JPH0339520B2 - - Google Patents
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- JPH0339520B2 JPH0339520B2 JP58230593A JP23059383A JPH0339520B2 JP H0339520 B2 JPH0339520 B2 JP H0339520B2 JP 58230593 A JP58230593 A JP 58230593A JP 23059383 A JP23059383 A JP 23059383A JP H0339520 B2 JPH0339520 B2 JP H0339520B2
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Description
本発明は、新規カルシトニン及びその採取法に
関し、更に詳しくは、トリ鰓後体由来の、血中カ
ルシウム濃度の低下させる生理活性を有する新規
カルシトニン及びその採取法に関する。 カルシトニン（以下「CT」と称する）は、鳥
類、魚類、円口類などの鰓後体、哺乳類などの甲
状腺に存在するカルシウムの代謝に関与するペプ
チドホルモンである。一般に、32個のアミノ酸よ
りなる単鎖のポリペプチドで、１番目と７番目の
アミノ酸がジスルフイド結合をし、カルボキシル
基末端がプロリンアミドである。現在までのとこ
ろ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒト、ラツト、サケ、
ウナギからCTが抽出精製され、動物種により異
なるペプチド構造が明らかにされている。トリで
は、前記生理活性を示す粗分画より、近似的なア
ミノ酸組成が推定されてはいるが（A.Nieto et
al.、Biochim.Biophy.Acta、322、383（1973））、
未だアミノ酸組成とアミノ酸配列は明らかでな
い。 そこで、本発明者らは、CTが動物種により異
なるペプチド構造を有すること、及び、鰓後体か
ら抽出されるカルシトニンの生理活性が概して高
値を示すことに着眼し、ニワトリ鰓後体からCT
を抽出精製し、新規CTの構造を明らかにするこ
とを目的とし、鋭意研究を行なつた結果、ニワト
リ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、特定の処理
を施こすことにより、新規CTを単離できること
を見い出すとともに、その構造を設定することに
成功し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は、 次式（）： （式中、Cysはシステインを、Serはセリンを、
Aspはアスパラギン酸を、Leuはロイシンを、
Thrはスレオニンを、Valはバリンを、Glyはグ
リシンを、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジンを、
Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはア
ルギニンを、Alaはアラニンを表わす。） で示される新規CT及びその塩； 並びに、 トリ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、 次の処理(a)〜(d)： (a) 目的物含有水溶液に親水性有機溶媒を添加し
て高分子量体を沈澱せしめ除去する (b) カチオン交換樹脂を用いて塩基性画分を回収
する (c) ゲルクロマトグラフイーにより分子量3000〜
4000の画分を回収する (d) 高速液体クロマトグラフイーによりCT様生
理活性を有する画分を回収する のうち、少なくとも１種の処理を施すことを特徴
とする前記式（）で示される新規CT又はその
塩の採取法に関するものである。 以下、本発明について詳細に説明する。 先ず、本発明に係る血中カルシウム濃度を低下
させる生理活性を有する新規CTの化学的性質は
次の如くである。 物質の性状：白色粉末 溶媒に対する溶解性：水、特に、酸性水溶液
に可溶、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼ
ン、ヘシサンなどに不溶 分子量：3370.7 塩基性度：サケCT＞本発明のCT＞ウナギ
CT 一次構造式：前記式（） 免疫学的性質：抗ウナギCT血清及び抗サケ
CT血清を用いて、本発明のCTが前記抗血清
と交差することを利用して検出し得るCT。 生物活性：3000〜6000MRCU／mg（生物活
性測定法） 被検体を１％酢酸ナトリウク（PH4.0；0.1％
牛血清アルブミン含有）溶液を用いて適当に希
釈後、更に希釈した液数種を雄幼若ラツト
（100ｇ前後）１匹当り0.1mlを尾静脈に注射し、
注射１時間後に心臓より血液を採取し、遠心分
離して血清を採取し、血清中のカルシウム濃度
を分光学的方法（試薬；ワコーカルシウム測定
用キツト）にて測定し、Ca2+濃度を10％低下
させるのに必要な量を10ｍMRC（Medical
Research Council）Ｕと定義する。 薬効持続時間 本発明のCT＞ウナギCT＞サ
ケCT （測定法） 20ｍMRCU相当のCT溶液をラツ
トに静注し、血清中Ca2+濃度の経時変化を測定
した。 本発明のCTは、新規ポリペプチドであり、従
来から知られている各種動物由来のCTとは全く
異なる構造を有する。本発明のCTの生物活性は
約5000MRCU／mgであり、ウナギCTやサケCT
のそれと同等もしくはそれ以上を示し、ヒト
CTやラツトCTのそれに比し100倍以上、ウシCT
やブタCTのそれに比し10倍以上を示す。更に、
ペプチド医薬品として重要な要素である薬効持続
時間は生物活性の高いウナギCTやサケCTのそ
れよりも、本発明のCTのそれの方が長く、本発
明のCTが医薬品として生物活性及び薬効の点か
らポテンシヤルが高いことが示された。従つて、
この新規なCTは、Ca代謝において極めて重要な
役割を演じているホルモンであり、医薬品として
有用であると考えられる。即ち、CTは強力な骨
吸収抑制作用を有することから、高Ca血症、骨
ページエツト病、骨粗鬆症の治療、胃酸分泌及び
膵液分泌抑制作用を有することから、消化性潰
瘍、急性膵炎に対する効果、抗炎症作用を有する
ことから慢性関節リウマチに対する効果など広範
な薬効が期待されている。更に、CTを臨床応用
した例として、上記の他、悪性腫瘍の骨転移、腎
性骨異栄養症、骨折、強皮症などがあり、今後作
用機作の解明と共に、CTの応用範囲が広がるも
のと考えられる（フアルマシア、19、187
（1983））。 次に、本発明のCTの採取法について詳細に説
明する。 抽出原料としては、一般にはニワトリの鰓後体
を用いる。鰓後体は孵化前後からその存在が認め
られ、甲状腺及び上皮小体の下方において総頚動
脈に隣接し、成鶏では直径１mm程度の球状の臓器
である。ニワトリの週令により、鰓後体の重量、
CT含量は変化する。大量・均質なニワトリが入
手可能なこと、鰓後体が適度な大きさであり摘出
が容易なことなどを考慮すると、ニワトリとして
は、ブロイラー種６〜80週令のものを用いること
が好ましい。 出発原料からのCTの抽出は、次のようにして
行なうことができる。 例えば、出発原料をその約５〜10倍量（重量
比）の酸性水溶液、好ましくは、揮発性の酸性水
溶液（例えば、酢酸、ギ酸などの水溶液）中で破
砕・混和し、ニワトリCTの懸濁溶液を得る。こ
の場合、用いる酸性水溶液は、PH１〜５であるこ
とが好ましい、次いで、この溶液を遠心すること
により、中間層にやや透明なCT抽出液が形成さ
れる。ここで、沈澱物は、主に鰓後体の組織片及
び不溶物であり、上層部は、主に脂肪の白色のか
たまりである。中間層を採取し、次の処理工程に
供する。 以上のようにして得られる抽出物の精製は、前
述の処理(a)〜(d)のいずれか一つの方法により行な
うことができるが、二つ以上を組み合わせること
が好ましい。 処理(a)においては、本発明のCT（分子量
3370.7）を沈澱させず、それ以上の高分子量体を
沈澱させるに足る充分量の親水性有機溶媒（例え
ば、低級アルコール、アセトンなど）を前記抽出
液に添加して、高分子量体を除去する。 処理(b)においては、抽出液又はその処理液をカ
チオン交換クロマトグラフイーに付して、塩基性
画分を回収する。該クロマトグラフイーは、好ま
しくは水溶媒にて行なわれるが、低級アルコー
ル、アセトンの如き親水性有機溶媒の添加された
水溶液においても行なうことができる。溶離液
は、通常、約PH７〜13の塩基性溶液、例えばピリ
ジン及びこれを主成分とする塩基性溶液と約２〜
７の範囲のPHを有するもの、例えばピリジン−酢
酸、酢酸、ギ酸、塩酸及びこれらを主成分とする
酸性溶液である。 用いるカチオン交換樹脂としては、例えばカル
ボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセフ
アデツクス及びSP−セフアデツクスなどが挙げ
られる。 処理(c)のゲルクロマトグラフイーは、例えば酢
酸、炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウムの
如き揮発性緩衝液中で行なうことが好ましい。カ
ラムの例としては、Bio−gel PIO及びセフアデ
ツクスG50が挙げられる。 処理(d)の高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）は、常法に従つて行なうことができ、
ギ酸アンモニウム（10ｍＭ〜1.0M）−アセトニト
リル、水−アセトニトリル−10％トリフルオロ酢
酸（TFA）（90：10：１〜40：60：１）などの溶
媒を用いて直線型濃度勾配溶出し、カルシトニン
様生理活性を有する画分を回収する。 以上の各精製工程における各画分の検定は、抗
ウナギCT血清が本発明のCTの交差反応すること
を利用して、放射性免疫検定法を用い、適宜、生
物性測定法を併用した。 放射性免疫検定法では、抗原であるウナギCT
を用いて、ウナギに数回免疫し、免疫後、採血し
て抗血清を得る。ここで、本放射性免疫検定法と
は、ウナギCTの抗体（抗血清）に対し、本発明
のCTと放射線標識抗原との競争反応により本発
明のCT量を検出する方法である。一方、標識抗
原は、ウナギCTのチロシン部分に放射性ヨウ素
（ 125）を結合するクロラミンＴ法により作製
できる。次に、本発明のCT抽出液又は各工程の
各画分（被検体）を適宜希釈した数種の溶液と前
記で得られた抗ウナギCT血清とを良く反応させ
（４℃、１夜）、この上清液中に含まれる抗体と結
合していない 125−ウナギCTの量をγ−カウ
ンターで測定することにより、被検体中に含まれ
る相対的なCT活性が求められる。この放射性免
疫検定法によれば、検定によつて消費されるCT
量が生物活性検定法に比し、約1/100に低減され
るばかりか、手技が簡単である、定量性・再現性
が優れている、検定の所要時間が短かい、などの
利点を有し、放射性免疫検定法は本発明における
新規CTの分離・精製を容易、かつ、迅速ならし
めることができる。 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより制限されるものではな
い。 実施例 １ (A) 出発原料 10週令食肉用ニワトリ（3384匹）を放血し、
直ちに、鰓後体を摘出した。脂肪をできる限り
除去し、ドライアイスで凍結した。得られた鰓
後体は約179.11ｇであつた。 (B) 抽出工程 上記方法で得られた鰓後体を小分けし（約
500匹分）、それぞれについてIN酢酸溶液（鰓
後体重量の５倍量（重量比））に浸漬し、ポリ
トロンでホモジナイズし、遠心分離（9000rpｍ
30分間）した。次に、脂肪を含まないように、
中間層を採取し、この抽出液の一部を凍結乾燥
した。 この凍結乾燥粉末の一部を0.INギ酸に溶解
し、生物活性を測定したところ、1.0〜
1.2MRCU／匹であつた。 (C) 精製工程 前記のようにして得た目的生理活性物質を含
む酢酸水溶液（900ml）にアセトン（1800ml）
を徐々に添加後、一夜放置し、高分子量体を沈
澱させた。遠心分離（9000rpｍ、30分間）後、
上清液を採取した。 この上清液を、SP−セフアデツクスＣ−25を
充填し、IN酢酸溶液で平衡化したカラム（直径
3.2cm×高さ22cm）上に注入した。このとき、酸
性物質は除去され、目的生理活性物質を含む塩基
性物質がSP−セフアデツクスＣ−25にイオン的
に吸着される。次いで、2Mピリジン溶液で溶出
した。この溶出液には、相対的に低いCT活性が
認められた。次いで、2Mピリジン・酢酸溶液
（PH5.0）で溶出した。この溶出液には、相対的に
高いCT活性が認められた。 これ以後の実験では、前記後者の溶出液を用い
た。この溶出液を濃縮し、IN酢酸を添加し、凍
結乾燥した。この凍結乾燥粉末1370mgをIN酢酸
15mlに溶解し、予めセフアデツクスＧ−50
（Fine）を充填し、IN酢酸溶液で平衡化したカラ
ム（直径50cm×高さ130cm）上に、この溶液を注
入した。このとき、溶出条件は溶離液IN酢酸、
溶出速度25ml／ｈであつた。溶出液を15ml／本ず
つ分画採取し、放射性免疫検定法による活性画分
（画分No.50〜57）を回収した。これを凍結乾燥し、
粉末20.8mgを得た。 前記検定法から算出された免疫学的に反応した
本発明のCT量は692μｇ（3384匹相当）であつ
た。 この粉末20.8mgをＡ液（後述）1.5mlに溶解し、
この溶液を以下の測定条件に従いHPLCに付し
た。 測定条件： カラム；東洋曹達工業(株)製TSK GEL CM2 SW
（4.6mmφ×250mm） 流 速；2.0ml／min 差 圧；35Kg／cm2 溶離液；Ａ液（10ｍＭギ酸アンモニウム：アセト
ニトリル＝９：１） Ｂ液（1.0Mギ酸アンモニウム：アセトニトリ
ル＝９：１） をサンプル注入１分後、Ａ液からＢ液へ直線型
濃度勾配溶出 得られた結果において、放射性免疫検定法に基
づく活性と吸光測定法による280nｍにおけるペ
プチド由来の吸光度とが一致した。更に、同様に
以下の条件にて試料を三つに分けてHPLCを繰り
返した。 測定条件： カラム；ケムコ社製Chemcosorb5ODS−Ｈ（4.6
mmφ×250mm） 溶出液；0.5ml／本 流 速；1.0ml／min 差 圧；140Kg／cm2 溶離液；Ａ液（水：アセトニトリル：10％TFA
＝90：10：１） Ｂ液（水：アセトニトリル：10％TFA＝40：
60：１） をサンプル注入８分後、Ａ液からＢ液へ直線型
濃度勾配溶出 その結果、活性画分（No.40）〔保持時間26分
（ブラジエント後）〕にペプチドに基づく強い吸光
度（A280、A210）が認められた。この活性画分を
凍結乾燥して活性粉末106μｇを得た。この粉末
の生物活性は、5300MRCU／mgであつた。 以上のようにして得られた活性粉末のアミノ酸
分析値を表１に示す。 測定法は、活性粉末3.5μｇを6N塩酸を用いて
110℃で22時間加水分解し、脱塩酸後50μの
0.2Nクエン酸緩衝液（PH3.25）に溶解し、全量を
分析に供した。 更に、常法により、主としてエドマン分解し、
公知の蛋白決定法によりアミノ基末端より順次ア
ミノ酸配列が決定され、同時に、カルボキシペプ
チダーゼを用いてカルボキシ基末端が決定され、
前記式（）に示す新規カルシトニンのアミノ酸
配列が決定された。
関し、更に詳しくは、トリ鰓後体由来の、血中カ
ルシウム濃度の低下させる生理活性を有する新規
カルシトニン及びその採取法に関する。 カルシトニン（以下「CT」と称する）は、鳥
類、魚類、円口類などの鰓後体、哺乳類などの甲
状腺に存在するカルシウムの代謝に関与するペプ
チドホルモンである。一般に、32個のアミノ酸よ
りなる単鎖のポリペプチドで、１番目と７番目の
アミノ酸がジスルフイド結合をし、カルボキシル
基末端がプロリンアミドである。現在までのとこ
ろ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヒト、ラツト、サケ、
ウナギからCTが抽出精製され、動物種により異
なるペプチド構造が明らかにされている。トリで
は、前記生理活性を示す粗分画より、近似的なア
ミノ酸組成が推定されてはいるが（A.Nieto et
al.、Biochim.Biophy.Acta、322、383（1973））、
未だアミノ酸組成とアミノ酸配列は明らかでな
い。 そこで、本発明者らは、CTが動物種により異
なるペプチド構造を有すること、及び、鰓後体か
ら抽出されるカルシトニンの生理活性が概して高
値を示すことに着眼し、ニワトリ鰓後体からCT
を抽出精製し、新規CTの構造を明らかにするこ
とを目的とし、鋭意研究を行なつた結果、ニワト
リ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、特定の処理
を施こすことにより、新規CTを単離できること
を見い出すとともに、その構造を設定することに
成功し、本発明を完成するに至つた。 即ち、本発明は、 次式（）： （式中、Cysはシステインを、Serはセリンを、
Aspはアスパラギン酸を、Leuはロイシンを、
Thrはスレオニンを、Valはバリンを、Glyはグ
リシンを、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジンを、
Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはア
ルギニンを、Alaはアラニンを表わす。） で示される新規CT及びその塩； 並びに、 トリ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、 次の処理(a)〜(d)： (a) 目的物含有水溶液に親水性有機溶媒を添加し
て高分子量体を沈澱せしめ除去する (b) カチオン交換樹脂を用いて塩基性画分を回収
する (c) ゲルクロマトグラフイーにより分子量3000〜
4000の画分を回収する (d) 高速液体クロマトグラフイーによりCT様生
理活性を有する画分を回収する のうち、少なくとも１種の処理を施すことを特徴
とする前記式（）で示される新規CT又はその
塩の採取法に関するものである。 以下、本発明について詳細に説明する。 先ず、本発明に係る血中カルシウム濃度を低下
させる生理活性を有する新規CTの化学的性質は
次の如くである。 物質の性状：白色粉末 溶媒に対する溶解性：水、特に、酸性水溶液
に可溶、クロロホルム、四塩化炭素、ベンゼ
ン、ヘシサンなどに不溶 分子量：3370.7 塩基性度：サケCT＞本発明のCT＞ウナギ
CT 一次構造式：前記式（） 免疫学的性質：抗ウナギCT血清及び抗サケ
CT血清を用いて、本発明のCTが前記抗血清
と交差することを利用して検出し得るCT。 生物活性：3000〜6000MRCU／mg（生物活
性測定法） 被検体を１％酢酸ナトリウク（PH4.0；0.1％
牛血清アルブミン含有）溶液を用いて適当に希
釈後、更に希釈した液数種を雄幼若ラツト
（100ｇ前後）１匹当り0.1mlを尾静脈に注射し、
注射１時間後に心臓より血液を採取し、遠心分
離して血清を採取し、血清中のカルシウム濃度
を分光学的方法（試薬；ワコーカルシウム測定
用キツト）にて測定し、Ca2+濃度を10％低下
させるのに必要な量を10ｍMRC（Medical
Research Council）Ｕと定義する。 薬効持続時間 本発明のCT＞ウナギCT＞サ
ケCT （測定法） 20ｍMRCU相当のCT溶液をラツ
トに静注し、血清中Ca2+濃度の経時変化を測定
した。 本発明のCTは、新規ポリペプチドであり、従
来から知られている各種動物由来のCTとは全く
異なる構造を有する。本発明のCTの生物活性は
約5000MRCU／mgであり、ウナギCTやサケCT
のそれと同等もしくはそれ以上を示し、ヒト
CTやラツトCTのそれに比し100倍以上、ウシCT
やブタCTのそれに比し10倍以上を示す。更に、
ペプチド医薬品として重要な要素である薬効持続
時間は生物活性の高いウナギCTやサケCTのそ
れよりも、本発明のCTのそれの方が長く、本発
明のCTが医薬品として生物活性及び薬効の点か
らポテンシヤルが高いことが示された。従つて、
この新規なCTは、Ca代謝において極めて重要な
役割を演じているホルモンであり、医薬品として
有用であると考えられる。即ち、CTは強力な骨
吸収抑制作用を有することから、高Ca血症、骨
ページエツト病、骨粗鬆症の治療、胃酸分泌及び
膵液分泌抑制作用を有することから、消化性潰
瘍、急性膵炎に対する効果、抗炎症作用を有する
ことから慢性関節リウマチに対する効果など広範
な薬効が期待されている。更に、CTを臨床応用
した例として、上記の他、悪性腫瘍の骨転移、腎
性骨異栄養症、骨折、強皮症などがあり、今後作
用機作の解明と共に、CTの応用範囲が広がるも
のと考えられる（フアルマシア、19、187
（1983））。 次に、本発明のCTの採取法について詳細に説
明する。 抽出原料としては、一般にはニワトリの鰓後体
を用いる。鰓後体は孵化前後からその存在が認め
られ、甲状腺及び上皮小体の下方において総頚動
脈に隣接し、成鶏では直径１mm程度の球状の臓器
である。ニワトリの週令により、鰓後体の重量、
CT含量は変化する。大量・均質なニワトリが入
手可能なこと、鰓後体が適度な大きさであり摘出
が容易なことなどを考慮すると、ニワトリとして
は、ブロイラー種６〜80週令のものを用いること
が好ましい。 出発原料からのCTの抽出は、次のようにして
行なうことができる。 例えば、出発原料をその約５〜10倍量（重量
比）の酸性水溶液、好ましくは、揮発性の酸性水
溶液（例えば、酢酸、ギ酸などの水溶液）中で破
砕・混和し、ニワトリCTの懸濁溶液を得る。こ
の場合、用いる酸性水溶液は、PH１〜５であるこ
とが好ましい、次いで、この溶液を遠心すること
により、中間層にやや透明なCT抽出液が形成さ
れる。ここで、沈澱物は、主に鰓後体の組織片及
び不溶物であり、上層部は、主に脂肪の白色のか
たまりである。中間層を採取し、次の処理工程に
供する。 以上のようにして得られる抽出物の精製は、前
述の処理(a)〜(d)のいずれか一つの方法により行な
うことができるが、二つ以上を組み合わせること
が好ましい。 処理(a)においては、本発明のCT（分子量
3370.7）を沈澱させず、それ以上の高分子量体を
沈澱させるに足る充分量の親水性有機溶媒（例え
ば、低級アルコール、アセトンなど）を前記抽出
液に添加して、高分子量体を除去する。 処理(b)においては、抽出液又はその処理液をカ
チオン交換クロマトグラフイーに付して、塩基性
画分を回収する。該クロマトグラフイーは、好ま
しくは水溶媒にて行なわれるが、低級アルコー
ル、アセトンの如き親水性有機溶媒の添加された
水溶液においても行なうことができる。溶離液
は、通常、約PH７〜13の塩基性溶液、例えばピリ
ジン及びこれを主成分とする塩基性溶液と約２〜
７の範囲のPHを有するもの、例えばピリジン−酢
酸、酢酸、ギ酸、塩酸及びこれらを主成分とする
酸性溶液である。 用いるカチオン交換樹脂としては、例えばカル
ボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセフ
アデツクス及びSP−セフアデツクスなどが挙げ
られる。 処理(c)のゲルクロマトグラフイーは、例えば酢
酸、炭酸水素アンモニウム、ギ酸アンモニウムの
如き揮発性緩衝液中で行なうことが好ましい。カ
ラムの例としては、Bio−gel PIO及びセフアデ
ツクスG50が挙げられる。 処理(d)の高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）は、常法に従つて行なうことができ、
ギ酸アンモニウム（10ｍＭ〜1.0M）−アセトニト
リル、水−アセトニトリル−10％トリフルオロ酢
酸（TFA）（90：10：１〜40：60：１）などの溶
媒を用いて直線型濃度勾配溶出し、カルシトニン
様生理活性を有する画分を回収する。 以上の各精製工程における各画分の検定は、抗
ウナギCT血清が本発明のCTの交差反応すること
を利用して、放射性免疫検定法を用い、適宜、生
物性測定法を併用した。 放射性免疫検定法では、抗原であるウナギCT
を用いて、ウナギに数回免疫し、免疫後、採血し
て抗血清を得る。ここで、本放射性免疫検定法と
は、ウナギCTの抗体（抗血清）に対し、本発明
のCTと放射線標識抗原との競争反応により本発
明のCT量を検出する方法である。一方、標識抗
原は、ウナギCTのチロシン部分に放射性ヨウ素
（ 125）を結合するクロラミンＴ法により作製
できる。次に、本発明のCT抽出液又は各工程の
各画分（被検体）を適宜希釈した数種の溶液と前
記で得られた抗ウナギCT血清とを良く反応させ
（４℃、１夜）、この上清液中に含まれる抗体と結
合していない 125−ウナギCTの量をγ−カウ
ンターで測定することにより、被検体中に含まれ
る相対的なCT活性が求められる。この放射性免
疫検定法によれば、検定によつて消費されるCT
量が生物活性検定法に比し、約1/100に低減され
るばかりか、手技が簡単である、定量性・再現性
が優れている、検定の所要時間が短かい、などの
利点を有し、放射性免疫検定法は本発明における
新規CTの分離・精製を容易、かつ、迅速ならし
めることができる。 次に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれにより制限されるものではな
い。 実施例 １ (A) 出発原料 10週令食肉用ニワトリ（3384匹）を放血し、
直ちに、鰓後体を摘出した。脂肪をできる限り
除去し、ドライアイスで凍結した。得られた鰓
後体は約179.11ｇであつた。 (B) 抽出工程 上記方法で得られた鰓後体を小分けし（約
500匹分）、それぞれについてIN酢酸溶液（鰓
後体重量の５倍量（重量比））に浸漬し、ポリ
トロンでホモジナイズし、遠心分離（9000rpｍ
30分間）した。次に、脂肪を含まないように、
中間層を採取し、この抽出液の一部を凍結乾燥
した。 この凍結乾燥粉末の一部を0.INギ酸に溶解
し、生物活性を測定したところ、1.0〜
1.2MRCU／匹であつた。 (C) 精製工程 前記のようにして得た目的生理活性物質を含
む酢酸水溶液（900ml）にアセトン（1800ml）
を徐々に添加後、一夜放置し、高分子量体を沈
澱させた。遠心分離（9000rpｍ、30分間）後、
上清液を採取した。 この上清液を、SP−セフアデツクスＣ−25を
充填し、IN酢酸溶液で平衡化したカラム（直径
3.2cm×高さ22cm）上に注入した。このとき、酸
性物質は除去され、目的生理活性物質を含む塩基
性物質がSP−セフアデツクスＣ−25にイオン的
に吸着される。次いで、2Mピリジン溶液で溶出
した。この溶出液には、相対的に低いCT活性が
認められた。次いで、2Mピリジン・酢酸溶液
（PH5.0）で溶出した。この溶出液には、相対的に
高いCT活性が認められた。 これ以後の実験では、前記後者の溶出液を用い
た。この溶出液を濃縮し、IN酢酸を添加し、凍
結乾燥した。この凍結乾燥粉末1370mgをIN酢酸
15mlに溶解し、予めセフアデツクスＧ−50
（Fine）を充填し、IN酢酸溶液で平衡化したカラ
ム（直径50cm×高さ130cm）上に、この溶液を注
入した。このとき、溶出条件は溶離液IN酢酸、
溶出速度25ml／ｈであつた。溶出液を15ml／本ず
つ分画採取し、放射性免疫検定法による活性画分
（画分No.50〜57）を回収した。これを凍結乾燥し、
粉末20.8mgを得た。 前記検定法から算出された免疫学的に反応した
本発明のCT量は692μｇ（3384匹相当）であつ
た。 この粉末20.8mgをＡ液（後述）1.5mlに溶解し、
この溶液を以下の測定条件に従いHPLCに付し
た。 測定条件： カラム；東洋曹達工業(株)製TSK GEL CM2 SW
（4.6mmφ×250mm） 流 速；2.0ml／min 差 圧；35Kg／cm2 溶離液；Ａ液（10ｍＭギ酸アンモニウム：アセト
ニトリル＝９：１） Ｂ液（1.0Mギ酸アンモニウム：アセトニトリ
ル＝９：１） をサンプル注入１分後、Ａ液からＢ液へ直線型
濃度勾配溶出 得られた結果において、放射性免疫検定法に基
づく活性と吸光測定法による280nｍにおけるペ
プチド由来の吸光度とが一致した。更に、同様に
以下の条件にて試料を三つに分けてHPLCを繰り
返した。 測定条件： カラム；ケムコ社製Chemcosorb5ODS−Ｈ（4.6
mmφ×250mm） 溶出液；0.5ml／本 流 速；1.0ml／min 差 圧；140Kg／cm2 溶離液；Ａ液（水：アセトニトリル：10％TFA
＝90：10：１） Ｂ液（水：アセトニトリル：10％TFA＝40：
60：１） をサンプル注入８分後、Ａ液からＢ液へ直線型
濃度勾配溶出 その結果、活性画分（No.40）〔保持時間26分
（ブラジエント後）〕にペプチドに基づく強い吸光
度（A280、A210）が認められた。この活性画分を
凍結乾燥して活性粉末106μｇを得た。この粉末
の生物活性は、5300MRCU／mgであつた。 以上のようにして得られた活性粉末のアミノ酸
分析値を表１に示す。 測定法は、活性粉末3.5μｇを6N塩酸を用いて
110℃で22時間加水分解し、脱塩酸後50μの
0.2Nクエン酸緩衝液（PH3.25）に溶解し、全量を
分析に供した。 更に、常法により、主としてエドマン分解し、
公知の蛋白決定法によりアミノ基末端より順次ア
ミノ酸配列が決定され、同時に、カルボキシペプ
チダーゼを用いてカルボキシ基末端が決定され、
前記式（）に示す新規カルシトニンのアミノ酸
配列が決定された。
【表】
【表】
実施例 ２
実施例１と同様にして、ニワトリ鰓後体（500
匹）より本発明のCTを含む抽出酢酸溶液625mlを
得た。 この溶液を、予めIN酢酸で平衡化したSP−セ
フアデツクスＣ−25カラム（直径2.0cm×高さ17
cm）に注入した。次いで、2Mピリジン溶液で溶
出し、更に、2Mピリジン・酢酸溶液（PH5.0）で
溶出した。この後者の溶出液中に本発明のCTが
含まれていた。 この溶出液120mlにアセトン240mlを添加し、一
夜放置後、遠心分離（9000rpｍ、30分間）し、上
清液を採取し、凍結乾燥して粉末200mgを得た。 この凍結乾燥粉末をIN酢酸に溶解して約100
mg／mlの溶液とし、セフアデツクスＧ−50
（Fine）カラム（直径1.2cm×高さ103cm）に注入
した。このとき、溶出条件は溶離液IN酢酸、溶
出速度5.7ml／ｈであつた。放射性免疫検定法に
よる活性画分を回収し、これを凍結乾燥して凍結
乾燥粉末3.0mgを得た。前記検定法から算出され
た免疫学的に反応した本発明のCT量は120mgであ
つた。この粉末の実施例１と同様の方法にて高速
液体クロマトグラフイー操作を実施し、CTの活
性粉末24μｇを得た。この粉末の生物活性は
4800MRCU／mgであつた。 更に、アミノ酸分析を行なうとともに、アミノ
酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のCTで
あることを確認した。 実施例 ３ 実施例１と同様にして、ニワトリ鰓後体（500
匹）より本発明のCTを含む抽出酢酸溶液625mlを
得、凍結乾燥して粉末1.5ｇを得た。 この粉末をIN酢酸15mlに溶解した後、遠心分
離（3000rpｍ、20分間）して、その上清液をセフ
アデツクスＧ−50（Fine）カラム（直径1.2cm×高
さ103cm）に注入した。 この活性画分をSP−セフアデツクスＣ−25カ
ラムに注入し、実施例１と同様にして、CT活性
を有する粉末80μｇを得た。 この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体
クロマトグラフイー操作を実施し、CTの活性粉
末13μｇを得た。この粉末の生物活性は
5100MRCU／mgであつた。 更に、アミノ酸分析を行なうとともに、アミノ
酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のCTで
あることを確認した。
匹）より本発明のCTを含む抽出酢酸溶液625mlを
得た。 この溶液を、予めIN酢酸で平衡化したSP−セ
フアデツクスＣ−25カラム（直径2.0cm×高さ17
cm）に注入した。次いで、2Mピリジン溶液で溶
出し、更に、2Mピリジン・酢酸溶液（PH5.0）で
溶出した。この後者の溶出液中に本発明のCTが
含まれていた。 この溶出液120mlにアセトン240mlを添加し、一
夜放置後、遠心分離（9000rpｍ、30分間）し、上
清液を採取し、凍結乾燥して粉末200mgを得た。 この凍結乾燥粉末をIN酢酸に溶解して約100
mg／mlの溶液とし、セフアデツクスＧ−50
（Fine）カラム（直径1.2cm×高さ103cm）に注入
した。このとき、溶出条件は溶離液IN酢酸、溶
出速度5.7ml／ｈであつた。放射性免疫検定法に
よる活性画分を回収し、これを凍結乾燥して凍結
乾燥粉末3.0mgを得た。前記検定法から算出され
た免疫学的に反応した本発明のCT量は120mgであ
つた。この粉末の実施例１と同様の方法にて高速
液体クロマトグラフイー操作を実施し、CTの活
性粉末24μｇを得た。この粉末の生物活性は
4800MRCU／mgであつた。 更に、アミノ酸分析を行なうとともに、アミノ
酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のCTで
あることを確認した。 実施例 ３ 実施例１と同様にして、ニワトリ鰓後体（500
匹）より本発明のCTを含む抽出酢酸溶液625mlを
得、凍結乾燥して粉末1.5ｇを得た。 この粉末をIN酢酸15mlに溶解した後、遠心分
離（3000rpｍ、20分間）して、その上清液をセフ
アデツクスＧ−50（Fine）カラム（直径1.2cm×高
さ103cm）に注入した。 この活性画分をSP−セフアデツクスＣ−25カ
ラムに注入し、実施例１と同様にして、CT活性
を有する粉末80μｇを得た。 この粉末を実施例１と同様の方法にて高速液体
クロマトグラフイー操作を実施し、CTの活性粉
末13μｇを得た。この粉末の生物活性は
5100MRCU／mgであつた。 更に、アミノ酸分析を行なうとともに、アミノ
酸配列を決定し、この活性粉末が本発明のCTで
あることを確認した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次式： （式中、Cysはシステインを、Serはセリンを、
Aspはアスパラギン酸を、Leuはロイシンを、
Thrはスレオニンを、Valはバリンを、Glyはグ
リシンを、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジンを、
Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはア
ルギニンを、Alaはアラニンを表わす。） で示される新規カルシトニン及びその塩。 ２ トリ鰓後体を酸性水溶液で抽出した後、次の
処理(a)〜(d)： (a) 目的物含有水溶液に親水性有機溶媒を添加し
て高分子量体を沈澱せしめ除去する (b) カチオン交換樹脂を用いて塩基性画分を回収
する (c) ゲルクロマトグラフイーにより分子量3000〜
4000の画分を回収する (d) 高速液体クロマトグラフイーによりカルシト
ニン様生理活性を有する画分を回収する のうち、少なくとも１種の処理を施すことを特徴
とする 次式： （式中、Cysはシステインを、Serはセリンを、
Aspはアスパラギン酸を、Leuはロイシンを、
Thrはスレオニンを、Valはバリンを、Glyはグ
リシンを、Lysはリジンを、Glnはグルタミンを、
Gluはグルタミン酸を、Hisはヒスチジンを、
Tyrはチロシンを、Proはプロリンを、Argはア
ルギニンを、Alaはアラニンを表わす。） で示される新規カルシトニン又はその塩の採取
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58230593A JPS60123500A (ja) | 1983-12-08 | 1983-12-08 | 新規カルシトニン及びその採取法 |
| EP84114768A EP0146842B1 (en) | 1983-12-08 | 1984-12-05 | Novel calcitonin and collection thereof |
| DE8484114768T DE3462896D1 (en) | 1983-12-08 | 1984-12-05 | Novel calcitonin and collection thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58230593A JPS60123500A (ja) | 1983-12-08 | 1983-12-08 | 新規カルシトニン及びその採取法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60123500A JPS60123500A (ja) | 1985-07-02 |
| JPH0339520B2 true JPH0339520B2 (ja) | 1991-06-14 |
Family
ID=16910165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58230593A Granted JPS60123500A (ja) | 1983-12-08 | 1983-12-08 | 新規カルシトニン及びその採取法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0146842B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60123500A (ja) |
| DE (1) | DE3462896D1 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0678357B2 (ja) * | 1984-08-29 | 1994-10-05 | 三菱油化株式会社 | 新規ペプチド |
| JPS63502322A (ja) * | 1985-12-19 | 1988-09-08 | モロニイ，トーマス・ジヨセフ | 引出しケ−ス |
| FR2592049B1 (fr) * | 1985-12-24 | 1988-02-12 | Milhaud Gerard | Nouveaux analogues de composes polypeptidiques hypocalcemiants epargnant le calcium de l'organisme, leur preparation et les medicaments contenant ces principes actifs |
| AU645794B2 (en) * | 1990-03-30 | 1994-01-27 | Shiseido Company Ltd. | Process for purifying polypeptide |
| KR960031478A (ko) * | 1995-02-14 | 1996-09-17 | 성재갑 | 유비퀴틴 융합 인간 칼시토닌의 정제방법 |
| NL1002400C2 (nl) * | 1996-02-20 | 1997-08-21 | Friesland Brands Bv | Oraal calcitonine-preparaat en werkwijze voor het winnen van calcitonine. |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3926938A (en) * | 1974-08-12 | 1975-12-16 | Armour Pharma | Synthesis of salmon calcitonin |
-
1983
- 1983-12-08 JP JP58230593A patent/JPS60123500A/ja active Granted
-
1984
- 1984-12-05 DE DE8484114768T patent/DE3462896D1/de not_active Expired
- 1984-12-05 EP EP84114768A patent/EP0146842B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0146842B1 (en) | 1987-04-01 |
| EP0146842A1 (en) | 1985-07-03 |
| JPS60123500A (ja) | 1985-07-02 |
| DE3462896D1 (en) | 1987-05-07 |
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