JPH0346784B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に言えば、正確でそして精密な
細胞の体積測定を行うために、体積変化を起さな
いで全血液の赤血球を球状体化するかまたは球状
体化しそして固定する方法に関する。さらに詳し
く言えば、この方法は１連の希釈工程を含んでい
る。この工程により、外来性または内因性のタン
パク質と球状体化剤とをタンパク質／球状体化剤
の重量比が全試料の体積に基づいて約20：１〜約
70：１の量で添加し、そして最終試料中の球状体
化剤の濃度は約２mg／100ml〜約10mg／100mlにな
る。

個個の赤色細胞（赤血球）からの光散乱の測定
量を利用して赤色細胞（赤血球）の個個の体積お
よびその平均体積を決定する方法は、以下の２種
類の誤差の影響を受ける。

１ 生来の人間の赤血球は両凹の円板であるの
で、特定の立体角内で散乱する光の量は入射光
束に対する細胞の方向に伴つて変動する。

２ 操作の間すなわち希釈しそしてポンプで送る
間に、細胞の形が１部には血液の採集時と測定
時との間の時間差により、そして１部には希釈
された血液試料の組成によつて変化することが
ある。

上記の点に関する詳細についてはEric Ponder
著『溶血反応および関連現象（Hemolysis and
Related Phenomera）』第章第10〜49頁
（1948）およびBernard Deuticke
『Transformation and Restoration of
Biconcave Shape of Human Erythrocytes
Induced by Amphiphilic Agents and Changes
of Ionic Environment』Biochemica Et.
Biophy.Acta，第494〜500頁（1968）を参照され
たい。

本発明はこれらの誤差の原因を両方とも取り除
き、人間の赤血球の体積測定の広く改善された方
法を可能にするものである。例えば上記の
Ponderの文献に記載されているとおり、赤血球
を等張性溶液内でその体積を変えることなく球状
体化できることはよく知られている。完全に球状
体化した細胞から散乱する光は光束の方向に対し
ては変化しないので、前記の第１の誤差は消去さ
れる。しかしながらそのように調製したものが不
安定であることは周知である。すなわち赤血球は
球状体化後のいろいろの段階（それは球状体化剤
の選択および個個の血液試料の性質によつて左右
される）で溶解してしまう。

本発明者は、球状体化剤（代表的には洗浄剤の
性質をもつた物質）の絶対濃度およびタンパク質
（これは等張性溶液中の任意所望の希釈度の内因
性のものまたは外から加えたもののどちらでもよ
い）に対する球状体化剤の重量比を制御すること
によつて、球状体化状態を長期に亘つて安定に保
つことができることを見い出した。前記の制御は
処理工程中の形状の一貫性を確保する助けとなり
そして前記の第２の誤差を最小にする。

本発明方法は一般に以下の２つの方法で実施す
ることができる。

Ａ 球状体化剤（洗浄剤）とアルブミンとを所要
濃度で含有する等張性溶液中に血清試料を（代
表的には約１／1000に）希釈するか、または Ｂ 血液試料そのものからの内因性の血清アルブ
ミン（血漿タンパク質）に対する球状体化剤の
割合が正しい割合となる希釈度が与えられたと
きに、球状体化が起こるのにちようど充分な濃
度で球状体化剤を含んでいる等張性溶液のある
量で血清試料を希釈する。次に、得られる試料
を、固定剤の等張性溶液を添加することによつ
て同時におよび（または）連続的に固定しそし
てさらに希釈して球状体化細胞を硬化し、そし
てもし前記の処理を行わなければ球状体化細胞
についてその形状または大きさを変化させまた
はそれらに含まれているヘモグロビンを溶解し
て失なわせるような工程に対しても完全に不活
性なものにしてしまう。

本発明は前記特許請求の範囲にも記載してある
とおり、試料中の哺乳類の赤血球を処理し、赤血
球の体積を測定するにあたつて電気光学的に有効
に測定することのできる試料を提供する方法に関
するものであり、この方法は抗凝固性の全血液試
料を球状体化剤含有等張性溶液と結合し、そして
こうして得られる試料のアリコート（部分試料）
をタンパク質−球状体化剤含有等張性溶液で希釈
することから成る。最終試料中のタンパク質／球
状体化剤の重量比は約20：１〜約70：１好ましく
は約50：１であり、そして球状体化剤の濃度は約
２mg／100ml〜約10mg／100ml好ましくは約３mg／
100mlである。

全血液試料は希釈剤としての塩類で試料の約50
容量％希釈度に予備希釈し、粘度を減少しておく
ことが好ましい。血液試料の粘度変動から起き
る、ポンプ操作による体積的な誤差の減少が保証
されるからである。その次の希釈工程によつて体
積比で約１：1000の最終希釈となるが、この希釈
度は１個より多い細胞が電気光学式検出器の入射
光束を通過し、検出器の測定時間内に窓を通る確
率の非常に低いものである。

本発明方法に使う洗浄剤は硫酸アルキル（この
アルキル基は炭素原子10〜16個を含む）のアルカ
リ金属塩が好ましく、ラウリル硫酸ナトリウムが
最も好ましい。

本発明方法に使うタンパク質は好ましくは血清
アルブミンであり、それは外部から加える。

本発明のその他の好ましい方法は、タンパク
質／球状体化剤による希釈工程の代りに、アリコ
ート試料を固定剤溶液好ましくは等張性のグルタ
ルアルデヒド含有塩類溶液で処理すること以外は
上記に記載した方法と同様に行うものである。こ
の方法において必要なタンパク質は試料中におい
て内因性的に血漿タンパク質として提供される。

本発明の別の好ましい態様は、前記特許請求の
範囲にも記載されている通り、試料中の赤血球を
球状体化するための試薬である。すなわちタンパ
ク質の球状体化剤に対する重量比が約20：１〜約
70：１であり、混成試料中における球状体化剤の
全濃度が約２mg／100ml〜約10mg／100mlであるタ
ンパク質−球状体化剤混合物から成る、試料中の
赤血球の球状体化剤である。

本発明を更に詳細に説明すれば、本発明は抗凝
固性全血液試料中の哺乳動物の赤血球を球状体化
する方法を目的している。この方法はタンパク質
と球状体化剤とを特定の重量比でそしてある最終
の球状体化剤濃度で使うことを含んでいる。

タンパク質が不在の場合には、球状体化剤添加
後の溶液中の遊離の球状体化剤の量は赤血球の濃
度に依存することになる（上記Ponderの文献参
照）。従つて、正常な血液カウントに対して決定
した最適の球状体化剤濃度をもつ試薬を使うと、
球状体化の度合いは、溶液の単位体積当りの赤血
球カウントが高い血液においては不完全となり、
または非常に低い赤血球カウントのものにおいて
は溶解に導くこともある。

タンパク質例えば血清アルブミンは球状体化剤
と可逆的に結合しそしてそれゆえに赤血球カウン
トにかかわりなく、球状体化剤の最適範囲におけ
る有効濃度を緩衝するのに使うことできる。

球状体化剤の好ましい濃度は、試料をある特定
の希釈状態においてタンパク質例えばアルブミン
または血漿タンパク質で緩衝したときに丁度球状
体化を起こすのに充分な量である。このタンパク
アルブミンは次の２つの方法のいずれかによつて
供給することができる。血清試料中において血漿
タンパク質として内因性的に供給するかまたは外
部から添加するかである。

本発明の好ましい態様においては、この方法は
予備希釈した血液試料を等張性球状体化剤−塩類
溶液と結合し、それから次にそのアリコートをタ
ンパク質−球状体化剤塩類溶液で処理することを
含んでいる。

予備希釈工程は好ましくは適当な等張性希釈剤
例えば塩類溶液で血清試料を約50容積％に希釈す
ることによつて実施する。生成する予備希釈され
た試料は球状体化剤（本明細書においてはこれを
洗浄剤と呼ぶことがある）を含む等張性溶液と結
合する。代表的な第１の希釈は試料の50：１希釈
液を作るものである。上記試料のアリコートをタ
ンパク質−球状体化剤溶液で処理することによつ
て更に希釈し、試料の約1000：１の希釈液を得
る。生成する試料は光散乱測定に対して適当な濃
度で、球状体化しそして安定化した赤血球を含有
している。流動式血球計数器（flow cell
cytometer）を使つてこのような光散乱測定を行
う場合には、個個の細胞体積ならびに細胞の数を
決定することができる。従つてその平均体積も計
算することができる。

本発明方法において臨界的な意味をもつ特徴と
しては、タンパク質／球状体化剤の重量比および
球状体化剤の濃度が含まれる。これらのパラメー
ターをある限度内に規制することによつて、球状
体化工程は効果的に完遂されそして分析結果は高
い信頼性をもつ。

本明細書に開示した方法において、タンパク
質／球状体化剤の重量比は好ましくは約20：１〜
約70：１最も好ましくは50：１の比率であること
がわかつた。球状体化剤の最終濃度は、約２mg／
100ml〜約10mg／100mlの濃度が非常に好適であ
り、特に３mg／100mlの濃度は最も好ましい。

外部から供給するタンパク質は好ましくは血清
アルブミンである。その他の使用可能なタンパク
質には牛、人および卵のアルブミンが含まれる。

本発明の第２の方法においては、タンパク質／
球状体化剤の第２希釈工程を等張性の固定剤溶液
による処理工程と取替える。この系では、第１の
希釈に対するタンパク質は血清試料中において内
因性的形で血漿タンパク質として供給される。球
状体化剤の等張性溶液は、内因性血漿タンパク
質／球状体化剤の比率および球状体化剤の濃度を
好ましい範囲内にもたらすのに充分な体積で加え
る。好ましい固定剤はグルタルアルデヒドであ
り、それは最終のグルタルアルデヒドの濃度が
0.1重量％〜0.4重量％を与えるような量で使う。
等張性の固定剤溶液は塩類または塩類−球状体化
剤混合物とから適当に調製する。

グルタルアルデヒドは赤血球を非常に速やかに
固定するので、固定剤添加工程より先では球状体
化剤濃度を最適に緩衝することはほとんど臨界的
意味をもたないものと考えられる。含有される赤
血球が固定されるや否や、それは完全に臨界的意
味をもつところではなくなる。

前記のいずれの方法に使われるにしろ、球状体
化剤として適当なものは、そのアルキル基が炭素
原子10〜16個を含む硫酸アルキルのアルカリ金属
（ナトリウム、カリウム、リチウム、セシウムま
たはルビジウム）塩である。ラウリル硫酸アルカ
リ金属塩が好ましく、そしてラウリル硫酸ナトリ
ウム塩が最も好ましいものである。その他のこれ
らの方法に使うことができる適当な球状体化剤は
脂肪酸、りん脂質等を含む。なお、通常『球状体
化剤』と称されているもの（例えば粗製の卵レシ
チン：上記Ponderの文献参照）の中には、実際
には少量の不純物として球状体化剤を含んでいる
に過ぎないものがあることに注意されたい。例え
ば純粋なレシチンは球状体化剤ではない。論議さ
れている重量濃度は任意の不純『球状体化剤』に
おける活性原理についてであり、粗製の重量濃度
ではないことを理解されたい。

前記の両方の方法は自動化された系におけるよ
うに連続的にかまたは不連続なまたは各個別の方
法で行うことができる。

次に添付図面を参照しながら、本発明に従つて
処理した抗凝固性血液試料中の個個の赤血球の体
積を測定する非連続系を説明する。しかしなが
ら、例えば米国特許第3740143号（テクニコン、
インストルメンツ、コーポレーシヨンに譲渡され
た）明細書に記載されているような連続法に基い
て、連続的な抗凝固性血液試料中の赤血球の体積
を測定することは可能であり、その測定法も本発
明の範囲内に含まれる。

前記の系はポンプ管３，５，７，９および１０
を含むぜん動ポンプ１から成る。容易に理解でき
るように、前記ポンプ管の内径の比はこの系に導
入する試料と各反応剤との割合を決定する。アス
ピレーシヨン・プルーブ〔Probe〕１３は導管１
４に沿つてポンプ管５の入口に連結し、ポンプ管
５の出口は接合部１５に連結している。プルーブ
１３は、試料容器１９に含まれる抗凝固性血液試
料１７中に浸すことができるようにしてある。プ
ルーブ１３は米国特許第3740143号明細書に記載
されているように、連続法に基いて、連続試料の
赤血球体積の測定を行うために、順次に連続的試
料容器中へ浸すことができるようにしてあること
ができる。

またポンプ管３の入口端は、試料１７の第１希
釈を行うための適当な希釈剤の源２１に連結して
いる。ポンプ１を操作すると、希釈剤がポンプ管
３を通つて導管１４中の接合部２３に運ばれ、プ
ルーブ１３からくる試料と混合されそして試料を
希釈する。『エアバー（air−bar）』構造２６〔こ
れは例えばテクニコン、インストルメンツ、コー
ポレーシヨンに譲渡されている米国特許第
3306229号明細書に記載のものであり、その操作
は第１図中の破線によつて示すようにポンプ１の
位相に同調している〕はエアライン２５を通じて
周期的に作動して分節（occluding）空気セグメ
ントを導管１４へ導入する。このような『試料
内』空気セグメントの存在は、前記の参考特許明
細書に記載されているように、試料と反応剤との
系中での適当な比率（および連続的な試料の間の
効果的な洗浄）を確保する。同時に、球状体化剤
を含む等張性溶液をその源２７からポンプ管７に
沿つて接合部１５に通し、ここで前記溶液は、ポ
ンプ管５に沿つて運ばれる希釈された試料と混合
し、試料１７の第２の希釈を行う。この試料を接
合部１５から混合コイル２９に通して充分に混合
し、そして次に導管３１に沿つてリサンプリング
管継手３３に流す。管継手３３は廃液出口３５と
リサンプリング出口３７とを含み、後者はポンプ
管９の入口に連結している。試料は出口３７から
ポンプ管９に沿つて接合部３９に到る。管継手３
３中に導入された過剰の試料および『試料内』空
気セグメントは廃液出口３５から捨てる。第２の
『エアバー』構造３８は『試料内』空気セグメン
トをエアライン３６から、希釈された試料の流れ
の中へ再導入する。

ポンプ管１０の入口は固定剤の源４１に連結し
ている。ポンプ管１０の出口は接合部３９に連結
しており、そこで固定剤と２回希釈された試料と
を混合し、そして混合コイル４３に通す。混合コ
イル４３の出口はリサンプリング管継手４５に連
結しており、この管継手４５は廃液出口４７およ
びリサンプリング出口４９を含み、この後者は第
２のぜん動ポンプ５１の単一ポンプ管の入口に連
結している。試料は出口４９からポンプ５１を経
由して上記の米国特許第3740143号明細書に記載
の型のシース流（sheath−stream）粒子計数器
５３に到る。過剰の試料および『試料内』空気セ
グメントは廃液出口４７に沿つて廃液に送る。計
数器４５においては、処理された血液試料中の赤
血球は、連続的に制御しながら流し、個別に計数
しそしてその体積を測定する。処理された血液試
料はその後廃液へ送る。本発明による赤血球の球
状体化により、体積の測定値は計数器５３を通つ
て赤血球が進行する時の赤血球の方位に無関係で
あることを保証する。先行技術においては、赤血
球を適当に球状体化していないので、粒子計数器
を通して進行する赤血球のランダムな方位がしば
しば不精確な体積測定結果を生じた。

次に実施例を示して本発明をさらに具体的に説
明する。

例 １ 抗凝固性の全血液試料（0.37ml）を等張性の塩
類溶液（0.23ml）で予備希釈する。得られた試料
のアリコート（0.16ml）を、ラウリル硫酸ナトリ
ウム（３mg／100ml）を含む等張性塩類溶液（4.2
ml）と結合する。次に、こうして得られた希釈さ
れた試料のアリコート（0.16ml）を、牛の血清の
アルブミン（0.1％）およびラウリル硫酸ナトリ
ウム（３mg／100ml）を含む等張性の塩類溶液4.0
mlで処理する。最終試料を流動セル（flow cell）
中におきそして電気光学的に測定する。赤血球の
計数値と赤血球の体積を記録する。

例 ２ 抗凝固性全血液試料（0.37ml）を等張性の塩類
溶液（0.23ml）で予備希釈する。得られる試料の
アリコート（0.16ml）を、ラウリル硫酸ナトリウ
ム（３mg／100ml）を含む等張性塩類溶液4.2mlと
結合する。こうして得られる希釈試料のアリコー
ト（0.16ml）を次にグルタルアルデヒド（0.2％）
とラウリル硫酸ナトリウム（１mg／100ml）とを
含む等張性の塩類溶液4.0mlで処理する。この最
終試料を流動セル中におき、そして電気光学的に
測定する。赤血球の計数値と赤血球の体積を記録
する。

本明細書中に記載しそしてその特許請求の範囲
中に定義した本発明の精神と範囲とを逸脱しない
かぎり、種類の発明の変形が可能なことは、当業
者には理解されるべきところである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の１つの具体例により、血清
試料を処理して最終的に電気光学的に測定する連
続系または装置のフローシートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗凝固性の全血液試料を球状体化剤含有の第
   １の等張性溶液と結合し、そしてこうして得られ
   る試料のアリコートを球状体化剤と可逆的に結合
   するタンパク質と球状体化剤とを含有する第２の
   等張性溶液で処理する（ここで、前記アリコート
   および最終試料中のタンパク質／球状体化剤の重
   量比は約20：１〜約70：１であり、そして最終試
   料中の球状体化剤の濃度は約２mg／100ml〜約10
   mg／100mlであるものとする）ことから成る、試
   料中の哺乳類の赤血球を処理して赤血球の体積測
   定を電気光学的に有効に測定することができる試
   料を提供する方法。 ２ 全血液試料として、希釈剤としての塩類の液
   で全血液試料を予備希釈して試料の約50容量％に
   希釈したものを使う前項１に記載の方法。 ３ 第１の等張性溶液による結合工程によつて、
   元の試料を約１：50の容量比に希釈する前項２に
   記載の方法。 ４ 第２の等張性溶液による処理工程によつて、
   元の試料を約１：1000の容量比にさらに希釈する
   前項２に記載の方法。 ５ 希釈工程で使う球状体化剤としてアルキル基
   が炭素原子10〜16個を含む硫酸アルキルのアルカ
   リ金属塩を使う前項２に記載の方法。 ６ 硫酸アルキル塩としてラウリル硫酸のアルカ
   リ金属塩を使う前項５に記載の方法。 ７ ラウリル硫酸のアルカリ金属塩としてラウリ
   ル硫酸ナトリウムを使う前項６に記載の方法。 ８ 等張性溶液による処理工程で使うタンパク質
   として血清アルブミンを使う前項２に記載の方
   法。 ９ 最終試料においてタンパク質／球状体化剤の
   重量比が約50：１であり、そして球状体化剤の全
   濃度が約３mg／100mlであるものとする前項２に
   記載の方法。 １０ 体積変化なしに球状体化した赤血球を含む
   最終試料を、赤血球の計数と体積測定のために光
   散乱測定にかける前項２に記載の方法。 １１ 連続的自動化方法で行う前項２に記載の方
   法。 １２ 不連続のまたは各個別の方法で行う前項２
   に記載の方法。 １３ 第２の等張性溶液による処理工程の代り
   に、アリコート試料を固定剤含有等張性溶液で処
   理する（ここで第１の希釈工程の後に生成するア
   リコートは内因性タンパク質／球状体化剤重量比
   が約20：１〜約70：１そして球状体化剤濃度が約
   ２mg／100ml〜約10mg／100mlであることを特徴と
   するものとする）ことから成る前項１に記載の方
   法。 １４ 固定剤溶液として、0.1重量％〜0.4重量％
   の最終グルタルアルデヒド濃度を与える量でグル
   タルアルデヒドを含有する固定剤溶液を使う前項
   １３に記載の方法。 １５ 固定剤溶液として、等張性に調整した塩類
   液または塩類液−球状体化剤混合物を含むものを
   使う前項１３に記載の方法。 １６ 塩類液−球状体化剤混合物を使う前項１５
   に記載の方法。 １７ 全血液試料として、希釈剤としての塩類液
   で試料の約50容量％になるように予備希釈したも
   のを使う前項１３に記載の方法。 １８ 第１の等張性溶液による結合工程によつ
   て、元の試料を約１：50のにさらに希釈する前項
   １７に記載の方法。 １９ 固定工程によつて、元の試料を約１：1000
   の容量比にさらに希釈する前項１７に記載の方
   法。 ２０ 希釈工程での球状体化剤として、アルキル
   基が炭素原子10〜16個を含む硫酸アルキルのアル
   カリ金属塩を使う前項１７の記載の方法。 ２１ 硫酸アルキル塩としてラウリル硫酸のアル
   カリ金属塩を使う前項２０の記載の方法。 ２２ ラウリル硫酸のアルカリ金属塩としてラウ
   リル硫酸ナトリウムを使う前項２１に記載の方
   法。 ２３ 内因性タンパク質として血漿タンパク質を
   使う前項１７に記載の方法。 ２４ 内因性タンパク質／球状体化剤の重量比
   （固定剤添加前）は約50：１であり、球状体化剤
   の全濃度は約３mg／100mlであるものとする前項
   １７に記載の方法。 ２５ 固定した球状体化した赤血球を含有する最
   終試料を赤血球の計数と体積測定のために光散乱
   測定にかける前項１７に記載の方法。 ２６ 連続的自動化方法で行う前項１７に記載の
   方法。 ２７ 不連続なまたは各個別の方法で行う前項１
   ７に記載の方法。