JPH0355104B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明はリン病の診断テスト法、ナイセリア・
ゴノローエア（Neisseria gonorrhoeae、リン
菌）のテスト用株ATCC31953およびそれを用い
たテストキツトに関する。 リン病の標準的な診断はリン菌を分離し、つい
で、コロニーの形態、鏡検、生化学的テストまた
は血清学的テストによりリン菌を同定することに
基く（Kellog，Jr.et al.，Laboratory
Diagonosis of Gonorrhea，Cumitech，Amer.
soc.Microbiol.，1976）。 グラム染色試験がリン菌性尿道炎の診断テスト
に使用できるが、この技術は頚部、直腸部または
口腔咽頭部の感染の検出に対しては感度を欠く。
血清学的テストまたは直接蛍光抗体染色法のよう
な他の診断法はその有効性がまだ確立されていな
い。 リン菌は比較的速かに生育性を喪欠するので、
リン菌を分離する最良の方法はできるだけ迅速に
検体を培養することである。これには、接種した
培地を炭酸ガス雰囲気中、約35°〜37℃にてイン
キユベートすることが必要で、そのため特別な装
置を要する。適当な装置が入手しえない場合に
は、検体をアミエス（Amies）もしくはスチユア
ート（Stuart）の輸送培地またはトランスグロウ
（Transgrow）のような輸送増殖培地に入れ研究
所に送ることができる（Martim，Lester，
HSMHA Health rep.86：30，1971）。しかし、
これら後者の方法は、リン菌の検出に約90〜95％
の感度を示す直接培養法に匹敵するにはほど遠い
ものである（Schmaly，Martin.J.Am.Med.
Assoc.210：312，1969；Caldwell，Price，
Pazin，Cornelius，Am.J.Obster.Gynecol.109：
463，1971）。 1976年に形質転換テストが報告され、されは臨
床的単離物をリン菌と同定するのに使用できるこ
とから、リン病の診断に貢献した（Janik，Juni，
Huym，J.Clin.Microbiol.４：71；米国特許第
3930950号）。形質転換テストはリン菌DNAの検
出に基くもので、コロニーの単離に基く培養法に
匹敵する。予備的な実験室的研究では、該技術
は、リン菌のコロニー同定法にとつて代りうる基
本的技術であることがわかつた（Bawdon，
Juni，Britt，J.Clin.Microbiol.５：108，1977；
Sarafian，Young，J.Med.Microbiol.13：291，
1980）。しかし、ザ・センター・フオー・デジー
ス・コントロール（the Center for Disease
Control）と協同して臨床患者から得た検体を用
いて行なつた実地試験では、該テストはリン病感
染の診断には感度がわるく、特異的でないことが
判明した。 このジユニ（Juni）の形質転換テストはコロニ
ーまたは検体中のリン菌からのDNAがリン菌の
テスト用菌株の栄養欠損性（すなわち、このテス
ト用菌株はある種の栄養源を与えない限り、ある
特定のテスト培地上では増殖できない）を矯正す
る遺伝子を含むことに基く。この株はリン菌
DNA（遺伝子）をそのゲノムに取り込むことがで
き、かかる遺伝子により形質転換され、該特定の
培地上で増殖できるようになる。しかし、もし、
コロニーまたは検体中のリン菌およびテスト用菌
株が同じ栄養欠損性を有していると、該株は形質
転換できず、該特定の培地上で増殖できず、した
がつて、コロニーまたは検体からのリン菌DNA
の検出が妨げられる。ヒトに感染するリン菌の
種々の栄養変異株の存在が知られているため
（Crawford，Sex.Trans.Dis.５：165，1978）、明
らかなごとく、あらゆるテスト事情における種々
の可能性を保証するためには、このジユニのテス
トでは異なつた栄養欠損性を有する一連のテスト
用菌株が必要となる。 ジユニのテストは２種類の培地を必要とする
が、そのうちの１つは非常に特殊なものであつて
通常の診断テスト実験室では入手できない。
DNA抽出技術には、テスト用菌株に対して毒性
限界となるような濃度の、ドデシル硫酸ナトリウ
ムとような界面活性剤の使用が必要である。これ
は本質的に陽性であるべき結果を陰性にさせう
る。また、形質転換技術には該DNAとテスト用
菌株をまず最初に所定時間インキユベートし、つ
いで該DNA−テスト用菌株混合物を特殊な培地
上で福次培養する操作が包含される。24時間のイ
ンキユベーシヨン後では、このテスト結果は裸眼
でわずかにみとめられる程度である。陽性結果を
示すコロニーの増殖を検出するのには顕微鏡が必
要となる（Bawdon etal.，J.Clin.Micrcbiol.
５：108，1977）。 本発明者は、本発明の新規方法に従つて使用す
ることにより、リン菌DNAの検出によつてなさ
れるリン病の診断テストを正確に行なうことので
きる新規なテスト用菌株であるナイセリア・ゴノ
ローエアATCC31953を見い出した。このテスト
用菌株ATCC31953はアメリカン・タイプ・カル
チヤー・コレクシヨン（Americn Trpe Culture
Collection Rockville，MD）に、ブダペスト条
約の規定により寄託されている。こと新規なテス
ト用菌株は、リン菌にとつて至適と思われる条件
でわずかに生育し、遺伝的組み換えによつて導入
された抗生物質耐性遺伝子を有する。 本発明の方法は、(a)形質転換能のあるリン菌の
テスト用菌株を調製し、(b)患者の検体物質または
純粋培養、混合培養を問わずリン菌の疑のあるコ
ロニーから、リン菌を溶解させる塩基で処理して
DNAを抽出し、(c)工程(b)の抽出物のPHをテスト
用菌株ATCC31953に対して毒性のないPHに調製
し、(d)PHを調整した抽出物をテスト用菌株に、リ
ン菌の増殖に適した生物学的培地に入れる前また
後に作用させ、(e)リン菌の増殖に至適な、かつ、
テスト用菌株には抑制的な条件下、リン菌の増殖
に適した培地で該処理テスト用菌株を保持し、つ
いで、(f)該処理テスト用菌株の増殖を観察する工
程からなる。増殖が観察されることはリン菌
DNAの陽性検出を示す。 本発明はまた、本発明の方法を実行するための
テストキツトを提供するものである。このキツト
は生物学的培地上または培地中、約36℃でほとん
ど増殖しないリン菌のテスト用菌株ATCC31953
を包含し、また、所望により、該テスト用菌株の
増殖を支持することのできる生物学的培地、塩
基、酸、PH指示薬および必要な実験室装備ならび
に材料などのような該テストを行なうのに必要な
他の要素を含んでもよい。 本発明の新規方法はただ１つのテスト用菌株
ATCC31953しか必要としない。この方法はフト
感染を引き起すすべてのリン菌に共通な遺伝的特
異性、すなわち約36℃における増殖能力に基く。
本発明は通常のチヨコレート培地のような生物学
的培地の使用を可能にする。塩基を用いてリン菌
DNAを抽出し、抽出物のPHをテスト用菌株の害
のないPHに酸で調整することにより塩が形成され
るが、これはテスト用菌株に対して毒性は示さな
い。この方法は非常に簡単である。顕微鏡を使用
せずに27〜40時間で陽性結果がみとめられる。
ザ・センター・フオー・デジーズ・コントロール
と協同して行なつた実地試験では、本発明の新規
な方法はリン病診断の培養法と同様な感度と特異
性を有することが判明した。 テスト用菌株ナイセリア・ゴノローエア
ATCC31953 本発明の方法において使用する好ましいテス
ト用菌株であるナイセリア・ゴノローエア
ATCC31953は約30°〜約37℃の温度範囲内にて
炭酸ガス雰囲気中チヨコレート培地上でほとん
ど増殖しない。特に、このテスト用菌株はリン
菌にとつて至適とみなされる条件、すなわち通
常のチヨコレート培地上にて、炭酸ガス雰囲気
中36℃前後の温度にてほとんど増殖しない。 また、このテスト用菌株は５〜10μｇ／ml濃
度のナリジキシン酸に対して低抗性があり、
1000μｇ／ml濃度またはそれ以上のストレプト
マイシンに対して抵抗性がある。ナイセリア・
ゴノローエアATCC31953の分離のための変異
操作および遺伝子組み換え操作を以下に詳細に
説明する。 化学変異誘発物質であるＮ−メチル−N′−
ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを最終濃度が
25μｇ／mlとなるように、コロニータイプ１ま
たは２（Kellog，Peacock，Deacon，Brown，
Pirkle，J.Bacteriol.85：1274，1963）から調
製される通常の実験室で用いられるリン菌株の
約10⁹細胞を含有するGC緩衝液〔デイフコ社
（Difco，Detroit，Michigan）のプロテオー
ス・ペプトンのようなペプトン1.5％、0.028M
二塩基性リン酸カリウムおよび0.007M一塩基
性リン酸カリウムの水溶液）に加える。この変
異誘発物質−細胞懸濁液を37℃の水溶液中で30
分間インキユベーシヨンした後、該懸濁液を遠
心分離して細胞をペレツト状にする。上清液を
除去して変異誘発物質をすてる。ペレツトにし
た細胞をGC緩衝液に再び懸濁する。二度目の
遠心分離を行ない、該ペレツトを再びGC緩衝
液に懸濁する。ついで該懸濁液をGC寒天培地
（ペトリ皿中）（培地100ml中、最終濃度グリコ
ース0.4ｇ、グルタミン0.01ｇ、コカルボキシ
ラーゼ0.00002ｇ、Fe（NO₃）₃・9H₂O 0.0005ｇ
を補足したGC培地ベース（GC緩衝液、0.5％
NaCl、0.1％コーンスターチ、1.0％寒天）に塗
布する。該ペトリ皿を30℃にて一夜インキユベ
ートし、ついで37℃にてさらに一夜インキユベ
ートする。小さいコロニーを取り出し、GC寒
天培地上で37℃にて盛んに増殖する能力のない
ことを試験する。このようにして、本発明の方
法に有用と判断されるリン菌の増殖不良変異株
を分離し、特定の抗生物質耐性を有するテスト
用菌株を得るのに用いる。抗生物質耐性遺伝子
を以下の方法によりこの変異株に導入する。 DNAを、５〜10μｇ／ml濃度のナリジキシ
ン酸に対する耐性を与えるNal遺伝子を含むリ
ン菌のRW−２株から抽出する（Wharton，
Zubrzycki，J.Bacteriol.127：1579，1976）。
該DNA抽出操作は、GC緩衝液中RW−２株懸
濁液（約１×10⁸細胞／ml含有）に最終濃度が
0.1Nとなるように水酸化ナトリウムを加える
ことにより行なわれる。ついで抽出物を塩酸で
中和する。 RW−2DNAを含有する上記中性抽出物の0.2
mlを約10^-3Mの塩化カルシウムを含むGC緩衝
液中の該変異株の懸濁液1.8ml（約１×10⁸細
胞／ml）に加える。DNA−細胞混合物を30℃
の水浴中で30分間インキユベーシヨンした後、
該混合液の0.1mlづつをGC寒天培地を含む６枚
のペトリ皿の表面に一様に塗布する。キヤンド
ル・エクスチンクシヨン・ジヤー（candle
extinction jar）中で４時間ペトリ皿をインキ
ユベーシヨンした後、GC寒天培地をペトリ皿
から取り出し、10μｇ／mlのナリジキシン酸を
含むもう１つのGC寒天培地層の上に置く。そ
の頂部にDNA−細胞混合物を有する二層の寒
天培地を炭酸ガス雰囲気中30℃にて約40時間イ
ンキユベートする。出現した多くのコロニー
中、ナリジキシン酸耐性と思われるもの20個を
適当に選び、副次増殖を行なう。この中から最
も好適であるものを１個選んで、本発明方法に
使用する。 上記と実質的同様の方法を用い、リン菌株
24392（Maier，Zubrzycki，Coyle，
Antimocrob，Ag.Chemo.７：676，1975）か
ら抽出したDNAを用い、Nal変異株にStr遺伝
子を導入する。２種の抗生物質、ナリジキシン
酸（５〜10μｇ／ml濃度にて）およびストレプ
トマイシン（1000μｇ／mlまたはそれ以上の濃
度にて）に対して耐性を示す14個の分離物か
ら、本発明の方法に使用するテスト用菌株とし
て最も好適であるナイセリア・ゴノローエア
ATCC31953を選択した。このテスト用菌株で
あるナイセリア・ゴノローエアATCC31953は、
一般に、リン菌（ナイセリア・ゴノローエア）
の通常の株と同様の形態学的および生化学的特
徴を有する。 テスト用菌株の増殖および調製 テスト用菌株は、リン菌に好適な炭酸ガス雰
囲気中、例えば、キヤンドル・エクスチンクシ
ヨン・ジヤー、炭酸ガス・インキユベート、ガ
ス−パツク・システム（Gas−Pac system，
Baltimore，Biological Laboratories，
Cockeysville，Maryland）のような炭酸ガス
発生装置中で30℃にてGC培地の表面上で増殖
させ、本発明方法の使用のために調製される。 一夜インキユベーシヨンした後、寒天平板上
のほとんどのコロニーがコロニータイプ１およ
び／または２（Kellogg，Peacock，Deacon，
Brown，Pirkle，J.Bacteriol.85：1274，1963）
であるコロニー増殖域を滅菌綿棒で取り出し、
マクフアーランド・スタンダード
（MacFarland standard）４番または５番
（Lennette，Spaulding，Tyuant，Mannual
of Clinical Microbiol.，Amer.Soc.
Microbiol.，933，1974）に等しい懸濁液を調
製するために、10〜20％のグリセリンを含む10
〜20mlの容量のGC緩衝液中に挿入する。コロ
ニータイプ１また２の選択は、調製物中におけ
るテスト用菌株がその能力の至適状態、すなわ
ち、形質転換にとつて必要なDNAの至適取り
込み状態にあることを確実にするために必要で
ある。 本懸濁液を５ml量づつ試験管に取り、順次−
70℃のフリーザー中に入れて必要な時まで保管
する。本発明方法にとつて必要な時に、試験管
を37℃の水浴中に入れ該懸濁液を解かす。 新たに調製したテスト用菌株の懸濁液を用い
てもよい。この場合、懸濁液を濁度はマクフア
ーランド１番の1/4から４番までのいずれでも
よい。該懸濁溶媒は、グリセリンを含む必要は
ない。冷凍−解凍したものおよび新たに調製し
たものが、本発明の方法に使用するテスト用菌
株の好ましい調製物である。 第３の別法としては、テスト用菌株の凍結乾
燥調製物から調製された懸濁液を使用すること
である。マクフアーランド５番または６番の濁
度の懸濁液を、大体、1.5％ペプトン、0.04％
Ｌ−グルタミン酸、５％アルブミン、５％血
清、５％グリセリン、0.2％沈澱、0.4％グルコ
ース、10％シヨ糖を含有する溶媒中で調製し、
これを水酸化カリウムでPH約7.2に調製する。
ついで該懸濁液を凍結乾燥する。 凍結乾燥調製物をGC緩衝液中で復元して、
直ちに使用するか、または、100ml当り、グル
コース0.4ｇ、グルタミン0.01ｇ、コカルボキ
シラーゼ0.00002ｇ、Fe（NO₃）₃・9H₂O 0.0005
ｇの増殖補足物を含有するGC緩衝液中で復元
する。後者の方法においては、復元された懸濁
液は使用前に、炭酸ガス雰囲気中、30℃にて４
〜６時間インキユベートする。凍結乾燥したテ
スト用菌株をインキユベーシヨンした後に用い
ると、より好ましい結果が得られる。すなわ
ち、陽性テストにおいて凍結乾燥した調製物を
直接使用するよりもコロニーが多くなる。 以上、寒天含有培地、ことに、GC寒天培地
上でのテスト用菌株の増殖について述べたが、
これはテスト用菌株のその他の培地上または培
地中での増殖を排除するものではない。例えば
フラスコまたは醗酵槽中の液体培地を用いても
よい。また、グリセリンの有無にかかわらず
GC緩衝液を用いることは述べたが、生または
凍結乾燥したテスト用菌株の生育性を保つのに
好適なその他の適当な溶媒を排除するものでも
ない。さらに、テスト用菌株の凍結乾燥におい
て特定の溶媒に言及したが、他の好適な溶媒を
排除するものでもない。テスト用菌株が抗生物
質に対して耐性を示す場合、テスト用菌株を調
製する際に用いられるいずれの液体または固体
の培地にその抗生物質を添加することができ
る。例えば、ATCC31953株の凍結ロツトに、
ナリジキシン酸5μｇ／mlおよびストレプトマ
イシン1000μｇ／mlを加えておき、該ロツトを
順次使用する際の汚染を防ぐことができる。用
心のために、通常、これらの抗生物質を
ATCC31953株の懸濁液を調製するのに用いら
れるGC緩衝液にグリセロールの有無にかかわ
らず添加し、また該テスト用菌株を凍結乾燥す
る溶媒にも加える。 抽出および中和 DNA抽出物の調製は患者の検体材料または
疑いのあるコロニーを、リン菌を分解する塩基
中に入れ、ついで抽出時のPHを酸を用いてテス
ト用菌株に毒性を示さないPHに調製することを
包含する。変法として、検体材料またはコロニ
ーのGC緩衝液中懸濁液を調製し、ついで塩基
および酸をその懸濁液に加えてもよい。いずれ
の場合でも、一般に、調製された抽出物は加熱
される。好ましい塩基および酸は水酸化ナトリ
ウムおよび塩酸である。 水酸化ナトリウムおよび塩酸溶液は市販の
10Nまたは1N水酸化ナトリウム溶液および37
〜38％または1N塩酸溶液をGC緩衝液で希釈し
て調製する。この緩衝液中で水酸化ナトリウム
および塩酸を希釈することは重要な工程であ
る。緩衝作用の効果は、PHを6.0以下または8.0
以上に変化させずに水酸化ナトリウムおよび塩
酸の必要量より多少多くまたは少なく使用でき
ることである。このPH範囲は形質転換テストに
おいてテスト用菌株にとつて許容できるもので
ある。水酸化ナトリウムまたは水酸化アンモニ
ウムでも水酸化ナトリウムの代りに用いること
ができる。どのような塩基、例えば、弱有機塩
基でも水酸化ナトリウムの代りに使用しうる。
いずれの酸でも、弱有機酸でさえも塩基を相殺
するのに使用することができる。いずれの場合
でも原理は同じであつて、すなわち、塩基はリ
ン菌を分解してDNAを遊離させるのに使用さ
れ、酸は抽出時のPHをテスト用菌株に対して毒
性を示さないPHに調製するのに用いられる。 GC緩衝液、水酸化ナトリウムおよび塩酸の
量は種々変化しうる。有用な組み合わせは次の
とおりである。0.1N水酸化ナトリウム0.2〜0.3
mlおよび0.05N塩酸0.3〜0.4ml；0.1N水酸化ナ
トリウム0.5mlおよび0.05N塩酸0.6〜0.8ml；GC
緩衝液0.5ml、0.5N水酸化ナトリウム0.1〜0.2ml
および0.2〜0.4N塩酸0.2ml；GC緩衝液0.5ml、
0.4N水酸化ナトリウム0.1mlおよび0.2N塩酸0.1
〜0.2ml。 原則はGC緩衝液、水酸化ナトリウムおよび
塩酸の量をDNAの希釈を最小限にするのに充
分少量であり、かつ、日常の実験室で都合よる
用いられるに充分な量に保持することである。
また、GC緩衝液は、後述する頚部のスワブ検
体のサンプル抽出操作に使用されるけれども、
懸濁液溶媒としては必要とされないことに注目
すべきである。 調製されたDNAがほぼ中性のPHであること
を調べる手段としては、フエノールレツドをそ
の最終濃度0.005％で塩基、酸、GC緩衝液また
はそれらすべて中で用いることである。これ
は、フエノールレツドをその他の有効な濃度で
使用することを排除するものではない。また、
この目的のためにその他の酸−塩基PH指示薬を
用いることを排除するものでもない。 酸−塩基抽出操作を行なつた後、該抽出物を
60〜70℃に10〜15分間加熱する。75℃程度の温
度および30分程度の時間は、結果に何ら明白な
影響も及ばさずに使用できる。リン菌の純粋培
養では、リン菌が塩基処理に対して非常に敏感
なので、加熱操作は必要とされない。このこと
は、混合物溶物や臨床検体中に見られるいくつ
かの他の微生物には該当しない。加熱は塩基処
理から逃れた微生物を不活性化する。 検体またはコロニーの抽出時もしくは抽出後
における汚染をさらに防止するため、テスト用
菌株ATCC31953にとつて許容できる抗生物質
をGC緩衝液中に加える。抗生物質は同様に塩
基および酸に加えることもできる。同様に、本
発明の方法による有用な培地、溶媒のいずれの
ものにも、抗生物質を加えることができる。テ
スト用菌株、ナイセリア・ゴノローエア
ATCC31953に対し、抗生物質はナリジキシン
酸およびストレプトマイシンを各々5μｇ／ml
および1000μｇ／mlの濃度で用いる。該抗生物
質の濃度はテスト用菌株にとつて許容できるな
らこれらの抗生物質をさらに高濃度で使用する
ことを排除するものではない。 エチルアルコールをPH調整したDNA抽出物
に加熱の有無にかかわらず、最終濃度が約70％
となるように加えることができる。アルコール
の使用前に抽出物に約0.01％アルブミンを加え
てもよい。このアルブミンは生じうる沈澱物の
不活性担体の役割をする。該懸濁液を低速で遠
心分離してDNA含有沈澱物をペレツト状にす
るか、あるいは過してフイルター上に集める
ことができる。該沈澱物を少量のGC緩衝液中
に溶解するが、このGC緩衝液はテスト用菌株
にとつて許容できる抗生物質を含んでいてもよ
い。添加するGC緩衝液の量はもとの量の1/10
〜2/10であり、その結果濃縮抽出物が得られ
る。室温にて約10分間置いた後、該濃縮抽出物
は形質転換操作に使用できる。濃縮抽出物の使
用は、陽性テストでは濃縮していない抽出物よ
りもより多くのコロニーを生ずる。 エチルアルコールはもと塩基によつて抽出さ
れる間のDNAの濃縮に用いることができる。
この場合、アルコール−塩基溶液はDNAを抽
出すると同時に沈澱させる。この場合も、所望
により、アルブミンを添加してもよい。該沈澱
物は遠心分離または過により取り出すことが
できる。いずれの場合でも濃縮DNA溶液の最
終濃度がPH0.8以上とならないように残つた塩
基を相殺するために懸濁溶媒、GC緩衝液のPH
を6.0前後とするべきである。 アルコール操作の使用には、アルコールが殺
菌剤として作用して生存する微生物を不活性化
するという効用がある。多くの場合、この効用
により前記抽出操作における加熱を必要としな
い。 サンプル抽出 ここではサンプルの抽出方法を示す。頚部の
スワブを0.5mlGC緩衝液を含む試験管に入れ
る。該頚部スワブを緩衝液と混合し、後の抽出
操作のためにそのままにしておくか、管壁に押
しつけてしぼり、捨てる。得られた粘液および
細胞の懸濁液に0.3N水酸化ナトリウム（0.005
％フエノールレツドを含有）0.2mlを加える。
しばらくして（約30秒程度）、0.2N塩酸0.2ml〜
0.3mlを該抽出物に加える。ついで該試験管を
68℃の水浴中で10分間加熱する。室温まで冷却
したのち、該抽出物を本発明の形質転換操作に
付す。この例は直腸部、尿道部またはその他の
検体を排除するものではない。GC緩衝液また
は塩基溶液にリン菌を導入するのに用いること
のできる塗布棒、接種用白金耳、白金線または
木製、プラスチツク製、金属製または紙製のい
ずれもの道具により、純粋または混合培養から
取り出したリン菌の疑いのあるコロニーについ
ても同様な抽出操作を使用することができる。 形質転換 本発明のテスト方法の形質転換操作は、テス
ト用菌株が許容しうる濃度の抗生物質を含むこ
とのできる生物学的培地上またはその中で約36
℃でほとんど増殖しないテスト用菌株に、調製
したDNA抽出物を作用させることによつて行
なわれる。テスト用菌株に該抽出物を作用させ
る好ましい方法は、通常のチヨコレート寒天平
板上に準備されたテスト用菌株の密生上に抽出
物をスポツトするものである。この密生を調製
するには好ましくは２本の滅菌綿棒を並べ、テ
スト用菌株の懸濁液中に浸すことである。つい
でこれらの綿棒を、抗生物質デイスク感受性テ
スト（Lennette，Spaulding，Traunt，
Manual of Clinical Microbiology，Amer.
Soc.Microbiol.，423.1974）と同様の方法で、
チヨコレート寒天平板の表面上に一様に塗布す
る。 テスト用菌株の密生を有するチヨコレート寒
天平板に接種するには、単一のスワブまたはい
くつかのスワブを用いることができるが、その
他の装置または方法を用いてもよい。 本明細書において市販のチヨコレート寒天平
板培地（Baltimore Biological Loboratory，
Cockeysville，Maryland）を使用しているが、
その他の有用な栄養寒天培地またはチヨコレー
ト寒天培地を排除するものではなく、また、ペ
トリ皿に限らず、その他のタイプの容器中また
は表面を使用してもよい。さらに、栄養寒天培
地またはチヨコレート寒天培地、あるいはテス
ト用菌株が許容しうる濃度の抗生物質を含有
し、その培地上でテスト用菌株が炭酸ガス雰囲
気中36℃前後の温度にてほとんど増殖しないよ
うな他の増殖培地を排除するものでもない。炭
酸水素ナトリウムのようにCO₂に代わることの
できる成分を含む培地を含んでもよい。 テスト用菌株の密生に該抽出物をスポツトし
た後、該チヨコレート寒天平板培地をリン菌の
増殖に適する炭酸ガス雰囲気中36℃前後の温度
にてインキユベートする。27〜40時間インキユ
ベーシヨンした後、陽性のテストでは該抽出物
をスポツトした場所でコロニーの増殖がみられ
る。陰性のテシトでは、スポツトした部分には
何らコロニーの増殖が認められない。 テスト用菌株は密生の形で用いることが好ま
しいが、抑制的条件下、例えば、テスト用菌株
が増殖しえないような温度でリン菌DNAがテ
スト用菌株の検知しうる増殖を刺激するのに使
用できるようないずれもの状態でテスト用菌株
を用いることも本発明範囲のものである。この
ことは、リン菌DNAなしに起りえないテスト
用菌株の増殖に該DNAの存在が寄与する限り、
テスト用菌株とリン菌DNAを含有する液体環
境中、テスト用菌株が許容しうる抗生物質の存
在下または非存在下でもテストを行なうことが
できることを意味する。 データ 本発明方法によるテストの効果は、ザ・セン
ター・フオー・デジース・コントロールと協同
して盲検法が証明されており、その結果は臨床
的培養分析法に匹敵した。女性から採取した頚
部および直腸部検体および男性から採取した尿
道部検体をジヨージア州、デカルプ・カウンテ
イ（DeKalb County，Georgia）の病院に集
めた。各身体部位から２種のスワブを採取し、
１つを直ちに選択培地に入れ該病院で処理し、
他方をペンシルベニア州、フイラデルフイア
（Philadelphia，Pennsylvania）へ郵送して本
発明の方法に従つてテストした。その結果、以
下の陽性（＋）および陰性（−）結果が得られ
た。 【表】 頚部検体に関しては、両方のテストで69検体が
陽性であり、132検体が陰性である。本発明方法
では陽性であるが培養法では陰性な２つの頚部検
体については次の事情がある。すなわち、患者の
頚部から再度検体を採取し、再テストしたとこ
ろ、培養法でも陽性で、また、本発明方法でもや
はり陽性であることが判明した。この患者はリン
菌に感染しているが、再テストに際し、チヨコレ
ート寒天およびバンコマイシン含有タイヤー−マ
ーチン（Thayer−Martin）培地からリン菌を分
離したので、このリン菌はバンコマイシン感受性
であることが明らかとなつた。本発明方法による
テストは、炭酸ガス雰囲気中チヨコレート寒天培
地上の約36℃における増殖能力以外は、ヒト感染
リン菌のどんな特徴にも影響を受けないため、一
回目のテストと同様に二度目のテストでも陽性の
結果が得られる。この点で、リン菌のバンコマイ
シン感受性株が一般的である分野（Windall et
al.，J.Inf.Dis.142，775，1980）のリン病診断テ
ストに本発明方法が非常に価値あるテスト法であ
る。第２の頚部検体はリン菌患者と接触したもの
で、直腸部の培養では陽性であつた。このことは
その患者がリン病でありことを意味する。この場
合、頚部と同様に直腸部も、本発明方法では陽性
であつた。 この情報に基き、妥当な結論は本発明方法には
偽陽性結果がないことである。このテストは培養
法と同様にリン病診断に特異的である。本発明テ
ストの頚部に対する感受性、つまり陽性として検
出される数は培養法の感受性97.3％（71/73）と
同じである。 直腸検体に関して、両テストにおいて26検体が
陽性であり、128検体が陰性である。本発明方法
では陽性であるが、培養法では陰性である４つの
直腸部検体について、それらに対応する頚部検体
はいずれも本発明テスト法においても培養法にお
いても陽性である。したがつて、これらの検体は
リン病患者のものである。これらの４つの直腸部
検体はおそらく偽陰性培養であると思われる。こ
の情報に基いて、本発明方法の直腸検体に対する
感受性は培養法の感受性87.1％（27/31）に比較
して96.8％（30/31）である。 尿道検体に関しては、両テストでは74検体が陽
性であり66検体が陰性である。本発明テスト法で
は陽性であるが、培養法では陰性である２つの尿
道部検体ではリン菌に対して強い陽性である。し
たがつて、該検体はリン病患者からのものであ
る。これらの２つの尿道部検体はおそらく偽陰性
培養であると思われる。この情報に基くと、本発
明方法の尿道部検体に対する感受性は、培養法感
受性97.4％（76/78）と同じである。 上記のデータに加えて、68名の患者を、リン病
の治療後14日以内にその治癒をテストした。両テ
ストともその結果は同様、つまり、患者から採取
した検体は陰性であつた。 本発明方法は好ましくはテストキツトを用いて
行なう。該キツトは基本的に生物学的培地上また
は中で約36℃にてほとんど増殖しないリン菌のテ
スト用菌株ATCC31953の分包かなる。また該キ
ツトは、(a)テスト用菌株の増殖を支持する固体ま
たは液体培地、(b)エタノールを含有するまたはし
ない塩基供給物、(c)酸供給物、(d)PH指示薬および
(e)実験器具または材料を含んでよい。テスト用菌
株は生の培養物または懸濁液として、凍結懸濁液
として、また凍結乾燥または乾燥調製物として供
給してもよい。好ましい生物学的培地はチヨコレ
ート寒天培地またはその他の栄養培地であり、そ
の形または形状は、テスト用菌株がリン菌にとつ
て好適な炭酸ガス雰囲気中36℃前後の温度にてほ
とんど増殖しないいずれのものでもよい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ナイセリア・ゴノローエア（Neisseria
   gonorrhoeae、リン菌）の増殖に適した炭酸ガス
   雰囲気中、約30〜37℃の温度で、チヨコレート寒
   天上でほとんど増殖せず、ナリジキシン酸５〜
   10μｇ／mlおよびストレプトマイシン1000μｇ／
   ml以上の濃度に対して耐性を有するナイセリア・
   ゴノローエアATCC31953。 ２ リン菌の増殖に適した炭酸ガス雰囲気中、約
   30〜37℃の温度で、チヨコレート寒天上でほとん
   ど増殖しない特性を有するリン菌ATCC31953微
   生物の培養調製物であつて、ナリジキシン酸５〜
   10μｇ／mlおよびストレプトマイシン1000μｇ／
   ml以上の濃度に特異的耐性を有する該培養調製
   物。 ３ 該微生物がリン菌の至適増殖条件でリン菌の
   増殖に適した培地上または中で正常に増殖する能
   力を与えるリン菌DNAを受け入れる能力のある
   ものである前記第２項の調製物。 ４ (a)検体またはコロニーから、リン菌を溶解さ
   せる塩基でDNAを抽出し、(b)工程(a)の抽出物の
   PHを、リン菌の増殖至適条件でほとんど増殖せ
   ず、形質転換能を有するリン菌のテスト用菌株
   ATCC31953に毒性を示さない値に調整し、(c)PH
   を調整した抽出物をテスト用菌株に、リン菌の増
   殖に適した生物学的培地に入れる前または後に作
   用させ、(d)リン菌の増殖に至適な、かつ、テスト
   用菌株には抑制的な条件下、リン菌の増殖に適し
   た培地で該処理したテスト用菌株を保持し、つい
   で、(f)該処理テスト用菌株の増殖を観察する工程
   からなることを特徴とする患者の検体または純粋
   培養、混合培養を問わず、リン菌の疑のあるコロ
   ニー中におけるリン菌DNAの存在検定方法。 ５ 工程(c)の前に、工程(b)にてPHを調整した抽出
   物を約60〜75℃で約10〜30分間加熱して残存微生
   物を不活性化する前記第４項の方法。 ６ 工程(C)の前に、PHを調整した抽出物をエタノ
   ールで処理してDNAを沈殿させ、沈殿物を採取
   し、少量のペプトンを含有する緩衝液で復元して
   DNAの濃縮溶液を得る前記第４項の方法。 ７ 該塩基がDNAの抽出および沈殿を同時に行
   なうエタノール−塩基混合物で、ついで、沈殿を
   集め、少量のペプトンを含有する緩衝液で復元
   し、PHを調整したDNAの濃縮溶液を得た後、工
   程(c)を行なう前記第４項の方法。 ８ 塩基が無機または有機塩基で、DNAを含有
   する抽出物のPH調整を無機または有機酸で行なう
   前記第４項の方法。 ９ PHの調整をPH指示薬の存在下に行なう前記第
   ８項の方法。 １０ 塩基が水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
   および水酸化アンモニウムからなる群から選ばれ
   るもので、酸が塩酸である前記第８項の方法。 １１ 塩基および酸をペプトン含有緩衝液中で調
   製する前記第８項の方法。 １２ リン菌の増殖に至適で、かつ、テスト用菌
   株に対して抑制的な条件下、リン菌の増殖に適し
   た寒天培地上にテスト用菌株を密生させる前記第
   ４項の方法。 １３ リン菌の至適増殖条件が、適当な炭酸ガス
   雰囲気中、約36℃の温度で約27〜40時間の培養期
   間である前記第４項の方法。 １４ 培地が普通チヨコレート寒天培地である前
   記第１２項の方法。 １５ チヨコレート寒天培地が、テスト用菌株の
   耐えうる濃度の抗生物質を含有する前記第１４項
   の方法。 １６ チヨコレート寒天培地がナリジキシン酸お
   よびストレプトマイシンからなる群から選ばれる
   抗生物質を含有する前記第１５項の方法。 １７ テスト用菌株が培養増殖、固体培地からの
   生の懸濁液、凍結乾燥または乾燥品および凍結保
   存物の解凍懸濁液からなる群から選ばれる前記第
   ４項の方法。 １８ テスト用菌株の形が該株の耐えうる抗生物
   質を含有するものである前記第４項の方法。 １９ 該塩基および酸がテスト用菌株の耐えうる
   ような濃度の抗生物質を含有する前記第４項の方
   法。 ２０ 生物学的培地上もしくは中、約36℃でほと
   んど増殖しないナイセリア・ゴノローエア
   ATCC31953のテスト用菌株の分包を必須要素と
   してなるリン菌DNA検出用テストキツト。 ２１ (a)テスト用菌株の増殖を支持するための固
   体または液体培地、(b)エタノールを含有するまた
   は含有しない塩基供給物、(c)酸供給物、(d)PH指示
   薬および(e)実験器具または材料からなる群から選
   ばれる１種以上の要素を包含する前記第２０項の
   キツト。