【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、エネルギーを節減して低温域でメタ
ン発酵する方法に関するものである。
更に詳細には、本発明は、新規分離菌であるメ
タノコツカス属に属する非海洋性低温発酵性菌を
用いて、エネルギーを節減した低温域でメタン発
酵せしめる方法に関するものである。
一般に、メタン発酵法は20世紀初期より都市下
水汚泥の処理法として発達し、実用化されてきた
が、特に近年になつて、エネルギーの節減と生成
したメタンを回収することから注目されるように
なつてきた。すなわち、産業廃水処理の観点から
は、嫌気性発酵であるため、好気性処理法と比較
して所要動力の少ないこと、余剰汚泥があまり出
ないことなどの利点がある。また、未利用廃棄物
等からメタンをエネルギー源として回収できると
の観点から研究も盛んに行われてきている。
従来、メタン発酵は高温（50〜55℃）発酵法及
び中温（30〜40℃）発酵法で行われている。しか
し、中温発酵法でも発酵槽を加温しなければなら
ないし、特に寒い北海地などでは、発酵適温まで
加温するエネルギーをかなり必要としているよう
に、その加温エネルギーは、寒冷地におけるメタ
ン発酵法を困難にしているのである。
本発明者らは、寒冷地におけるメタン発酵を可
能とするために、低温発酵性菌を求めて鋭意探索
したところ、全く新規で、新種と認められる非海
洋性低温発酵性菌を４株単離することに成功した
のである。
本発明は、ここに単離された非海洋性低温発酵
性菌によつて完成されたもので、メタノコツカス
属に属する非海洋性低温発酵性菌を培養すること
を特徴とするメタン発酵法である。
従来、メタン発酵で20〜25℃で培養できる菌と
してはメタノゲニウム、・カリアシ
（Methanogenium Cariaci）が知られているだけ
であるが、この菌は海洋性メタン細菌であつて、
食塩濃度1.5％以上ないと生育できない。しかし、
産業廃水処理、未利用廃棄物からのエネルギー回
収を目的としてメタン発酵を行う場合、食塩を必
要としない非海洋性のメタン細菌でなければなら
ない。
本発明者らは、20〜25℃でも効率よくメタンを
生産できる非海洋性のメタン細菌取得を目的とし
て、北海道地方の原野、沼地、湿原などからメタ
ン細菌の分離検索を行い、非海洋性低温発酵性菌
を４株分離することに成功したのであるが、これ
ら４株すべて球菌であつて、メタノコツカス
（Methanococcus）属に属すものと認められるも
のである。これら４株は、メタン細菌８−Ｇ（微
工研菌寄第7873号）、メタン細菌８−Ｍ（微工研菌
寄第7874号）、メタン細菌８−Ｐ（微工研菌寄第
7875号）、メタン細菌16−11−Ｌ（微工研菌寄第
7876号）として微工研に寄託されている。次に、
これら菌株の菌学的性質を示す。なお、ここで用
いた基本培地は次に示す組成を有し、この培地を
用い、気相を水素／炭酸（80％／20％）２気圧に
して、試験管内（培地15ml）で培養し、各試験を
行つた。
The present invention relates to a method for methane fermentation in a low temperature range while saving energy. More specifically, the present invention relates to a method of carrying out methane fermentation in a low temperature range while saving energy using a newly isolated non-marine low-temperature fermenting bacterium belonging to the genus Methanococcus. In general, methane fermentation has been developed and put into practical use as a treatment method for urban sewage sludge since the early 20th century, but in recent years it has been attracting attention for its ability to save energy and recover the methane produced. I'm getting old. That is, from the viewpoint of industrial wastewater treatment, since it is an anaerobic fermentation method, it has advantages such as requiring less power and producing less surplus sludge than an aerobic treatment method. Furthermore, research is being actively conducted from the perspective of recovering methane from unused waste as an energy source. Conventionally, methane fermentation has been carried out using a high temperature (50 to 55°C) fermentation method and a medium temperature (30 to 40°C) fermentation method. However, even with the medium-temperature fermentation method, the fermenter must be heated, and in particularly cold regions such as Hokkaido, a considerable amount of energy is required to heat the tank to the appropriate temperature for fermentation. It makes the law difficult. In order to enable methane fermentation in cold regions, the present inventors conducted an intensive search for low-temperature-fermenting bacteria and isolated four strains of non-marine low-temperature-fermenting bacteria that were recognized as completely novel and new species. He succeeded in doing so. The present invention was completed using the non-marine cold-fermenting bacteria isolated here, and is a methane fermentation method characterized by culturing the non-marine cold-fermenting bacteria belonging to the genus Methanococcus. . Conventionally, Methanogenium Cariaci is the only known bacterium that can be cultured at 20-25°C for methane fermentation, but this bacterium is a marine methane bacterium.
It cannot grow unless the salt concentration is 1.5% or higher. but,
When methane fermentation is performed for the purpose of industrial wastewater treatment or energy recovery from unused waste, it must be a non-marine methane bacterium that does not require salt. The present inventors isolated and searched for methane bacteria from fields, swamps, wetlands, etc. in the Hokkaido region, with the aim of obtaining non-marine methane bacteria that can efficiently produce methane even at 20 to 25 degrees Celsius. We succeeded in isolating four strains of fermentative bacteria, all of which are cocci and are recognized to belong to the genus Methanococcus. These four strains are Methanobacterium 8-G (February Institute of Technology No. 7873), Methanobacterium 8-M (February 7874), and Methanobacterium 8-P (February Microorganisms of Japan No. 7874).
No. 7875), Methanobacterium 16-11-L (No.
No. 7876) and has been deposited with the Institute of Fine Technology. next,
The mycological properties of these strains are shown. The basic medium used here has the following composition, and using this medium, culture in a test tube (medium 15 ml) with the gas phase set to 2 atm of hydrogen/carbonic acid (80%/20%). Each test was conducted.
【表】【table】
【表】
メタン細菌８−Ｇの菌学的性質は次の通りであ
る。
ａ 球菌であり、大きさは0.6〜1.3μである。
ｂ ベン毛なし。運動性なし。
ｃ PH依存性は、PH７〜８が最適で、PH5.5以下
では生育しない。また、PH９以上では生育しな
い。
ｄ 水素及び二酸化炭素を生育及びメタン生成に
必要とする。酢酸などは生育に必要としない。
気相を窒素／二酸化炭素（80％／20％）にする
と、培地中に蟻酸、酢酸などがあつてもメタン
を生成せず、また生育もしない。
ｅ 基本培地における10〜40℃の各温度における
１ケ月の培養におけるメタン発生量は第１図に
示される。30℃が最適温度で、20〜40℃でメタ
ン発酵が可能である。
ｆ 本菌株の培養液に350nｍ付均の光を照射す
ると青白色の蛍光を発し、420nｍ付近の光を
照射すると黄緑色の蛍光を発する。
ｇ 培地中にバンコマイシン100μｇ／ml入れて
も、これらの菌株は生育阻害、メタン生成阻害
共におこらない。
ｈ 一般嫌気性菌用培地のAC培地（Difco社
製）、チオグリコレート培地等で生育しない。
ｉ 絶対嫌気性菌である。
ｊ ２−メチルブチレイト、コエンザイムＭなど
要求しない。
次に、メタン細菌８−Ｍの菌学的性質を示す。
ａ 球菌であり、大きさは0.6〜1.2μである。
ｂ ベン毛なし。運動性なし。
ｃ PH依存性は、PH７〜８が最適で、PH5.5以下
では生育しない。また、PH９以上では生育しな
い。
ｄ 水素及び二酸化炭素を生育及びメタン生成に
必要とする。酢酸などは生育に必要としない。
気相を窒素／二酸化炭素（80％／20％）にする
と、培地中に蟻酸、酢酸などがあつてもメタン
を生成せず、また生育もしない。
ｅ 基本培地における10〜40℃の各温度における
１ヶ月の培養におけるメタン発生量は第２図に
示される。30℃が最適温度で、20〜40℃でメタ
ン発酵が可能である。
ｆ 本菌株の培養液に350nｍ付近の光を照射す
ると青白色の蛍光を発し、420nｍ付近の光を
照射すると黄緑色の蛍光を発する。
ｇ 培地中にバンコマイシン100μｇ／ml入れて
も、これらの菌株は生育阻害、メタン生成阻害
共におこらない。
ｈ 一般嫌気性菌用培地のAC培地（Difco社
製）、チオグリコレート培地等で生育しない。
ｉ 絶対嫌気性菌である。
ｊ ２−メチルブチレイト、コエンザイムＭなど
要求しない。
次に、メタン細菌８−Ｐの菌学的性質を示す。
ａ 球菌であり、大きさは0.6〜1.5μである。
ｂ ベン毛なし。運動性なし。
ｃ PH依存性は、PH７〜８が最適で、PH5.5以下
では生育しない。また、PH９以上では生育しな
い。
ｄ 水素及び二酸化炭素を生育及びメタン生成に
必要とする。酢酸などは生育に必要としない。
気相を窒素／二酸化炭素（80％／20％）にする
と、培地中に蟻酸、酢酸などがあつてもメタン
を生成せず、また生育もしない。
ｅ 基本培地における10〜40℃の各温度における
１ヶ月の培養におけるメタン発生量は第３図に
示される。30℃が最適温度で、20〜40℃でメタ
ン発酵が可能である。
ｆ 本菌株の培養液に350nｍ付近の光を照射す
ると青白色の蛍光を発し、420nｍ付近の光を
照射すると黄緑色の蛍光を発する。
ｇ 培地中にバンコマイシン100μｇ／ml入れて
も、これらの菌株は生育阻害、メタン生成阻害
共におこらない。
ｈ 一般嫌気性菌用培地のAC培地（Difco社
製）、チオグリコレート培地等で生育しない。
ｉ 絶対嫌気性菌である。
ｊ ２−メチルブチレイト、コエンザイムＭなど
要求しない。
次に、メタン細菌16−11−Ｌの菌学的性質を示
す。
ａ 球菌であり、大きさは0.4〜1.2μである。
ｂ ベン毛なし。運動性なし。
ｃ PH依存性は、PH７〜８が最適で、PH5.5以下
では生育しない。また、PH９以上では生育しな
い。
ｄ 水素及び二酸化炭素を生育及びメタン生成に
必要とする。酢酸などは生育に必要としない。
気相を窒素／二酸化炭素（80％／20％）にする
と、培地中に蟻酸、酢酸などがあつてもメタン
を生成せず、また生育もしない。
ｅ 基本培地における10〜40℃の各温度における
１ヶ月の培養におけるメタン発生量は第４図に
示される。30℃が最適温度で、20〜40℃でメタ
ン発酵が可能である。
ｆ 本菌株の培養液に350nｍ付近の光を照射す
ると青白色の蛍光を発し、420nｍ付近の光を
照射すると黄緑色の蛍光を発する。
ｇ 培地中にバンコマイシン100μｇ／ml入れて
も、これらの菌株は生育阻害、メタン生成阻害
共におこらない。
ｈ 一般嫌気性菌用培地のAC培地（Difco社
製）、チオグリコレート培地等で生育しない。
ｉ 絶対嫌気性菌である。
ｊ ２−メチルブチレイト、コエンザイムＭなど
要求しない。
これら菌株の属する分類学的位置をバージエイ
ズ・マニユアル・オブ・デターミネイテイブ・バ
クテリオロジー第８版により求めると、いずれも
球菌であり、メタン生成菌であるところから、メ
タノコツカス属に属することは明らかと認められ
る。しかし、現在、メタノコツカス属に属する菌
株としてはメタノコツカス・バンニレイ
（Methanococcus vannielii）、メタノコツカス・
ボルタ（Methanococcus voltae）の２種がある
が、両種とも生育最適温度が32℃から40℃にあ
り、そして20〜25℃におけるメタン発酵がほとん
ど不可能であるのに対し、本発明における単離菌
株は、いずれも30℃付近に生育最適温度があり、
かつ、20〜25℃におけるメタン発酵が可能である
点で全く相違し、メタノコツカス属に属する新種
と認められるものである。
本発明におけるメタン発酵には、単離された４
株、即ち、メタン細菌８−Ｇ、メタン細菌８−
Ｍ、メタン細菌８−Ｐ、メタン細菌16−11−Ｌの
いずれか１株もしくは２株以上の混合菌、あるい
は、１株又は２株以上を主発酵菌として添加した
メタン発酵菌群が使用される。
種菌の嫌気培養には、先述の基礎培地又は各種
食品加工廃水等が適宜使用される。また、メタン
発酵には、各種食品加工廃水、下水道廃水等、有
機質を含有する廃水であればいかなる廃水も20〜
25℃程度で使用することができる。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例 １
固形物含量5.68％の余剰汚泥をメタン発酵する
ために、通常の中温発酵の種培養液を用いた場合
に比較して、メタン細菌８−Ｇ、メタン細菌８−
Ｍ、メタン細菌８−Ｐ、メタン細菌16−11−Ｌを
優占種とした種培養液を１とし、中温発酵用種培
養液を６の割合で行うと20℃では約４培、25℃で
は約６培、それぞれメタンガス発生速度は増大し
た。[Table] The mycological properties of Methanobacterium 8-G are as follows. a It is a coccus, and the size is 0.6 to 1.3μ. b No hair. No motility. c PH dependence is optimal at PH 7-8, and does not grow below PH 5.5. Also, it does not grow at pH 9 or higher. d Requires hydrogen and carbon dioxide for growth and methane production. Acetic acid etc. are not required for growth.
If the gas phase is nitrogen/carbon dioxide (80%/20%), methane will not be produced and no growth will occur even if formic acid, acetic acid, etc. are present in the medium. e The amount of methane generated during one month of culture at each temperature of 10 to 40°C in the basal medium is shown in Figure 1. The optimal temperature is 30℃, and methane fermentation is possible at 20-40℃. f When the culture solution of this strain is irradiated with light at a wavelength of 350 nm, it emits blue-white fluorescence, and when it is irradiated with light around 420 nm, it emits yellow-green fluorescence. g Even when 100 μg/ml of vancomycin is added to the medium, these strains do not inhibit growth or methane production. h It does not grow in AC medium (manufactured by Difco), a general anaerobic culture medium, thioglycollate medium, etc. i It is an obligate anaerobic bacterium. j 2-Methylbutyrate, Coenzyme M, etc. are not required. Next, the mycological properties of Methanobacterium 8-M will be shown. a It is a coccus, and the size is 0.6 to 1.2μ. b No hair. No motility. c PH dependence is optimal at PH 7-8, and does not grow below PH 5.5. Also, it does not grow at pH 9 or above. d Requires hydrogen and carbon dioxide for growth and methane production. Acetic acid etc. are not required for growth.
If the gas phase is nitrogen/carbon dioxide (80%/20%), methane will not be produced and no growth will occur even if formic acid, acetic acid, etc. are present in the medium. e The amount of methane generated during one month of culture at each temperature of 10 to 40°C in the basal medium is shown in Figure 2. The optimal temperature is 30℃, and methane fermentation is possible at 20-40℃. f When the culture solution of this strain is irradiated with light around 350 nm, it emits blue-white fluorescence, and when it is irradiated with light around 420 nm, it emits yellow-green fluorescence. g Even when 100 μg/ml of vancomycin is added to the medium, these strains do not inhibit growth or methane production. h It does not grow in AC medium (manufactured by Difco), a general anaerobic culture medium, thioglycollate medium, etc. i It is an obligate anaerobic bacterium. j 2-Methylbutyrate, Coenzyme M, etc. are not required. Next, the mycological properties of Methanobacterium 8-P will be shown. a It is a coccus, and the size is 0.6 to 1.5μ. b No hair. No motility. c PH dependence is optimal at PH 7-8, and does not grow below PH 5.5. Also, it does not grow at pH 9 or above. d Requires hydrogen and carbon dioxide for growth and methane production. Acetic acid is not required for growth.
If the gas phase is nitrogen/carbon dioxide (80%/20%), methane will not be produced and no growth will occur even if formic acid, acetic acid, etc. are present in the medium. e The amount of methane generated during one month of culture at each temperature of 10 to 40°C in the basal medium is shown in Figure 3. The optimal temperature is 30℃, and methane fermentation is possible at 20-40℃. f When the culture solution of this strain is irradiated with light around 350 nm, it emits blue-white fluorescence, and when it is irradiated with light around 420 nm, it emits yellow-green fluorescence. g Even when 100 μg/ml of vancomycin is added to the medium, these strains do not inhibit growth or methane production. h It does not grow in AC medium (manufactured by Difco), a general anaerobic culture medium, thioglycollate medium, etc. i It is an obligate anaerobic bacterium. j 2-Methylbutyrate, Coenzyme M, etc. are not required. Next, the mycological properties of Methanobacterium 16-11-L will be shown. a It is a coccus, and the size is 0.4 to 1.2μ. b No hair. No motility. c PH dependence is optimal at PH 7-8, and does not grow below PH 5.5. Also, it does not grow at pH 9 or higher. d Requires hydrogen and carbon dioxide for growth and methane production. Acetic acid is not required for growth.
If the gas phase is nitrogen/carbon dioxide (80%/20%), methane will not be produced and no growth will occur even if formic acid, acetic acid, etc. are present in the medium. e The amount of methane generated during one month of culture at each temperature of 10 to 40°C in the basal medium is shown in Figure 4. The optimal temperature is 30℃, and methane fermentation is possible at 20-40℃. f When the culture solution of this strain is irradiated with light around 350 nm, it emits blue-white fluorescence, and when it is irradiated with light around 420 nm, it emits yellow-green fluorescence. g Even when 100 μg/ml of vancomycin is added to the medium, these strains do not inhibit growth or methane production. h It does not grow in AC medium (manufactured by Difco), a general anaerobic culture medium, thioglycollate medium, etc. i It is an obligate anaerobic bacterium. j 2-Methylbutyrate, Coenzyme M, etc. are not required. When the taxonomic position of these strains was determined using the 8th edition of Verge's Manual of Determinative Bacteriology, it was found that all of them are cocci and methanogens, so it is clear that they belong to the genus Methanococcus. Is recognized. However, currently, the only strains belonging to the genus Methanococcus include Methanococcus vannielii and Methanococcus vannielii.
There are two species of Methanococcus voltae, both of which have optimal growth temperatures between 32 and 40 degrees Celsius, and methane fermentation at 20 to 25 degrees Celsius is almost impossible. All strains have an optimal growth temperature around 30℃.
Moreover, it is completely different in that it is capable of methane fermentation at 20 to 25°C, and is recognized as a new species belonging to the genus Methanococcus. For methane fermentation in the present invention, isolated 4
Strains, namely Methanobacteria 8-G, Methanobacteria 8-
M, Methanobacterium 8-P, Methanobacterium 16-11-L, one strain or a mixture of two or more strains, or a group of methane-fermenting bacteria to which one or two or more strains are added as the main fermenting bacteria is used. Ru. For the anaerobic culture of the inoculum, the above-mentioned basal medium or various food processing wastewaters are used as appropriate. In addition, for methane fermentation, any wastewater containing organic matter, such as various food processing wastewaters and sewage wastewaters, can be used for methane fermentation.
It can be used at around 25℃. Next, examples of the present invention will be shown. Example 1 In order to perform methane fermentation on excess sludge with a solid content of 5.68%, methane bacteria 8-G and methane bacteria 8-
M, Methanobacteria 8-P, and Methanobacteria 16-11-L are the dominant species in the seed culture at a ratio of 1 to 6 for medium-temperature fermentation. In each case, the methane gas generation rate increased for about 6 times.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]
第１図はメタン細菌８−Ｇの発酵適温を表す図
で、第２図はメタン細菌８−Ｍの発酵適温を表す
図で、第３図はメタン細菌８−Ｐの発酵適温を表
わす図で、第４図はメタン細菌16−11−Ｌの発酵
適温を表す図である。
Figure 1 is a diagram showing the suitable fermentation temperature for methane bacteria 8-G, Figure 2 is a diagram showing the suitable fermentation temperature for methane bacteria 8-M, and Figure 3 is a diagram showing the suitable fermentation temperature for methane bacteria 8-P. , FIG. 4 is a diagram showing the optimum temperature for fermentation of methane bacteria 16-11-L.