーンおよび該セトリング
ゾーンの上部からの培養液の排出口よりなり、該
培養ユニツトにおいて該サスペンジヨン培養ゾー
ンと該セトリングゾーンとは該セトリングゾーン
の下方部位を通じて連絡するように仕切りによつ
て仕切られており、該セトリングゾーンは該培養
ユニツトの外側壁と該仕切りの間に形成されてい
る構造を有し、各培養ユニツトは培養液の流通が
許容し得るように縦方向に重ねられていることを
特徴とする細胞培養装置によつて達成される。

かかる本発明の細胞培養装置は、培養ユニツト
の２個以上、好ましくは２〜10、特に好ましくは
２〜５個が縦方向に培養液が流通し得るように重
ねられた構造を有している。そしてこの培養ユニ
ツトは細胞のサスペンジヨン培養ゾーン、細胞の
セトリングゾーンおよび該セトリングゾーンの上
部からの培養液の排出口よりなり、該培養ユニツ
トにおいて該サスペンジヨン培養ゾーンと該セト
リングゾーンとは該セトリングゾーンの下方部位
を通じて連絡するように仕切りによつて仕切られ
ており、該セトリングゾーンは該培養ユニツトの
外側壁と該仕切りの間に形成されている構造を有
している。

かかる本発明の培養装置では、培養ユニツトに
設置されたセトリングゾーンにおいて、生細胞は
重力方向の下部へ沈降し、古い培養液や細胞破壊
片などはセトリングゾーンの上部に分離されるこ
とになるのでセトリングゾーンの上部に設けられ
た培養液の排出口から生細胞を実質的に含まない
培養液を排出することができる。また本発明の装
置は培養ユニツトを２個以上任意に重ねて構成さ
れているので、培養の実質容積に対し、比較的大
きいセトリングゾーンの容積を設置することが容
易であり、また必要により培養ユニツトを増減し
て培養規模を変化させることができる。

さらに本発明は、目塞りの原因となるフイルタ
ーを使用することなく、簡単な方式によつて生細
胞と培養液を効率よく分離することを可能とする
ので、細胞の大量且つ同密度培養に有利に適用す
ることができる。

本発明の培養装置における培養ユニツトは、細
胞をサスペンドさせて実質的な細胞培養を実施す
る区域と規定できる細胞のサスペンジヨン培養ゾ
ーンおよび細胞を重力によつて培養液から分離す
る区域と規定できる細胞のセトリングゾーンを有
している。細胞のサスペンジヨン培養ゾーンと細
胞のセトリングゾーンとは、細胞培養槽内におい
て該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡す
るように仕切りによつて仕切られている。このよ
うな構造を有するため、細胞のセトリングゾーン
において、沈降してそして培養液から分離された
細胞は該セトリングゾーンの下方部位を通じて細
胞のサスペンジヨン培養ゾーンに再び導入され、
その区域で再び培養される。

本発明の装置において、培養槽内の該セトリン
グゾーンは、該培養装置の外側壁と上記仕切りの
間に形成されている。このような構造によつて、
培養装置内でセトリングゾーンの有効なセトリン
グ容積を比較的大きくとることのできる利点があ
る。

本発明の装置は、各培養ユニツトのセトリング
ゾーンにおいて細胞と分離された古い培養液を排
出するための培養液排出口および培養装置へ新し
い培養液を供給するための培養液供給口を上記培
養装置の任意の個所に１個所以上有している。か
かる供給口は装置内の上部に設けることが望まし
い。

本発明の培養ユニツトにおいて、該セトリング
ゾーンは、好ましくは、該サスペンジヨン培養ゾ
ーンの周囲に該サスペンジヨン培養ゾーンを取囲
むように装置側壁と該仕切りとの間に形成されて
いる。この好ましい態様において、例えば該サス
ペンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンは円
筒状仕切りによつて仕切られている。この場合、
さらに好ましくは、該円筒状仕切りと対向する側
壁の実質的部分が円筒状であり、そして上記円筒
状仕切りと上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に
位置している。

また、本発明の培養ユニツトは、セトリングゾ
ーンにおける細胞のセトリングを助長するため、
セトリングゾーン内に細胞のセトリングを助長す
る手段を有することができる。その様な手段は、
細胞が沈降する重力方向の距離を短くするような
手段であり、例えば重力方向を遮ぎる方向にセト
リングゾーン内に設けられた沈降板であることが
できる。

さらに、セトリングゾーン中には、細胞のサス
ペンジヨン培養ゾーン中に形成される培養液の流
動の影響を可及的に小さくする目的で、重力方向
に伸びてセトリングゾーンを仕切るじやま板を設
けることもできる。重力方向に角度を有してセト
リングゾーン内に設けられたじやま板は沈降板と
しての機能を発揮することは容易に理解されよ
う。

本発明の培養装置は、細胞のサスペンジヨン培
養ゾーン中の培養液を強制的に流動させるための
手段を備えることができる。そのような手段は、
例えば培養液中に細胞を強制的にサスペンドさせ
るための機械的撹拌手段であることができる。ま
た、培養装置に、酸素含有ガス導入口、または酸
素含有ガス導入口と酸素含有ガス案内筒を設け、
該導入口から導入された酸素含有ガスが上昇する
際の撹拌効果により培養ゾーン中に細胞を強制的
にサスペンドさせることもできる。

本発明の細胞培養装置はサスペンジヨン型の細
胞培養に適用されるが、サスペンジヨン型とは、
水性媒体中で細胞それ自体が浮遊しながら、或い
は細胞を微少担体（マイクロキヤリアー）に担持
して浮遊しながら、またマイクロカプセル中で細
胞が生育されるような種々の浮遊培養をいう。殊
に本発明は、細胞自体を浮遊させながら培養する
方式に有利に用いられる。

本発明の細胞培養装置において培養される細胞
は、植物細胞、動物細胞、微生物細胞などであつ
てもよく、また人為的或いは遺伝子操作により変
性された細胞例えばハイブリドーマであつてもよ
い。殊に本発明の培養装置は、動物細胞の培養に
適している。

本発明におけるサスペンジヨン型の細胞培養装
置中においては、培養しようとする細胞が培養液
中に浮遊した状態で培養される。培養液は実質的
に水よりなる水性媒体に、種々の無機塩、ビタミ
ン類、捕酵素、ブドウ糖、アミノ酸、抗生物質な
どの通常細胞培養に使用される添加成分が加えら
れている。また培養液には血清を加えることもで
きるし、血清を用いない所謂無血清培地を培養液
として使用することもできる。

本発明の培養装置を用いて細胞を潅流培養する
場合には、セトリングゾーンから細胞を実質的に
含まない培養液を抜出しそして培養装置へ新しい
培養液を導入することによつて有利に実施され
る。

その際、各培養ユニツトにおけるセトリングゾ
ーンによつて規定される細胞の有効セトリング面
積［Ｓ（cm²）］と、サスペンジヨン培養ゾーン内の
培養液の堆積［Ｖ（cm³）との比Ｖ／Ｓが好ましく
は0.1〜500cm、特に好ましくは１〜100cmの範囲
にある。

以下本発明の装置について図面により更に詳細
に説明する。

先ず添付した図１〜図３により本発明を説明す
ると、図１〜図３はいずれもそれぞれ本発明の装
置の概略図の一例を示したものである。

図１において培養装置本体５にはその内壁の内
側に隔壁６によつて仕切られたセトリングゾーン
７が設けられている。培養装置５には新しい培養
液の供給導管１を通じて培養液の供給口が備えら
れ、導管３を通じて酸素または酸素含有ガスが供
給されるようになつており、また排ガスの排出導
管４が設けられている。さらにセトリングゾーン
７の上部には古い培養液の排出口が設けられ、導
管２−１〜２−４を通じて培養装置外へ培養液を
排出するようになつている。

本発明の装置でいう培養ユニツトとは図１にお
いては、培養装置の縦長方向に直角断面を切つた
時に、培養液の排出口２−１から２−２までの占
める区域を１つの培養ユニツトということができ
る。図１においては４つの培養ユニツトを包含し
ている。

図１は培養装置５中に撹拌装置８が設置され、
それを回転させることによつて、細胞がサスペン
ジヨン状態に維持されている。

一方図２において、１〜８は図１と同じ機能を
持つた手段および装置を意味する。図１と異なる
のは、培養槽１の中に案内筒９が設けられ、その
案内筒９の下部に酸素または酸素含有ガスを導管
３を介して供給するようになつている点である。
粉の案内筒９の下部に酸素または酸素含有ガスを
供給することによつてサスペンジヨン液は案内筒
９の内部を下部から上部へ上昇し、案内筒９の外
側では逆に上部から下部へとサスペンジヨン液の
移動が起り、全体としてサスペンジヨン液の撹拌
が行なわれる。

図３には、培養槽にフルオロカーボンに溶解さ
せて酸素を導入する装置の縦断面の概略図が示さ
れている。図３の装置は、図１の装置等に較べる
とフルオロカーボン導入口３−１から酸素を溶解
されたフルオロカーボンが導入され、下方へ落下
する間に培養液と接触して培養液に酸素を供給
し、その後培養槽の下方に貯まり、フルオロカー
ボン排出口４−１から排出される。なお図３にお
いて、３−１および４−１を除いて１〜８は図１
と同じ手段および装置を意味している。

上記図１〜図３において、いずれも培養装置の
内壁の内側に隔壁６によつて仕切られたセトリン
グゾーン７が設けられていて、そのセトリングゾ
ーンにはサスペンジヨン液の撹拌効果は実質的に
及ばないようになつている。セトリングゾーン７
の内部では、細胞が重力方向へ沈降し、細胞を実
質的に含まない生育阻害物質を含む古い培養液が
上部に存在するように設計されている。

セトリングゾーンは、その中における培養液の
線速度が、細胞の沈降速度よりも遅く且つ培養槽
内のサスペンジヨン液の撹拌が及ばない領域が確
保されていればよく、その形状および構造に限定
を受けない。

図１〜図３の装置は、セトリングゾーン７とサ
スペンジヨン培養ゾーンとが円筒状隔壁６によつ
て仕切られており、該円筒状隔壁６と対向する槽
側壁の実施的部分が円筒状であり、そして上記円
筒状隔壁と上記円筒状槽側壁とが実質的に同心に
位置しているものである。

粉の装置における各培養ユニツトにおいて、
Ｖ／Ｓ（ここで、Ｖはサスペンジヨン培養ゾーン
内の培養液の体積であり、Ｓは細胞の有効なセト
リング面積である）を算出する基礎となるＳは下
記式で表わされる。

Ｓ＝π／４（D²−d²） ここで、Ｄは円筒状槽側壁部の直径であり、ｄ
は円筒状隔壁６の直径である。また、Ｖは培養槽
の容積から、培養液の存在しない空間部の体積と
セトリングゾーンの容量とを差し引いた体積と理
解されるべきである。

さらに培養装置には、酸素、二酸化炭素や栄養
素の濃度、PHの値を測定し、それらを或る範囲に
維持する装置が一般に設置されているが、本発明
の細胞培養装置にもこれらの装置が備えられても
よいことは言うまでもない。しかし添付図面には
これらの付属装置は省略されている。

本発明の装置を用いて培養を実施するに当つ
て、新しい培養液は、この中にブドウ糖、蛋白質
の如き栄養源、種々のアミノ酸、無機塩、抗生物
質などの細胞培養に必要な成分を水溶液として含
むものが使用されるが、更に血清を含んでいても
よく、また含んでいなくてもよい。

かかる新しい培養液は、サスペンジヨン培養装
置への培養液供給口１から、例えば図１〜図３に
示すように培養装置の上部に設けられた培養液供
給口１から供給される。またサスペンジヨン液中
へ直接導管を通じて供給してもよい。

また本発明の装置を用いて培養を実施するに当
つて、新しい培養液の供給と、古い培養液の排出
とは、培養装置中の液面の水準がほぼ一定となる
ように維持することが望ましいが、必ずしもその
必要はない。新しい培養液の供給と古い培養液の
排出とは、それぞれ独立して、連続的に行うこと
もできまた間歇的に行うこともできる。

またサスペンジヨン液中の酸素濃度を一定に維
持するために、酸素を供給する方法としては、図
１および図２の如く、サスペンジヨン液中の酸素
または酸素含有ガスを直接供給してもよく、また
他の供給手段によつてもよい。他の供給手段とし
ては、図３の如く例えば酸素キヤリアーを用いる
方法である。酸素キヤリアーとしては、水と実質
的に混合しないで酸素を溶解し得る液状の化合物
が使用され、その例としては、人工血液の素材と
して使用されるような種々のフルオロカーボンが
挙げられる。かようなフロオロカーボンを酸素供
給手段として使用する場合には、酸素を溶解させ
たフルオロカーボンをサスペンジヨン液中の上部
から液滴状または薄膜状で添加すればよい。

撹拌方法としては、図１の示した撹拌翼の回転
による如き機械的撹拌方法、また図２に示した案
内筒を用いたドラフト効果による方法、この他図
３に示した如き酸素を溶解した酸素キヤリアーを
用いることにより酸素供給と撹拌を同時に行なう
方法などが挙げられる。もちろんこれら撹拌手段
を２つ以上併用することもできる。

また培養を実施するに当つては、培養槽の有効
培養容積（Ｖ）に対して新しい培養液を供給する
割合（新しい培養液の供給量／Ｖ）は１日当り
0.2〜10、好ましくは0.5〜５の範囲とするのが適
当である。

かくして本発明の装置は、細胞のサスペンジヨ
ン培養において、生細胞を含まない古い培養液を
簡単に分離することができ、また細胞破壊片も古
い培養液と共にサスペンジヨン液から除去でき
る。また本発明の装置は構造が簡単であり、その
操作が煩雑でなく工業的装置として適している。
殊に細胞の大量培養、高密度培養に有利である。

【図面の簡単な説明】

図１〜図３は、いずれも本発明の培養装置の概
略図の一例を示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 培養ユニツトの少なくとも２個を含み、培養
   液の供給口を有するサスペンジヨン培養のための
   細胞培養装置であつて、該ユニツトは細胞のサス
   ペンジヨン培養ゾーン、細胞のセトリングゾーン
   および該セトリングゾーンの上部からの培養液の
   排出口よりなり、該培養ユニツトにおいて該サス
   ペンジヨン培養ゾーンと該セトリングゾーンとは
   該セトリングゾーンの下方部位を通じて連絡する
   ように仕切りによつて仕切られており、該セトリ
   ングゾーンは該培養ユニツトの外側壁と該仕切り
   の間に形成されている構造を有し、各培養ユニツ
   トは、培養液の流通が許容し得るように縦方向に
   重ねられていることを特徴とする細胞培養装置。