【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
［産業上の利用分野］
本発明は、オタネニンジン（Panax ginseng
C.A.Meyer）の組織培養にに関するもので、オ
タネニンジンの幼苗を大量に得るための方法に係
るものである。
［従来の技術］
オタネニンジン（通称、朝鮮人参）は、薬用植
物として栽培され、通常は種子により増殖されて
いるが、最近、このオタネニンジンを組織培養に
より増殖することが試みられている。この方法と
して、オタネニンジンの根、茎、葉等の植物組織
をオーキシン類及びサイトカイニン類を含有する
カルス誘導培地を用いてカルスを誘導し、当該カ
ルスを増殖し、次いで、当該カルスを光照射下に
再分化させる方法（特開昭61−216619号公報）ま
た、カルスから不定胚を誘導増殖して、次いで再
分化させる方法｛W.C.Chang、Y.I.Hsing：セオ
リテイカル、アンド、アプライド、ゼネテイクス
（Theorihical and Applied Genetics）57、133
（1980）等｝が、提案されている。
尚、茎頂由来のシユートをマルチプルシユーテ
イングにより増殖する方法（いわゆる、メリクロ
ン法）は、例えば、ガーベラ等で多数の報告があ
る｛例えば、T.Murashige et.al.：ホートサイエ
ンス（Hortscience）９、175（1974）｝が、オタ
ネニンジンについては、その報告例はない。
［発明が解決しようとする問題点］
上記オタネニンジンのカルスから直接に出芽、
発根させて再分化させる方法は、再分化して得ら
れる幼苗の数がカルスの量に依存し、また一般に
カルスは、継代を繰り返すとかなりの割合で変異
するので、一個体の植物から得られる正常なクロ
ーン苗の量に限界がある。
また、カルスより不定胚を誘導増殖する方法
も、継代培養を繰り返すうちに、不定胚からの再
分化能力が失われ、上記と同様に一個体の植物か
ら得られる正常なクローン苗の量に限界がある。
本発明者は、これらの問題を解決するために鋭
意研究を進めた結果、オタネニンジンの不定胚由
来のシユート（shoot）をマルチプルシユート
（multiple shoot）化できることを見い出した。
本発明は、かかる知見に基づいてなされたもの
で、本発明の目的は、大量に、しかも効率良くオ
タネニンジンのクローン苗を得る方法を提供する
ことにある。
［問題点を解決するための手段］
本発明は、オタネニンジンの不定胚からシユー
トを形成し、当該シユートをマルチプルシユーテ
イングにより増殖することから成るオタネニンジ
ンの組織培養方法である。
本発明では、先ず、オタネニンジンの根、茎、
葉、花芽等の生組織の一部を切り取り、ツイーン
（Tween）80を添加した次亜塩素酸ナトリウム水
溶液やエタノール等の減菌液で減菌した後、カル
ス誘導及び不定胚誘導培地で培養してカルスを
得、次いでこれから不定胚を誘導することが好ま
しい。この場合、特に、オタネニンジンの花芽を
用いるとカルスから不定胚の誘導を短期間で効率
良く行なうことができる。
カルス誘導及び不定胚誘導培地としては、２，
４−ジクロロフエノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、イ
ンドール酢酸、ナフタレン酢酸（NAA）等のオ
ーキシン類、或いはベンジルアミノプリン
（BAP）、カイネチン等のサイトカイニン類を添
加したムラシゲースクーグ（MS）、ホワイト、
リンスマイヤー−スクーグ、ガウスレツト、ヘラ
ー等の培地を用いることができる。
上記、減菌後の生組織をこのカルス化及び不定
胚誘導培地で、暗黒下に、約12週間組織培養する
と、生組織はカルス化し、次いで不定胚が誘導さ
れる。
このようにして誘導された不定胚のうち成熟胚
は、光照射下に、サイトカイニン類及びジベレリ
ン（GA）等を含有させた再分化用培地で培養す
ることにより、４週間程度で発芽し、シユートが
得られる。
一方、未成熟胚は、光照射下に、サイトカイニ
ン類およびオーキシン類等を含有させた培地で継
代培養し、胚の成熟促進と二次胚の形成増殖を行
い、上記再分化用培地でシユート化させると良
い。
このようにして得られる上記シユートは、
BAP−GA又はNAA−BAPを添加した培地で、
光照射下に培養するとマルチプルシユートを形成
する。
このマルチプルシユートは、２〜10本の、葉が
２枚程度の正常なシユートからなつており、これ
を分割して上記マルチプルシユート形成培地でさ
らに培養を行なう一連の操作を繰り返すことによ
り増殖することができる。
このようにして得られるシユートは、NAA、
インドール酢酸（IAA）、インドール酪酸（IBA）
等のオーキシン類を含む発根培地で、光照射下に
培養すると７週間程度で発根し、幼苗が得られ
る。
この幼苗を土壌へ移植することにより、オタネ
ニンジンを栽培することができる。
［実施例］
オタネニンジンの根から発芽後約２週間目の花
芽の花柄および花がくを除いた５mmの花芽切片、
根の表皮を除いた約３mm角の根切片、茎を厚さ約
２mmの円盤状に切り取つた茎切片、葉の部分を葉
身約１cm2に切り取つた葉切片の各々を、ツイーン
80を0.1重量％添加した３重量％の次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液で10分間、さらに70容量％のエタ
ノール溶液で30秒間減菌した後、減菌精製水で２
回洗浄した。
この減菌後各切片を２，４−Ｄを1ppm添加し
たMS培地に移植し、25±１℃の温度で、暗黒下
に12週間培養した。この結果、全切片でカルス化
し、花芽由来カルスでは、80％のカルス切片から
不定胚形成が認められた。一方、根、茎、葉の各
切片では、12週間目で不定胚形成に至るものはな
かつたが、６〜９カ月経過すると、それぞれ１
％、10％、５％のものが不定胚を形成した。
これらの不定胚のうち成熟胚を取り出し、MS
培地組成液を２倍に希釈し、これにBAP及びGA
をそれぞれ0.5ppmづつ、さらにシユークロース
（sucrose）を1.5重量％あるいは３重量％添加し
て調製した寒天培地に移植し、22±１℃の温度
で、16時間／日照明下に４週間培養した。この結
果、シユークロースを1.5重量％添加した培地で
は、70％の胚から、また３重量％の培地では、45
％の胚から正常なシユートが得られた。
次に、このシユートを、MS培地組成液を２倍
に希釈し、これに第１表に示したような量の
GA、BAP及びシユークロースを添加した寒天培
地で、22±１℃の温度で、16時間／日照明下に８
週間培養した。この結果、同表に示した本数を有
するマルチプルシユートが得られた。
[Industrial Application Field] The present invention is directed to Panax ginseng (Panax ginseng).
This paper relates to the tissue culture of Panax ginseng (Cameyer), and relates to a method for obtaining large quantities of young Panax ginseng seedlings. [Prior Art] Panax ginseng (commonly known as Panax ginseng) is cultivated as a medicinal plant and is usually propagated by seeds, but recently attempts have been made to propagate Panax ginseng by tissue culture. In this method, callus is induced from plant tissues such as roots, stems, and leaves of Panax ginseng using a callus induction medium containing auxins and cytokinins, the callus is multiplied, and then the callus is exposed to light. A method of redifferentiation (Japanese Patent Application Laid-open No. 61-216619) Also, a method of inducing and propagating somatic embryos from callus and then redifferentiating them {WCChang, YIHsing: Theoretical and Applied Genetics 57 , 133
(1980) etc. have been proposed. There are many reports on the method of propagating shoots derived from the shoot apex by multiple shooting (the so-called mericron method), for example, for gerberas (for example, T. Murashige et.al.: Hortscience). 9 , 175 (1974)}, but there are no reports regarding Panax ginseng. [Problems to be solved by the invention] Direct sprouting from the callus of the above-mentioned Panax ginseng,
The method of rooting and redifferentiation depends on the number of seedlings obtained through redifferentiation and the amount of callus, and callus generally mutates at a considerable rate after repeated subcultures. There is a limit to the amount of normal cloned seedlings that can be obtained. In addition, with the method of inducing and propagating somatic embryos from callus, the ability to redifferentiate from somatic embryos is lost through repeated subculturing, and as mentioned above, the amount of cloned seedlings obtained from a single individual plant decreases. There is a limit. As a result of intensive research to solve these problems, the present inventors discovered that shoots derived from somatic embryos of Panax ginseng can be converted into multiple shoots. The present invention was made based on this knowledge, and an object of the present invention is to provide a method for efficiently obtaining cloned seedlings of Panax ginseng in large quantities. [Means for Solving the Problems] The present invention is a method for tissue culture of Panax ginseng, which comprises forming shoots from somatic embryos of Panax ginseng and propagating the shoots by multiple shooting. In the present invention, first, roots and stems of Panax ginseng,
A part of the living tissue such as leaves and flower buds was cut out and sterilized with a sterilizing solution such as a sodium hypochlorite aqueous solution containing Tween 80 or ethanol, and then cultured in a callus induction and somatic embryo induction medium. It is preferable to obtain a callus by using the method described above, and then to induce somatic embryos from the callus. In this case, in particular, when flower buds of Panax ginseng are used, somatic embryos can be efficiently induced from callus in a short period of time. As callus induction and somatic embryo induction medium, 2.
Murashige-Skoog (MS) containing auxins such as 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), indoleacetic acid, and naphthaleneacetic acid (NAA), or cytokinins such as benzylaminopurine (BAP) and kinetin. ),white,
Mediums such as Linsmeyer-Skoog, Gauslett, Heller, etc. can be used. When the above-mentioned sterilized living tissue is cultured in this callus formation and somatic embryo induction medium in the dark for about 12 weeks, the living tissue becomes a callus and then somatic embryos are induced. Among the somatic embryos induced in this way, mature embryos are cultured in a regeneration medium containing cytokinins, gibberellin (GA), etc. under light irradiation, and germinate in about 4 weeks and produce shoots. is obtained. On the other hand, immature embryos are subcultured in a medium containing cytokinins, auxins, etc. under light irradiation to promote embryo maturation and formation and proliferation of secondary embryos, and are then shunted in the above-mentioned redifferentiation medium. It is good to make it The above shot obtained in this way is
In a medium supplemented with BAP-GA or NAA-BAP,
Forms multiple shoots when cultured under light irradiation. This multiple shoot consists of 2 to 10 normal shoots with about 2 leaves, and is grown by repeating a series of operations in which the shoots are divided and further cultured in the above-mentioned multiple shoot formation medium. can do. The shots obtained in this way are NAA,
Indole acetic acid (IAA), indole butyric acid (IBA)
When cultivated under light irradiation in a rooting medium containing auxins such as auxin, roots will develop in about 7 weeks and seedlings can be obtained. Panax ginseng can be cultivated by transplanting these seedlings into soil. [Example] A 5 mm flower bud section from the root of Panax ginseng, excluding the peduncle and calyx, approximately 2 weeks after germination,
A root section approximately 3 mm square with the root epidermis removed, a stem section obtained by cutting the stem into a disc shape approximately 2 mm thick, and a leaf section obtained by cutting the leaf portion into approximately 1 cm 2 of leaf blade, were prepared using Tween.
Sterilize for 10 minutes with a 3% by weight aqueous sodium hypochlorite solution containing 0.1% by weight of 80, then sterilize for 30 seconds with a 70% by volume ethanol solution, and then sterilize with sterilized purified water for 2 hours.
Washed twice. After sterilization, each section was transferred to MS medium supplemented with 1 ppm of 2,4-D and cultured in the dark at a temperature of 25±1° C. for 12 weeks. As a result, callus formation occurred in all sections, and somatic embryo formation was observed in 80% of callus sections derived from flower buds. On the other hand, none of the root, stem, and leaf sections reached somatic embryo formation at 12 weeks, but after 6 to 9 months, 1.
%, 10%, and 5% formed somatic embryos. Mature embryos are removed from these somatic embryos and subjected to MS
Dilute the medium composition solution 2 times and add BAP and GA to this.
The cells were transplanted onto an agar medium prepared by adding 0.5 ppm of each and 1.5% or 3% by weight of sucrose, and cultured for 4 weeks at a temperature of 22±1°C under light for 16 hours/day. As a result, in the medium containing 1.5% by weight of sucrose, 70% of the embryos were extracted, and in the medium with 3% by weight, 45% of the embryos were extracted.
Normal shoots were obtained from % of embryos. Next, dilute this shoot with the MS medium composition solution twice and add the amount shown in Table 1.
8 on agar medium supplemented with GA, BAP and sucrose at a temperature of 22 ± 1°C under 16 h/day light.
Cultured for a week. As a result, multiple shoots having the numbers shown in the table were obtained.
【表】
上記で得られたシユートを上記と同様の培養条
件で分割増殖したのち、NAA、IBA、IAAをそ
れぞれ1ppmづつ添加したMS寒天培地で、20±
１℃の温度で、16時間／日照明下に７週間培養し
た結果、NAAを添加した培地で75％のIBAを添
加した培地で50％のシユートが発根し、クローン
苗が得られた。
この幼苗を土壌に移植したが、順調に生育して
いる。
［発明の効果］
本発明は、オタネニンジンの不定胚からシユー
トを形成し、当該シユートをマルチプルシユーテ
イングにより増殖を行なうようにしたため、大量
かつ効率良く、しかも安定的にオタネニンジンの
クローン苗を得ることができるという格別の効果
を奏するものである。[Table] After dividing and propagating the shoots obtained above under the same culture conditions as above, they were grown on MS agar medium supplemented with 1 ppm each of NAA, IBA, and IAA.
As a result of culturing for 7 weeks at a temperature of 1°C under light for 16 hours/day, 50% of the shoots were rooted in the medium supplemented with NAA and 75% IBA, and clone seedlings were obtained. These young seedlings were transplanted into soil and are growing smoothly. [Effects of the Invention] The present invention forms shoots from somatic embryos of Panax ginseng and multiplies the shoots by multiple shooting, thereby making it possible to efficiently and stably obtain cloned seedlings of Panax ginseng in large quantities. It has the special effect of being able to do the following.