JPH0358279B2 - - Google Patents
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- JPH0358279B2 JPH0358279B2 JP60501530A JP50153085A JPH0358279B2 JP H0358279 B2 JPH0358279 B2 JP H0358279B2 JP 60501530 A JP60501530 A JP 60501530A JP 50153085 A JP50153085 A JP 50153085A JP H0358279 B2 JPH0358279 B2 JP H0358279B2
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- A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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Description
請求の範囲
１ Ａ () グルコース、ラクトースおよびス
クロースのようなヘキソース基を有する糖類
原料を、同種醗酵させて、特に乳酸からなる
第一代謝産物に変換させるラクトバチルス属
の微生物からなる第一微生物成分と、 () 前記のヘキソース源を代謝的に同化でき
ないが、第一微生物の代謝産物である乳酸
を、特にプロピオン酸と酢酸とからなる第二
代謝産物に変換するべイロネラ属の微生物か
らなる第二微生物成分とで、 構成された、多段の継代にわたつて種の集団
の比率を比較的一定に維持する、必須の２つの
微生物成分からなる安定な共同養体を形成し； Ｂ 前記共同培養体を、代謝可能な前記ヘキソー
ス源を含有する、同化可能な栄養培養原料に接
種し； Ｃ 乳酸の大部分を、特に、プロピオン酸、酢
酸、さの塩およびその混合物からなる醗酵産物
に変換するのに充分な期間と条件下で少なくと
も５ミリモル／／hrの醗酵速度にて、前記原
料を前記共同培養体で嫌気醗酵させ； Ｄ ベイロネラ属の微生物が、ラクトバチルス属
の微生物で産生された乳酸を前記醗酵産物を蓄
積するのに充分な期間醗酵し続けるよう混合物
のPHを維持する； ことからなる、プロピオン酸および酢酸を生体外
で産生させる、同時に行う逐次嫌気性醗酵方法。 ２ ヘキソース源が、グルコース、スクロース、
ラクトースおよびその混合物からなる群から選択
される請求の範囲第１項による方法。 ３ ヘキソース源がラクトースである請求の範囲
第２項による方法。 ４ 原料が全ホエーまたは透明化された牛乳ホエ
ーラクトース・パーミエートである請求の範囲第
３項による方法。 ５ ラクトバチルス属の微生物がラクトバチル
ス・カセイである請求の範囲第１項による方法。 ６ ラクトバチルス属の微生物がラクトバチル
ス・カセイ・サブスペシイズ・ラムノススである
請求の範囲第５項による方法。 ７ ベイロネラ属の微生物がベイロネラ・クリセ
テイである請求の範囲第１項による方法。 ８ 共同培養体がATTC寄託番号第39662号の培
養体、またはこれと同じ醗酵特性を有する変異体
である請求の範囲第１項による方法。 ９ 約５モルのプロピオン酸が、醗酵させた乳酸
の８モルから得られる請求の範囲第１項による方
法。 １０ 得られた産物を乾燥して、自由に流動する
粉末を作製することからなる請求の範囲第１項に
よる方法。 １１ 残留微生物を、乾燥工程の前に産物から除
去する請求の範囲第１項による方法。 発明の記載 発明の技術分野 この発明は、同時に起こる２段階の細菌醗酵工
程を利用して炭水化物原料を異化することによ
る、乳酸もしくはその塩、並びにプロピオン酸お
よび／もしくは酢酸もしくはその塩の製造法に関
する。第一段工程において、炭水化物が、例えば
ラクトバチルス・カセイ・サブスペシイズ・ラム
ノスス（Lactobacillus casei subspecies
rhamnosus）のごとき糖類分解細菌によつて乳酸
に変換される。第二段工程では、得られた乳酸
が、第一の細菌の存在下で増殖するのに適する第
二の細菌、例えばベイロネラ・クリセテイ
（Veillonellacriceti）のごとき乳酸異化細菌によ
つて、醗酵させられてプロピオン酸、酢酸、二酸
化炭素及び水素を生成する。 背景技術 プロピオン酸は、セルロースプロピオネート
（熱可塑性物質）の製造におけるエステル化剤、
チーズや他の酪農製品中に自然に発生する細菌醗
酵代謝物として商業的に用いられている。プロピ
ンオン酸カルシウムもしくはプロピオン酸ナトリ
ウムのごとき遊離酸の塩の形態のものは、製造さ
れるエステル溶媒類、果物芳香剤類及び香水ベー
ス類中のみならず、かびの繁殖を防止するために
食品中に防腐剤として用いられる。 プロピオン酸を生産する伝統的な方法は、プロ
ピオニバクテリウム属（the genus
Propionibacterium）の菌株を使用する細菌醗酵
法によつていた。例えば米国特許第1459959号；
1865146号；1875401号；1898329号；1913346号；
1932755号；及び3067107号それぞれの公報参照。
過去30〜40年間で、一酸化炭素とエチレンもしく
はエタノールとの縮合のごとき化学的方法は商業
的に可能であることが分かつてきた。最近、石油
化学による原料の価格が上昇したので、プロピオ
ン酸を含む多くの化学薬品製造用として応用生物
学的原料及び農業原料を再検討するようになつ
た。 プロピオニバクテリウム属のプロピオニ細菌
（Propionibacteria）は伝統的に、細菌醗酵によ
るプロピオン酸の生産に用いられてきた。しかし
プロピオニバクテリウム種を、単独培養体
（monoculture）もしくはラクトバチルスの菌株
との共同培養体（co−culture）として用いると
一般に、プロピオン酸が低レベルであつたり醗酵
物の滞留時間が長くなつたりするかまたは両方の
現象が起つた。これら制限は、プロピオニ細菌が
増殖する前の遅滞期が長いこと、すなわちプロピ
オン酸がプロピオニ細菌の増殖を阻害するのが原
因か、または乳酸産生種のラクトバチルスとの共
同培養の場合には乳酸のプロピオン酸への醗酵過
程においてプロピオニバクテリウム種が炭水化物
を優先的に異化することが原因であろう。 発明の開示 したがつて、この発明の一般的な目的は、プロ
ピオン酸を高収率で得るための微生物の共同培養
体による製造法を提供するものである。 この発明の他の目的は、極めて短い醗酵機内滞
留時間で高収率を与える前記方法を提供すること
である。 この発明のさらに他の目的は、ひとつの微生物
の代謝産物の乳酸が、第二微生物によるプロピオ
ン酸産生用の原料となる製造法を提供することで
ある。 この発明のさらに追加すべき目的は、種々の原
料から得られる乳酸の大部分をプロピオン酸に変
換する前記方法を提供することである。 この発明の一層特別な目的は前記の製法に用い
る微生物類の新規な共同培養体を提供することで
ある。 明細書及び添付された請求の範囲を検討すれ
ば、この発明のその外の目的、特徴及び利点がこ
の発明の関連する技術分野の当業者にとつて一層
明らかになるであろう。 発明を実施するための最良の方法 簡単に述べれば、この発明の前記及び他の目
的、特徴及び利点は次のような方法を提供するこ
とによつてその一態様として達成できる。すなわ
ち、同化できる炭水化物源を含有する栄養増殖培
地原料を、栄養増殖条件下で前記炭水化物を乳酸
に変換しうる第一微生物で醗酵させて生体外で乳
酸を産生させ、その醗酵が、第一微生物との共同
培養体中で増殖するのに適し、醗酵産物の乳酸の
大部分を、プロピオン酸、酢酸及びその塩、並び
にこれらの混合物からなる群から選択される化合
物に変換する第二微生物の追加された存在下で行
われる方法である。 乳酸の微生物による産生に適する原料は、この
技術分野ではよく知られており、先行米国特許類
及び多数の他の刊行物、例えばエム・ブリン
（M.Brin）、Biochem.Prepn.，第３巻、61号、
（1953年）；エス・シイ・プレスコツトら（S.C.
Prescott et al）、インダストリアル マイクロ
バイオロジイ（Industrial Microbiology）（マツ
クグロー・ヒル社、ニユーヨーク、第３版 1959
年）第304〜331頁；アンダーセンら（Andersen
et al）、インダストリアル エンジニアリング
ケミストリイ（Ind.End.Chem.）第34巻、第1522
頁、（1942年）；およびエム・ブリンら（M.Brin
et al）、アナルズ オブ ザ ニユーヨーク ア
カデミイ オブ サイエンス（Ann.N.Y.Acad.
Sci）第119巻、第851〜1165頁（1965年）に記載
のものを含むが、これらに限定されるものではな
い。商業的に使用するにはホエー（whey）、コン
スターチ、いも類及び糖蜜のような原料が一般的
に好ましい。この発明の好ましい原料は、全ホエ
ー（whole whey）、または透明化された牛乳ホ
エー・ラクトース・パーミエート（clarified
dairy whey lactose permeate）からなる原料、
特に1984年３月29日付で公開されたPCT国際公
開第WO 84／01104号公報に記載され請求された
ものが好ましい。 この発明の方法にしたがつて用いられる乳酸産
生微生物を選ぶ場合は勿論、乳酸に変換されるべ
き特定の原料の成分に左右されるが、多くの適切
な微生物はこの技術分野で公知のものである。透
明化された牛乳ホエーラクトースパーミエートは
この発明に用いられる原料として現在好ましいも
のであるから、ラクトバチルス・カセイの特にラ
クトバチルス カセイ サブスペシイズ ラムノ
ススがこの発明の方法の第一段階の現在における
好ましい微生物である。この菌株は広く知られて
おり、当業者ならば例えばジ・アメリカン・タイ
プ・カルチユアー・コレクシヨン（ATCC）、米
国メリーランド州20852、ロツクビル、パークロ
ーン・ドライブ12301から容易に入手できる。 第一微生物の代謝産物の乳酸をプロピオン酸に
変換するための第二微生物を選択する場合には、
乳酸を醗酵させてプロピオン酸や他の最終産物に
変換する性能を有する微生物を選択する必要があ
る。数種のかような細菌は公知であり、そして、
例えば英国特許第1251483号公報、米国特許第
3857971号公報、同第4138498号公報及びハバーら
（Huber et al）、アメリカン ジヤーナル オブ
ベタラネリイ リサーチ（Am.J.Vet.Res.）、
第37巻(5)、第611〜613頁（1976年）に記載された
ごとき目的の技術分野で広く入手できる。かよう
な細菌は公知であり当業者ならば広く入手でき、
メガスフエラ・エルスデニイ（Megasphaera
elsdenii）、ペプトコツカス・アサツカロリテイ
クス（Peptococcus asaccharolylicus）、セレノ
モナス・ルミナテイム（Selenomonas
ruminatium）及びベイロネラ・クリセテイ
（Veillonella criceti）が含まれることがこれに
限定するものではない。この発明に用いる特に適
切な微生物は、同化できる炭水化物源として、乳
酸を優先的に用いるこれらの微生物である。つま
りこれらの微生物はこの性質を示し（フラクトー
スを除いて、ベイロネラ・クリセテイはおそらく
ヘキソキナーゼ酵素を欠いているために炭水化物
を直接醗酵させることはできないようであり、代
りに乳酸のごときモノカルボン酸を増殖基質とし
て利用する）、生体外で急速に増殖する前に長い
遅退時間を示さないからであり、ベイロネラ・ク
リセテイが現在好ましいものである。 原料を連続的に処理して最初乳酸を形成させ次
いでプロピオン酸を形成させることは多くの特有
の困難に遭遇する。第一段階においては産物の乳
酸が蓄積すると、その結果マスバランス効果とPH
の低下によつて原料の変換が遅くなる。PHは調整
することができるが、この調整によつて新たな汚
染の危険が導入され、産物の乳酸の除去によつて
未変換の原料と変換する微生物との両者の除去が
起こる。第二段階では、PHが制御されないと好ま
しくないラクテートの濃縮物が残り、入つてくる
未変化原料が、微生物に対して、好ましくない産
物を形成することになる物質代謝の経路をとる機
会を与える。 この発明によれば、上記およびその外の困難
は、同時の２段階の細菌醗酵法を用いる炭水化物
の異化によつて克服できる。第一段階において、
炭水化物は糖類分解細菌のラクトバチルス・カセ
イ・サブスペシイズ・ラムノススによつて乳酸に
変換される。第二段階において、得られた乳酸は
ベイロネラ・クリセテイによつて醗酵されてプロ
ピオン酸と酢酸、二酸化炭素と水素になる。かよ
うにして形成されたプロピオネート（およびラク
テート）は、適当な溶媒抽出システム、蒸留回収
法、沈澱法によるカチオン性塩の形成法を用い、
または醗酵ブロス培地の濃縮乾燥法（細菌細胞を
除去もしくは除去せずに）によつて回収すること
ができる。 共同培養体の形成 親菌株のCLS917（ラクトバチルス・カセイ・サ
ブスペシイズ・ラムノスス）と1218（ベイロネ
ラ・クリセテイ）は、ストレプトマイシンやリフ
アンピシン上で増殖する共存の抗生物質に耐性の
コロニイ（ラクトバチルス・カセイ・サブスペシ
イズ・ラムノススとしての）またはリフアンピシ
ン上のみで増殖する共存の抗生物質に耐性のコロ
ニイ（ベイロネラ・クリセテイとして）としてそ
れぞれ別々に選択された。ラクトバチルス・カセ
イ・サブスペシイズ・ラムノススとベイロネラ・
クリセテイのこれら突然変異菌株は遺伝標識形質
（すなわち特定の抗生物質に対する耐性）を有す
るが、下記組成：（最終濃度として重量／重量ベ
ースで示した数値）トリプトン（1.0％）；酵母エ
キス（1.0％）；乳酸ナトリウム（2.0％）；システ
イン塩酸塩（0.5％）及び炭酸水素ナトリウム
（0.5％）のトリプトンブロス中での代謝産物の酸
について試験した。酸の最大産生量を示すこれら
の突然変異菌株（CLS917及び1218）が選ばれた。 これらのブロス培養体は、異なる温度で24時間
嫌気的に培養され、両菌株が安定して増殖する最
適条件を決定した。最適温度は、各菌株の生存細
胞（viable cells）数によつて評価され88℃に決
定された。 両突然変異菌株の生存し健康な細菌細胞がホル
ドマンおよびムーア（Holdeman and Moore）、
アネローブ ラボラトリマニユアル（Anaerobe
Laboratory Manual）、第４版、デパートメン
ト・オブ・アネロビツク・マイクロバイオロジイ
（Department of Anaerobic Microbiology）、
バージニア・ポリテクニツク・インステイチユー
ト・アンド・ステイト・ユニバーシテイ
（Virginia Polytechnic Institute and State
University）、ブラツクスバーグ バージニア
24061、に記載されているのと同様にて製造した
切りきざんだ肉のブロス培養培地に添加した。３
日間の間隔をおいて24時間毎のトランスフアーと
継代培養による連続継代の共同培養体は安定な混
合された２種の細菌培養体を示した（第１表参
照）。この共同培養体の安定性は切りきざんだ肉
の各ブロス培養体の二つの細菌の集団（twt
bacterial population）を数えることによつて測
定した。これは固体増殖培地に前記ブロス培養体
の連続稀釈物を接種する標準の方法で行つた。そ
の固体増殖培地は前記トリプトンブロス培地に寒
天を1.5％最終濃度で添加したもので構成されて
いる。この固体培地のPHは蒸気殺菌前に7.0に調
節される（そして殺菌後は6.8〜7.0であることが
観察された）。連続稀釈物を作製するための稀釈
剤は、アネローブ・ラボラトリ・マニユアル第４
版に記載のものであつた。継代培養体は24hr培養
された後にその細菌集団が数えられた。共同培養
体は、二つの微生物の比率が実験誤差の範囲内で
一定であり、いずれの微生物も他の微生物を追抜
くことがないことを示す場合が安定であるとみな
される。 【表】 実験開始時の接種物におけるラクトバチルス・
カセイ菌株CLS917の生存細胞集団の大きさは、
ベイロネラ・クリセテイ菌株1218の集団の大きさ
のほぼ1/2であつた。各３日間の最後におけるこ
れらの二つの集団の比率は比較的一定であつた。
さらに単一のきりきざんだ肉のブロスの共同培養
体を、15の別個の３のバツチ醗酵用接種物とし
て２ケ月間にわたつて用いたところ、その結果同
様の生存細胞比率を有する混合集団が得られら
た。 共同培養体の保管 共同培養体は、殺菌グリセロールとトリプトン
ブロス培養培地（前記の）とを同容積ずつ含有す
るものの0.2mlずつを入れ密封したバイアルビン
中に入れて−80℃で保管することができる。各密
封物は、予め健康な増殖培養体から得た同数の両
菌株を含有すべきである（各々ほぼ１億の細菌細
胞）。ラクトバチルス・カセ・サブスペシイズ・
ラムノススとベイロネラ・クリセテイとのこの共
同培養体は、ジ・アメリカン・タイプ・カルチユ
アー・コレクシヨンに1984年４月９日付けで寄託
され、ATCC寄託番号第39662号として登録され
た。この菌株は貯蔵後、内容物をトリプトンもし
くはきりきざんだ肉のブロス培地に接種すること
によつて再生することができ、38℃で24〜48時間
嫌気性条件下で培養することができる。 代謝産物と産生と用途 適切な栄養培地中ラクトバチルス菌株で醗酵可
能な炭水化物を代謝するとアセテートの産生レベ
ルは低く、ラクテートの産生レベルは高いという
結果になる。次いでそのラクテートは、共同培養
体中に存在するベイロネラ菌株によつて急速に代
謝されてプロピオネート、アセテート、二酸化炭
素及び水素になる。第２表に、ラクトバチルスと
ベイロネラの両菌株の共同培養によつて醗酵され
て、プロピオネート、アセテート、二酸化炭素、
水素及びラクテートに変換しうる一連の炭水化物
基質の一部を示す。 【表】 【表】 ＊ 代謝酸産物は次のように命名される
。
ACET＝酢酸；PROP＝プロピオン酸；及
びLACT＝乳酸、
ND＝検出されなかつた(0.01mg／ml未
満)
揮発性脂肪酸及び不揮発性脂肪酸は、ホルドマ
ン及びムーアによつて記載されたのと同様のガス
−液体クロマグラフイ法によつて測定された（ア
ネローブ・ラボラトリ・マニユアル、第４版、デ
パートメント・オブ・アネロビツク・マイクロバ
イオロジイ；バージニア・ポリテクニツク・イン
ステイチユート・アンド・ステイト・ユニバーシ
テイ・ブラツクスバーグ バージニア 24061）。 この発明の現在の好ましい最良の態様は、前記
二つのブロス培地を用いる安定な共同培養体を提
供するのに充分な栄養増殖培地中、すなわち下記
実施例に記載の培地中で二つの細菌菌株を培養す
る方法である。 具体的にいえば、二つの細菌菌株（エル・カセ
イ、CLS917及びヴイ・クリセテイ1218）の混合
培養体が、菌株CLS917が醗酵させることができ
る炭水化物基質を含有する増殖培地中で培養され
る。かような基質には単糖類、二糖類及び複合多
糖類が含まれるがこれに限定されるものではな
い。加うるに、その増殖培地も、酵母細胞エキス
の0.1〜2.0％溶液中に存在するのと同様のビタミ
ン類源および／またはアミノ酸類源を含有するの
が好ましい。低濃度の、カルボン酸の不阻害性・
無毒性塩を、60ミリモルの最終濃度まで添加する
のが好ましい。 醗酵の条件には次のものが含まれている。すな
わち温度の範囲は一般に20〜40℃であるが好まし
いのは35〜40℃であり、醗酵混合物の撹拌方法は
１分間400回転までの速度であり好ましくは１分
間当り150〜250回転の範囲であり、またPHは一般
に4.0〜9.0の範囲であり最高のプロピオン酸産生
量を得るには5.5〜6.0の範囲が好ましい。加うる
に、その増殖培地は、溶解酸素の濃度を上昇させ
そのため嫌気性代謝を妨げることになる空気流や
気体の交換を防止することによつて酸素の溶解す
るのを防がねばならない。一般に基質の醗酵速度
はほぼ１〜10ミリモル／hrで好ましくは少なくと
も５ミリモル／hrである。 さらに詳細な説明を加えなくても、当業者なら
ば前記の記載を用いてこの発明を十分に利用でき
ると信ずる。それ故に下記の特定の好ましい実施
態様は、単に例示するに過ぎず、いかなる場合で
も下記の開示に限定するものではないと解される
べきである。下記実施例には、温度は摂氏度で記
載され、また異なる指示がなければ、部とパーセ
ンテージはすべて重量で記載されている。 実施例 １ 醗酵のPHの制御 醗酵のPHは、一般に5.0〜9.0または好ましくは
5.3〜7.3の範囲内に維持されなければならない。
ルイス塩基として作用するいくつかの化合物はい
ずれもこの目的のために用いることができる。水
酸化アンモニウム（これにはアンモニアガスが含
まれ、これは水溶液中で水和されて水酸化アンモ
ニウムを形成する）、水酸化ナトリウム、水酸化
カルシウムもしくは水酸化カリウムは醗酵に有害
な影響なしで用いることができる。しかし、二価
の金属の無機酸化物、例えば水酸化カルシウム
（および水溶液中で水和されて対応する水酸化物
を形成するところの対応する酸化物）は、PH制御
剤として一価カチオンの水酸化物よりも良好に作
用するようである。 この実験において、二つの菌株（CLS917と
1218）は、全ホエーもしくは限外過ホエー・パ
ーミエートとして供給されるラクトース（２
％）；酵母エキス（1.0％）；及び前記水酸化物と
同一のカチオンを有する60ミリモル濃度の炭酸塩
緩衝液（これは水酸化アンモニウムとアンモニア
ガスを用いる場合以外のときであり、水酸化アン
モニウムとアンモニアガスを用いる場合は炭酸カ
ルシウムが用いられる）を（培地基準の最終濃度
で）含有する培地３中で培養された。醗酵条件
には、38℃の温度、PH制御試薬の自動もしくは手
動添加によつて5.5〜6.0のPHの維持及びニユー・
ブランズビイツク・フアーメンター（New
Brunswick Fermenter）中で200rpmの速度での
連続的撹拌が含まれる。醗酵液の一部を醗酵開始
時と醗酵4hr、8hr、12hr、24hr及び48hrで取り出
した。これらの試料は、前記方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）及び乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24時間の試料のこ
れら代謝酸産物の濃度（mg／ml）を第３表に示
す。 【表】 実施例 ２ 嫌気生活の維持 菌株CLS917（エル・カセイ）及び1218（ヴイ・
クリセテイ）はともに酸素の存在下では増殖しな
いか（1218）もしくは良好には増殖しない
（CLS917）嫌気性細菌である。しかし新たに水蒸
気殺菌された培地を、微生物の接種前に醗酵温度
に平衡をもたせる一般的な醗酵条件下では、酸素
は事実上排除される。したがつて還元剤、すなわ
ち溶解酸素と結合しうる化学化合物はラクトース
基質のプロピオン酸への効果的な醗酵のためには
必要でなかつた。加うるに、醗酵培地に雰囲気中
の酸素が溶解するのを防ぐため、不活性ガス（窒
素、ヘリウム、二酸化炭素など）を、上部の空間
（醗酵培地の表面上から容器トツプまでの空間）
に充満させるのに用いる必要はなかつた。菌株
1218は醗酵された二糖類の１モル当り1.5モルの
二酸化炭素を規則的に産生するから（単糖類につ
いては１モル当り0.75モルの二酸化炭素）、これ
らの二つの菌株の醗酵には不活性ガスは必要でな
い。菌株1218（ヴイ・クリセテイ）は絶対嫌気性
生物であるから、空気もしくは酸素を噴霧したり
バツブルさせて醗酵培地を参加させないよう注意
しなければならない。 この実験では、二つの菌株（CLS917と1218）
は、全ホエーもしくは限外過ホエーパーミエー
トとして供給されているラクトース（２％）；酵
母エキス（1.0％）；および60ミリモル濃度の炭酸
カルシウム溶液を含有する培地の３中で培養さ
れた。醗酵条件には、温度38℃、自動もしくは手
動でのPH制御剤の添加によるPH5.5〜6.0の維持及
びセル・スター・ジヤー（ベルコ・グラス・カン
パニイ）〔Cell Stir Jar（Bellco Glass Co.）〕中
での200rpmの速度での連続的撹拌が含まれる。
培養液の一部を醗酵開始時と醗酵4hr、8hr、
12hr、24hr及び48hrに取り出した。これらの試料
は、前記方法を用いて酢酸（ACET）、プロピオ
ン酸（PROP）及び乳酸（LACT）が分析され
た。還元剤や不活性ガスを用いた場合と用いなか
つた場合の24hr醗酵試料のこれら代謝酸産生物の
濃度を第４表に示す。これらのデータから、標準
の醗酵製造法が醗酵培地中の溶解酸素の有害な濃
度になるのを防止するために採用した条件下では
満足すべきものであることは明らかである。 【表】 実施例 ３ 代謝酸産物に影響する醗酵パラメータ ヴイ・クリセテイ菌株は、醗酵培地の、低い
PH、溶解酸素もしくは40℃を超える温度に感受性
を示す。したがつて例えば、ルイス酸を添加する
とか、PHを約5.3〜5.5をより大きく超えるレベル
に維持しないかによつてPH値を約5.3〜5.5未満に
調節すると、ベイロネラ菌株の代謝は、乳酸を酸
化して二酸化炭素や水素の気体を発生させてプロ
ピオン酸や酢酸にするのを止める。共同培養体が
約5.3〜5.5未満のPH、40℃以上の温度もしくは溶
解酸素にさらされる条件下でも、ラクトバチルス
は炭水化物基質を醗酵させて乳酸に変換し続ける
が、ベイロネラは乳酸を酸化して追加の産物とす
ることができない。 プロピオン酸の乳酸に対する好ましいいずれの
比率も、追加を基質を続けて入れるか否かにかか
わらず、醗酵条件を操作することによつて作り出
すことができる。この実施例はPHの変化による代
謝酸産物の産生に対する効果を示す。この実験で
は、二つの菌株（CLS917と1218）は、全ホエー
として供給されているラクトース（２％）、酵母
エキス（1.0％）及び60ミリモル濃度の炭酸カル
シウム溶液含有の培地３中で培養された。その
醗酵条件には、温度38℃、自動もしくは手動での
水酸化アンモニウムの添加によつて最初の24hrの
PHを5.5〜6.0に維持したこと及びニユー・ブラン
ズビツク・フアーメンター中200rpmの速度での
連続撹拌が含まれる。培養物の一部を醗酵開始時
と醗酵8hr、24hr、32hr及び48hrに取りだした。
試験結果を第５表に示す。 【表】 実施例 ４ 基質としての全スイート・ホエー（whole
sweetwhey）の使用 全スイート・チーズ・ホエーを、二つの菌株
（CLS917と1218）の添加された醗酵培地に用い
た。全ホエーとして供給されるラクトース（４
％）（５％、醗酵開始時に2.5％、24hr後に2.5％
添加）；酵母エキス（1.0％）；および60ミリモル
濃度の炭酸カルシウム溶液含有の培地250中で
培養された。醗酵条件には、温度38℃、水酸化カ
ルシウムの自動もしくは手動での水酸化カルシウ
ムの添加によるPHの5.5〜6.0の維持及びニユー・
ブランズビツク・フアーメンター中での200rpm
の速度での連続攪拌が含まれる。培養物の一部を
醗酵開始時、醗酵16hr、24hr、32hrおよび48hrに
採取した。これらの試料は前記方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）および乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24hrの試料のこれ
ら代謝酸産物の濃度を第６表に示す。 【表】 実施例 ５全スイート・ホエーでのプロピオン酸
塩の工業的生産 全スイート・ホエーの醗酵によるプロピオン酸
カルシウムのパイロツト・プラント生産を、下記
培地：全スイート・ホエーとして最初に2.5％存
在し、16時間後に2.5％の追加の添加をして供給
されるラクトース（４％）；酵母エキス〔アンバ
ー510（Amber510）〕（1.0％）；および炭酸カルシ
ウム〔ヒユーバーカーブＳ−3tm（Huber−Carb
Ｓ−3tm）〕（0.6％）中で行つた。醗酵条件には、
必要に応じて手動で水酸化カルシウムを添加する
ことによつてPHを5.5〜5.7に維持すること、温度
は38℃（±1.0℃）およびほぼ200rpmでの撹拌が
含まれる。醗酵は、35の醗酵容積のステンレス
鋼製で適切に殺菌された醗酵機中で行われた。 醗酵に続いて、細菌細胞が50000ドルトンのカ
ツトオフ孔サイズを有するロミカン（Romican）
中空繊維膜を通してのマイクロ過によつて除去
され、パーミエートは活性炭素スラリイ中で脱色
され、フラツシユ・エバポレーシヨンによつて濃
縮され、タワータイプ乾燥機中（空気入口温度
150〜160℃、空気出口温度90〜100℃）で噴霧乾
燥され自由に流動する灰白色粉末を得た。この醗
酵産物の化学的及び物理的性質を第７表に示す。 第７表 醗酵産物の代表的分析結果 嵩比重（ｇ／cm3） 0.03 水分（％） 8.1 １％溶液のPH 6.34 溶解度（ｇ／100ml水、25℃） 33.00 溶解度（ｇ／200ml水、70℃） 32.40 粗繊維含有量（％） ＜0.10 アシツド・デタージエント・フアイバー（acid
detergent fiber）含有量（％） ＜0.10 灰分（％） 55.3 粗脂肪（％） ＜1.0 粗蛋白（％） 11.10 小計 66.40 炭水化物〔デイフエレンス（difference）によ
る）（％） 33.60 溶解性炭水化物（ガス−液体クロマトグラフイに
よる）（％） フラクトース ND グルコース ＜1.00 ガラクトース ＜1.00 ラクトース ＜1.00 スクロース ND 短鎖脂肪酸類（揮発性） 酢酸カルシウム（酢酸として測定）（％） 37.0 プロピオン酸カルシウム（プロピオン酸として測
定） 42.20 短鎖脂肪酸類（不揮発性） 乳酸カルシウム（乳酸として）（％） ＜2.00 コハク酸カルシウム（コハク酸として）（％）
ND ビタミン類（mg／100ｇ） チアミン ＜0.10 リボフラビン ＜0.10 ピリドキシン ＜0.10 コバラミン ＜0.01 ナイアシン ＜0.10 無機物（％） カルシウム 16.69 リン 0.19 ナトリウム 1.15 マグネシウム 0.29 小計 18.32 無機物（ppm） アルミニウム 65.48 バリウム 3.45 硼素 6.58 クロム 3.57 銅 2.91 鉄 31.34 マンガン 3.98 ストロンチウム 78.76 亜鉛 8.07 小計 204.15 実施例 ６ 限外過されたスイート・ホエーの醗酵 また限外過されたスイート・ホエー中に存在
するラクトースが、菌株CLS917と1218の共同培
養体によるプロピオン酸の醗酵産生に基質として
用いられた。醗酵は下記培地：乾燥スイート・ホ
エー・パーミエート〔30000ドルトンの限外過
サイズ排除（ultrafilter size exclusion）〕とし
て供給されるラクトース（２％）、酵母エキス
（1.0％）および炭酸カルシウム（0.6％）中で行
つた。醗酵条件には、38℃の温度、水酸化アンモ
ニウムを自動もしくは手動で添加することによる
PHの5.5〜6.0の維持、およびニユー・ブランズビ
ツク・フアーメンター中200rpmの速度での撹拌
が含まれる。培養物の一部を醗酵開始時と醗酵
4hr、8hrおよび24hrに取り出した。これらの試料
は前記実施例に記載の方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）および乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24hrの試料のこれ
ら代謝酸産物の濃度を第８表に示す。 【表】 実施例 ７ 原料としてのセロビオースの使用 ラクトースは、この発明に用いる基質として現
在好ましいものであるが、他の多くの炭水化物類
も代謝酸産物類の生産用基質として有用である。
ひとつのこのような炭水化物として非酪農源から
しばしば実際に見出されるものは、セルロースの
部分消化から生成する二糖類のセロビオースであ
る。第２表について記載された一般的な手順によ
つてセロビオース上で菌株CLS917および1218が
共同培養されると、プロピオン酸、酢酸および乳
酸が産生される。結果を第９表に集約した。プロ
ピオン酸は、いずれの菌株によつても単独では満
足すべき濃度にまで産生されない。 【表】 実施例 ８ 製パン法の研究への、醗酵産物のプロピオン酸
塩の使用 プロピオン酸カルシウムは従来、カビ類の増殖
を阻害することによつてパン類や他の製パン業の
産物の貯蔵寿命を増大させるために使用されてき
た。実施例５の方法と同様にして、細胞類を除去
し得られた液を濃縮し噴霧乾燥された全スイー
ト・ホエーの醗酵生成物が、かび増殖による汚染
の阻止に対するプロピオン酸カルシウム含有量の
影響を測定するために製パン法の研究に用いられ
た。この研究において、その噴霧乾燥された流動
性の粉末が二つの製パン処方に用いられた。第一
の処方では、プロピオン酸カルシウムの最終濃度
がほぼ0.25％になるよう、上記の乾燥品をパン生
地に（小麦粉の重量ベースで）最終濃度0.5％で
添加された。他の活性成分としては0.1％のリン
酸モノカルシウムと0.9％のTeklactm（食品用グ
レードのラクトース製品）とを含有している。第
二の処方には、最終濃度0.5％の前記醗酵産物と
ほぼ0.25％濃度の唯一の活性成分のプロピオン酸
カルシウムとが含有されている。第三のパン生地
は対照として用いるために作製され全く活性成分
を含有していなかつた。 研究の結果、前記の乾燥された醗酵産物はパン
生地処方に伝統的に用いられているプロピオン酸
カルシウム含有量に基づく濃度で用いると、かび
増殖による汚染を阻害するのに有効であるという
ことが示された。第一と第二の処方で複数個のパ
ンが製造され、これらはこの研究が終了した30日
間標準条件下で貯蔵しても全くかびの増殖を示さ
なかつた。第三のパン生地はこの実験の対照とし
ての役目をはたすものであり、製造された複数個
のパンは貯蔵７〜10日後にかび増殖を示した。 全スイート・ホエー中に存在するラクトースを
菌株CLS917（エル・カセイ・サブスペシイズ ラ
ムノスス）と1218（ヴイ・クリセテイ）との共同
培養によつて醗酵させるというこの発明によれば
プロピオン酸カルシウムが産生されるということ
はこの実施例から明らかである。この醗酵産物
は、0.25％０のプロピオン酸カルシウム（小麦粉
重量基準の最終濃度）で用いられると（乾燥形
態、液状形態のいずれでもよい）、標準貯蔵条件
下のパンのかび増殖を有効に阻止することができ
る。 前記の実施例は、これらの実施例に具体的に用
いられた試薬および／または操作条件の代りに、
包括的もしくは具体的に記載されたこの発明の試
薬および／または操作条件を用いても同様に成功
裡に繰返して行なうことができる。前記の記載か
ら、この発明の技術分野の当業者ならば、この発
明の特徴をこの発明の思想と範囲を逸脱すること
なく容易に理解でき、この発明を種々の用途や条
件に適用するために種々の変更と改良をすること
ができるであろう。 産業上の利用性 この明細書と実施例とから分かるように、この
発明は産業上有用であり、種々の公知の産業上の
用途を有するプロピオン酸カルシウムの製造法を
提供するものである。
クロースのようなヘキソース基を有する糖類
原料を、同種醗酵させて、特に乳酸からなる
第一代謝産物に変換させるラクトバチルス属
の微生物からなる第一微生物成分と、 () 前記のヘキソース源を代謝的に同化でき
ないが、第一微生物の代謝産物である乳酸
を、特にプロピオン酸と酢酸とからなる第二
代謝産物に変換するべイロネラ属の微生物か
らなる第二微生物成分とで、 構成された、多段の継代にわたつて種の集団
の比率を比較的一定に維持する、必須の２つの
微生物成分からなる安定な共同養体を形成し； Ｂ 前記共同培養体を、代謝可能な前記ヘキソー
ス源を含有する、同化可能な栄養培養原料に接
種し； Ｃ 乳酸の大部分を、特に、プロピオン酸、酢
酸、さの塩およびその混合物からなる醗酵産物
に変換するのに充分な期間と条件下で少なくと
も５ミリモル／／hrの醗酵速度にて、前記原
料を前記共同培養体で嫌気醗酵させ； Ｄ ベイロネラ属の微生物が、ラクトバチルス属
の微生物で産生された乳酸を前記醗酵産物を蓄
積するのに充分な期間醗酵し続けるよう混合物
のPHを維持する； ことからなる、プロピオン酸および酢酸を生体外
で産生させる、同時に行う逐次嫌気性醗酵方法。 ２ ヘキソース源が、グルコース、スクロース、
ラクトースおよびその混合物からなる群から選択
される請求の範囲第１項による方法。 ３ ヘキソース源がラクトースである請求の範囲
第２項による方法。 ４ 原料が全ホエーまたは透明化された牛乳ホエ
ーラクトース・パーミエートである請求の範囲第
３項による方法。 ５ ラクトバチルス属の微生物がラクトバチル
ス・カセイである請求の範囲第１項による方法。 ６ ラクトバチルス属の微生物がラクトバチル
ス・カセイ・サブスペシイズ・ラムノススである
請求の範囲第５項による方法。 ７ ベイロネラ属の微生物がベイロネラ・クリセ
テイである請求の範囲第１項による方法。 ８ 共同培養体がATTC寄託番号第39662号の培
養体、またはこれと同じ醗酵特性を有する変異体
である請求の範囲第１項による方法。 ９ 約５モルのプロピオン酸が、醗酵させた乳酸
の８モルから得られる請求の範囲第１項による方
法。 １０ 得られた産物を乾燥して、自由に流動する
粉末を作製することからなる請求の範囲第１項に
よる方法。 １１ 残留微生物を、乾燥工程の前に産物から除
去する請求の範囲第１項による方法。 発明の記載 発明の技術分野 この発明は、同時に起こる２段階の細菌醗酵工
程を利用して炭水化物原料を異化することによ
る、乳酸もしくはその塩、並びにプロピオン酸お
よび／もしくは酢酸もしくはその塩の製造法に関
する。第一段工程において、炭水化物が、例えば
ラクトバチルス・カセイ・サブスペシイズ・ラム
ノスス（Lactobacillus casei subspecies
rhamnosus）のごとき糖類分解細菌によつて乳酸
に変換される。第二段工程では、得られた乳酸
が、第一の細菌の存在下で増殖するのに適する第
二の細菌、例えばベイロネラ・クリセテイ
（Veillonellacriceti）のごとき乳酸異化細菌によ
つて、醗酵させられてプロピオン酸、酢酸、二酸
化炭素及び水素を生成する。 背景技術 プロピオン酸は、セルロースプロピオネート
（熱可塑性物質）の製造におけるエステル化剤、
チーズや他の酪農製品中に自然に発生する細菌醗
酵代謝物として商業的に用いられている。プロピ
ンオン酸カルシウムもしくはプロピオン酸ナトリ
ウムのごとき遊離酸の塩の形態のものは、製造さ
れるエステル溶媒類、果物芳香剤類及び香水ベー
ス類中のみならず、かびの繁殖を防止するために
食品中に防腐剤として用いられる。 プロピオン酸を生産する伝統的な方法は、プロ
ピオニバクテリウム属（the genus
Propionibacterium）の菌株を使用する細菌醗酵
法によつていた。例えば米国特許第1459959号；
1865146号；1875401号；1898329号；1913346号；
1932755号；及び3067107号それぞれの公報参照。
過去30〜40年間で、一酸化炭素とエチレンもしく
はエタノールとの縮合のごとき化学的方法は商業
的に可能であることが分かつてきた。最近、石油
化学による原料の価格が上昇したので、プロピオ
ン酸を含む多くの化学薬品製造用として応用生物
学的原料及び農業原料を再検討するようになつ
た。 プロピオニバクテリウム属のプロピオニ細菌
（Propionibacteria）は伝統的に、細菌醗酵によ
るプロピオン酸の生産に用いられてきた。しかし
プロピオニバクテリウム種を、単独培養体
（monoculture）もしくはラクトバチルスの菌株
との共同培養体（co−culture）として用いると
一般に、プロピオン酸が低レベルであつたり醗酵
物の滞留時間が長くなつたりするかまたは両方の
現象が起つた。これら制限は、プロピオニ細菌が
増殖する前の遅滞期が長いこと、すなわちプロピ
オン酸がプロピオニ細菌の増殖を阻害するのが原
因か、または乳酸産生種のラクトバチルスとの共
同培養の場合には乳酸のプロピオン酸への醗酵過
程においてプロピオニバクテリウム種が炭水化物
を優先的に異化することが原因であろう。 発明の開示 したがつて、この発明の一般的な目的は、プロ
ピオン酸を高収率で得るための微生物の共同培養
体による製造法を提供するものである。 この発明の他の目的は、極めて短い醗酵機内滞
留時間で高収率を与える前記方法を提供すること
である。 この発明のさらに他の目的は、ひとつの微生物
の代謝産物の乳酸が、第二微生物によるプロピオ
ン酸産生用の原料となる製造法を提供することで
ある。 この発明のさらに追加すべき目的は、種々の原
料から得られる乳酸の大部分をプロピオン酸に変
換する前記方法を提供することである。 この発明の一層特別な目的は前記の製法に用い
る微生物類の新規な共同培養体を提供することで
ある。 明細書及び添付された請求の範囲を検討すれ
ば、この発明のその外の目的、特徴及び利点がこ
の発明の関連する技術分野の当業者にとつて一層
明らかになるであろう。 発明を実施するための最良の方法 簡単に述べれば、この発明の前記及び他の目
的、特徴及び利点は次のような方法を提供するこ
とによつてその一態様として達成できる。すなわ
ち、同化できる炭水化物源を含有する栄養増殖培
地原料を、栄養増殖条件下で前記炭水化物を乳酸
に変換しうる第一微生物で醗酵させて生体外で乳
酸を産生させ、その醗酵が、第一微生物との共同
培養体中で増殖するのに適し、醗酵産物の乳酸の
大部分を、プロピオン酸、酢酸及びその塩、並び
にこれらの混合物からなる群から選択される化合
物に変換する第二微生物の追加された存在下で行
われる方法である。 乳酸の微生物による産生に適する原料は、この
技術分野ではよく知られており、先行米国特許類
及び多数の他の刊行物、例えばエム・ブリン
（M.Brin）、Biochem.Prepn.，第３巻、61号、
（1953年）；エス・シイ・プレスコツトら（S.C.
Prescott et al）、インダストリアル マイクロ
バイオロジイ（Industrial Microbiology）（マツ
クグロー・ヒル社、ニユーヨーク、第３版 1959
年）第304〜331頁；アンダーセンら（Andersen
et al）、インダストリアル エンジニアリング
ケミストリイ（Ind.End.Chem.）第34巻、第1522
頁、（1942年）；およびエム・ブリンら（M.Brin
et al）、アナルズ オブ ザ ニユーヨーク ア
カデミイ オブ サイエンス（Ann.N.Y.Acad.
Sci）第119巻、第851〜1165頁（1965年）に記載
のものを含むが、これらに限定されるものではな
い。商業的に使用するにはホエー（whey）、コン
スターチ、いも類及び糖蜜のような原料が一般的
に好ましい。この発明の好ましい原料は、全ホエ
ー（whole whey）、または透明化された牛乳ホ
エー・ラクトース・パーミエート（clarified
dairy whey lactose permeate）からなる原料、
特に1984年３月29日付で公開されたPCT国際公
開第WO 84／01104号公報に記載され請求された
ものが好ましい。 この発明の方法にしたがつて用いられる乳酸産
生微生物を選ぶ場合は勿論、乳酸に変換されるべ
き特定の原料の成分に左右されるが、多くの適切
な微生物はこの技術分野で公知のものである。透
明化された牛乳ホエーラクトースパーミエートは
この発明に用いられる原料として現在好ましいも
のであるから、ラクトバチルス・カセイの特にラ
クトバチルス カセイ サブスペシイズ ラムノ
ススがこの発明の方法の第一段階の現在における
好ましい微生物である。この菌株は広く知られて
おり、当業者ならば例えばジ・アメリカン・タイ
プ・カルチユアー・コレクシヨン（ATCC）、米
国メリーランド州20852、ロツクビル、パークロ
ーン・ドライブ12301から容易に入手できる。 第一微生物の代謝産物の乳酸をプロピオン酸に
変換するための第二微生物を選択する場合には、
乳酸を醗酵させてプロピオン酸や他の最終産物に
変換する性能を有する微生物を選択する必要があ
る。数種のかような細菌は公知であり、そして、
例えば英国特許第1251483号公報、米国特許第
3857971号公報、同第4138498号公報及びハバーら
（Huber et al）、アメリカン ジヤーナル オブ
ベタラネリイ リサーチ（Am.J.Vet.Res.）、
第37巻(5)、第611〜613頁（1976年）に記載された
ごとき目的の技術分野で広く入手できる。かよう
な細菌は公知であり当業者ならば広く入手でき、
メガスフエラ・エルスデニイ（Megasphaera
elsdenii）、ペプトコツカス・アサツカロリテイ
クス（Peptococcus asaccharolylicus）、セレノ
モナス・ルミナテイム（Selenomonas
ruminatium）及びベイロネラ・クリセテイ
（Veillonella criceti）が含まれることがこれに
限定するものではない。この発明に用いる特に適
切な微生物は、同化できる炭水化物源として、乳
酸を優先的に用いるこれらの微生物である。つま
りこれらの微生物はこの性質を示し（フラクトー
スを除いて、ベイロネラ・クリセテイはおそらく
ヘキソキナーゼ酵素を欠いているために炭水化物
を直接醗酵させることはできないようであり、代
りに乳酸のごときモノカルボン酸を増殖基質とし
て利用する）、生体外で急速に増殖する前に長い
遅退時間を示さないからであり、ベイロネラ・ク
リセテイが現在好ましいものである。 原料を連続的に処理して最初乳酸を形成させ次
いでプロピオン酸を形成させることは多くの特有
の困難に遭遇する。第一段階においては産物の乳
酸が蓄積すると、その結果マスバランス効果とPH
の低下によつて原料の変換が遅くなる。PHは調整
することができるが、この調整によつて新たな汚
染の危険が導入され、産物の乳酸の除去によつて
未変換の原料と変換する微生物との両者の除去が
起こる。第二段階では、PHが制御されないと好ま
しくないラクテートの濃縮物が残り、入つてくる
未変化原料が、微生物に対して、好ましくない産
物を形成することになる物質代謝の経路をとる機
会を与える。 この発明によれば、上記およびその外の困難
は、同時の２段階の細菌醗酵法を用いる炭水化物
の異化によつて克服できる。第一段階において、
炭水化物は糖類分解細菌のラクトバチルス・カセ
イ・サブスペシイズ・ラムノススによつて乳酸に
変換される。第二段階において、得られた乳酸は
ベイロネラ・クリセテイによつて醗酵されてプロ
ピオン酸と酢酸、二酸化炭素と水素になる。かよ
うにして形成されたプロピオネート（およびラク
テート）は、適当な溶媒抽出システム、蒸留回収
法、沈澱法によるカチオン性塩の形成法を用い、
または醗酵ブロス培地の濃縮乾燥法（細菌細胞を
除去もしくは除去せずに）によつて回収すること
ができる。 共同培養体の形成 親菌株のCLS917（ラクトバチルス・カセイ・サ
ブスペシイズ・ラムノスス）と1218（ベイロネ
ラ・クリセテイ）は、ストレプトマイシンやリフ
アンピシン上で増殖する共存の抗生物質に耐性の
コロニイ（ラクトバチルス・カセイ・サブスペシ
イズ・ラムノススとしての）またはリフアンピシ
ン上のみで増殖する共存の抗生物質に耐性のコロ
ニイ（ベイロネラ・クリセテイとして）としてそ
れぞれ別々に選択された。ラクトバチルス・カセ
イ・サブスペシイズ・ラムノススとベイロネラ・
クリセテイのこれら突然変異菌株は遺伝標識形質
（すなわち特定の抗生物質に対する耐性）を有す
るが、下記組成：（最終濃度として重量／重量ベ
ースで示した数値）トリプトン（1.0％）；酵母エ
キス（1.0％）；乳酸ナトリウム（2.0％）；システ
イン塩酸塩（0.5％）及び炭酸水素ナトリウム
（0.5％）のトリプトンブロス中での代謝産物の酸
について試験した。酸の最大産生量を示すこれら
の突然変異菌株（CLS917及び1218）が選ばれた。 これらのブロス培養体は、異なる温度で24時間
嫌気的に培養され、両菌株が安定して増殖する最
適条件を決定した。最適温度は、各菌株の生存細
胞（viable cells）数によつて評価され88℃に決
定された。 両突然変異菌株の生存し健康な細菌細胞がホル
ドマンおよびムーア（Holdeman and Moore）、
アネローブ ラボラトリマニユアル（Anaerobe
Laboratory Manual）、第４版、デパートメン
ト・オブ・アネロビツク・マイクロバイオロジイ
（Department of Anaerobic Microbiology）、
バージニア・ポリテクニツク・インステイチユー
ト・アンド・ステイト・ユニバーシテイ
（Virginia Polytechnic Institute and State
University）、ブラツクスバーグ バージニア
24061、に記載されているのと同様にて製造した
切りきざんだ肉のブロス培養培地に添加した。３
日間の間隔をおいて24時間毎のトランスフアーと
継代培養による連続継代の共同培養体は安定な混
合された２種の細菌培養体を示した（第１表参
照）。この共同培養体の安定性は切りきざんだ肉
の各ブロス培養体の二つの細菌の集団（twt
bacterial population）を数えることによつて測
定した。これは固体増殖培地に前記ブロス培養体
の連続稀釈物を接種する標準の方法で行つた。そ
の固体増殖培地は前記トリプトンブロス培地に寒
天を1.5％最終濃度で添加したもので構成されて
いる。この固体培地のPHは蒸気殺菌前に7.0に調
節される（そして殺菌後は6.8〜7.0であることが
観察された）。連続稀釈物を作製するための稀釈
剤は、アネローブ・ラボラトリ・マニユアル第４
版に記載のものであつた。継代培養体は24hr培養
された後にその細菌集団が数えられた。共同培養
体は、二つの微生物の比率が実験誤差の範囲内で
一定であり、いずれの微生物も他の微生物を追抜
くことがないことを示す場合が安定であるとみな
される。 【表】 実験開始時の接種物におけるラクトバチルス・
カセイ菌株CLS917の生存細胞集団の大きさは、
ベイロネラ・クリセテイ菌株1218の集団の大きさ
のほぼ1/2であつた。各３日間の最後におけるこ
れらの二つの集団の比率は比較的一定であつた。
さらに単一のきりきざんだ肉のブロスの共同培養
体を、15の別個の３のバツチ醗酵用接種物とし
て２ケ月間にわたつて用いたところ、その結果同
様の生存細胞比率を有する混合集団が得られら
た。 共同培養体の保管 共同培養体は、殺菌グリセロールとトリプトン
ブロス培養培地（前記の）とを同容積ずつ含有す
るものの0.2mlずつを入れ密封したバイアルビン
中に入れて−80℃で保管することができる。各密
封物は、予め健康な増殖培養体から得た同数の両
菌株を含有すべきである（各々ほぼ１億の細菌細
胞）。ラクトバチルス・カセ・サブスペシイズ・
ラムノススとベイロネラ・クリセテイとのこの共
同培養体は、ジ・アメリカン・タイプ・カルチユ
アー・コレクシヨンに1984年４月９日付けで寄託
され、ATCC寄託番号第39662号として登録され
た。この菌株は貯蔵後、内容物をトリプトンもし
くはきりきざんだ肉のブロス培地に接種すること
によつて再生することができ、38℃で24〜48時間
嫌気性条件下で培養することができる。 代謝産物と産生と用途 適切な栄養培地中ラクトバチルス菌株で醗酵可
能な炭水化物を代謝するとアセテートの産生レベ
ルは低く、ラクテートの産生レベルは高いという
結果になる。次いでそのラクテートは、共同培養
体中に存在するベイロネラ菌株によつて急速に代
謝されてプロピオネート、アセテート、二酸化炭
素及び水素になる。第２表に、ラクトバチルスと
ベイロネラの両菌株の共同培養によつて醗酵され
て、プロピオネート、アセテート、二酸化炭素、
水素及びラクテートに変換しうる一連の炭水化物
基質の一部を示す。 【表】 【表】 ＊ 代謝酸産物は次のように命名される
。
ACET＝酢酸；PROP＝プロピオン酸；及
びLACT＝乳酸、
ND＝検出されなかつた(0.01mg／ml未
満)
揮発性脂肪酸及び不揮発性脂肪酸は、ホルドマ
ン及びムーアによつて記載されたのと同様のガス
−液体クロマグラフイ法によつて測定された（ア
ネローブ・ラボラトリ・マニユアル、第４版、デ
パートメント・オブ・アネロビツク・マイクロバ
イオロジイ；バージニア・ポリテクニツク・イン
ステイチユート・アンド・ステイト・ユニバーシ
テイ・ブラツクスバーグ バージニア 24061）。 この発明の現在の好ましい最良の態様は、前記
二つのブロス培地を用いる安定な共同培養体を提
供するのに充分な栄養増殖培地中、すなわち下記
実施例に記載の培地中で二つの細菌菌株を培養す
る方法である。 具体的にいえば、二つの細菌菌株（エル・カセ
イ、CLS917及びヴイ・クリセテイ1218）の混合
培養体が、菌株CLS917が醗酵させることができ
る炭水化物基質を含有する増殖培地中で培養され
る。かような基質には単糖類、二糖類及び複合多
糖類が含まれるがこれに限定されるものではな
い。加うるに、その増殖培地も、酵母細胞エキス
の0.1〜2.0％溶液中に存在するのと同様のビタミ
ン類源および／またはアミノ酸類源を含有するの
が好ましい。低濃度の、カルボン酸の不阻害性・
無毒性塩を、60ミリモルの最終濃度まで添加する
のが好ましい。 醗酵の条件には次のものが含まれている。すな
わち温度の範囲は一般に20〜40℃であるが好まし
いのは35〜40℃であり、醗酵混合物の撹拌方法は
１分間400回転までの速度であり好ましくは１分
間当り150〜250回転の範囲であり、またPHは一般
に4.0〜9.0の範囲であり最高のプロピオン酸産生
量を得るには5.5〜6.0の範囲が好ましい。加うる
に、その増殖培地は、溶解酸素の濃度を上昇させ
そのため嫌気性代謝を妨げることになる空気流や
気体の交換を防止することによつて酸素の溶解す
るのを防がねばならない。一般に基質の醗酵速度
はほぼ１〜10ミリモル／hrで好ましくは少なくと
も５ミリモル／hrである。 さらに詳細な説明を加えなくても、当業者なら
ば前記の記載を用いてこの発明を十分に利用でき
ると信ずる。それ故に下記の特定の好ましい実施
態様は、単に例示するに過ぎず、いかなる場合で
も下記の開示に限定するものではないと解される
べきである。下記実施例には、温度は摂氏度で記
載され、また異なる指示がなければ、部とパーセ
ンテージはすべて重量で記載されている。 実施例 １ 醗酵のPHの制御 醗酵のPHは、一般に5.0〜9.0または好ましくは
5.3〜7.3の範囲内に維持されなければならない。
ルイス塩基として作用するいくつかの化合物はい
ずれもこの目的のために用いることができる。水
酸化アンモニウム（これにはアンモニアガスが含
まれ、これは水溶液中で水和されて水酸化アンモ
ニウムを形成する）、水酸化ナトリウム、水酸化
カルシウムもしくは水酸化カリウムは醗酵に有害
な影響なしで用いることができる。しかし、二価
の金属の無機酸化物、例えば水酸化カルシウム
（および水溶液中で水和されて対応する水酸化物
を形成するところの対応する酸化物）は、PH制御
剤として一価カチオンの水酸化物よりも良好に作
用するようである。 この実験において、二つの菌株（CLS917と
1218）は、全ホエーもしくは限外過ホエー・パ
ーミエートとして供給されるラクトース（２
％）；酵母エキス（1.0％）；及び前記水酸化物と
同一のカチオンを有する60ミリモル濃度の炭酸塩
緩衝液（これは水酸化アンモニウムとアンモニア
ガスを用いる場合以外のときであり、水酸化アン
モニウムとアンモニアガスを用いる場合は炭酸カ
ルシウムが用いられる）を（培地基準の最終濃度
で）含有する培地３中で培養された。醗酵条件
には、38℃の温度、PH制御試薬の自動もしくは手
動添加によつて5.5〜6.0のPHの維持及びニユー・
ブランズビイツク・フアーメンター（New
Brunswick Fermenter）中で200rpmの速度での
連続的撹拌が含まれる。醗酵液の一部を醗酵開始
時と醗酵4hr、8hr、12hr、24hr及び48hrで取り出
した。これらの試料は、前記方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）及び乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24時間の試料のこ
れら代謝酸産物の濃度（mg／ml）を第３表に示
す。 【表】 実施例 ２ 嫌気生活の維持 菌株CLS917（エル・カセイ）及び1218（ヴイ・
クリセテイ）はともに酸素の存在下では増殖しな
いか（1218）もしくは良好には増殖しない
（CLS917）嫌気性細菌である。しかし新たに水蒸
気殺菌された培地を、微生物の接種前に醗酵温度
に平衡をもたせる一般的な醗酵条件下では、酸素
は事実上排除される。したがつて還元剤、すなわ
ち溶解酸素と結合しうる化学化合物はラクトース
基質のプロピオン酸への効果的な醗酵のためには
必要でなかつた。加うるに、醗酵培地に雰囲気中
の酸素が溶解するのを防ぐため、不活性ガス（窒
素、ヘリウム、二酸化炭素など）を、上部の空間
（醗酵培地の表面上から容器トツプまでの空間）
に充満させるのに用いる必要はなかつた。菌株
1218は醗酵された二糖類の１モル当り1.5モルの
二酸化炭素を規則的に産生するから（単糖類につ
いては１モル当り0.75モルの二酸化炭素）、これ
らの二つの菌株の醗酵には不活性ガスは必要でな
い。菌株1218（ヴイ・クリセテイ）は絶対嫌気性
生物であるから、空気もしくは酸素を噴霧したり
バツブルさせて醗酵培地を参加させないよう注意
しなければならない。 この実験では、二つの菌株（CLS917と1218）
は、全ホエーもしくは限外過ホエーパーミエー
トとして供給されているラクトース（２％）；酵
母エキス（1.0％）；および60ミリモル濃度の炭酸
カルシウム溶液を含有する培地の３中で培養さ
れた。醗酵条件には、温度38℃、自動もしくは手
動でのPH制御剤の添加によるPH5.5〜6.0の維持及
びセル・スター・ジヤー（ベルコ・グラス・カン
パニイ）〔Cell Stir Jar（Bellco Glass Co.）〕中
での200rpmの速度での連続的撹拌が含まれる。
培養液の一部を醗酵開始時と醗酵4hr、8hr、
12hr、24hr及び48hrに取り出した。これらの試料
は、前記方法を用いて酢酸（ACET）、プロピオ
ン酸（PROP）及び乳酸（LACT）が分析され
た。還元剤や不活性ガスを用いた場合と用いなか
つた場合の24hr醗酵試料のこれら代謝酸産生物の
濃度を第４表に示す。これらのデータから、標準
の醗酵製造法が醗酵培地中の溶解酸素の有害な濃
度になるのを防止するために採用した条件下では
満足すべきものであることは明らかである。 【表】 実施例 ３ 代謝酸産物に影響する醗酵パラメータ ヴイ・クリセテイ菌株は、醗酵培地の、低い
PH、溶解酸素もしくは40℃を超える温度に感受性
を示す。したがつて例えば、ルイス酸を添加する
とか、PHを約5.3〜5.5をより大きく超えるレベル
に維持しないかによつてPH値を約5.3〜5.5未満に
調節すると、ベイロネラ菌株の代謝は、乳酸を酸
化して二酸化炭素や水素の気体を発生させてプロ
ピオン酸や酢酸にするのを止める。共同培養体が
約5.3〜5.5未満のPH、40℃以上の温度もしくは溶
解酸素にさらされる条件下でも、ラクトバチルス
は炭水化物基質を醗酵させて乳酸に変換し続ける
が、ベイロネラは乳酸を酸化して追加の産物とす
ることができない。 プロピオン酸の乳酸に対する好ましいいずれの
比率も、追加を基質を続けて入れるか否かにかか
わらず、醗酵条件を操作することによつて作り出
すことができる。この実施例はPHの変化による代
謝酸産物の産生に対する効果を示す。この実験で
は、二つの菌株（CLS917と1218）は、全ホエー
として供給されているラクトース（２％）、酵母
エキス（1.0％）及び60ミリモル濃度の炭酸カル
シウム溶液含有の培地３中で培養された。その
醗酵条件には、温度38℃、自動もしくは手動での
水酸化アンモニウムの添加によつて最初の24hrの
PHを5.5〜6.0に維持したこと及びニユー・ブラン
ズビツク・フアーメンター中200rpmの速度での
連続撹拌が含まれる。培養物の一部を醗酵開始時
と醗酵8hr、24hr、32hr及び48hrに取りだした。
試験結果を第５表に示す。 【表】 実施例 ４ 基質としての全スイート・ホエー（whole
sweetwhey）の使用 全スイート・チーズ・ホエーを、二つの菌株
（CLS917と1218）の添加された醗酵培地に用い
た。全ホエーとして供給されるラクトース（４
％）（５％、醗酵開始時に2.5％、24hr後に2.5％
添加）；酵母エキス（1.0％）；および60ミリモル
濃度の炭酸カルシウム溶液含有の培地250中で
培養された。醗酵条件には、温度38℃、水酸化カ
ルシウムの自動もしくは手動での水酸化カルシウ
ムの添加によるPHの5.5〜6.0の維持及びニユー・
ブランズビツク・フアーメンター中での200rpm
の速度での連続攪拌が含まれる。培養物の一部を
醗酵開始時、醗酵16hr、24hr、32hrおよび48hrに
採取した。これらの試料は前記方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）および乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24hrの試料のこれ
ら代謝酸産物の濃度を第６表に示す。 【表】 実施例 ５全スイート・ホエーでのプロピオン酸
塩の工業的生産 全スイート・ホエーの醗酵によるプロピオン酸
カルシウムのパイロツト・プラント生産を、下記
培地：全スイート・ホエーとして最初に2.5％存
在し、16時間後に2.5％の追加の添加をして供給
されるラクトース（４％）；酵母エキス〔アンバ
ー510（Amber510）〕（1.0％）；および炭酸カルシ
ウム〔ヒユーバーカーブＳ−3tm（Huber−Carb
Ｓ−3tm）〕（0.6％）中で行つた。醗酵条件には、
必要に応じて手動で水酸化カルシウムを添加する
ことによつてPHを5.5〜5.7に維持すること、温度
は38℃（±1.0℃）およびほぼ200rpmでの撹拌が
含まれる。醗酵は、35の醗酵容積のステンレス
鋼製で適切に殺菌された醗酵機中で行われた。 醗酵に続いて、細菌細胞が50000ドルトンのカ
ツトオフ孔サイズを有するロミカン（Romican）
中空繊維膜を通してのマイクロ過によつて除去
され、パーミエートは活性炭素スラリイ中で脱色
され、フラツシユ・エバポレーシヨンによつて濃
縮され、タワータイプ乾燥機中（空気入口温度
150〜160℃、空気出口温度90〜100℃）で噴霧乾
燥され自由に流動する灰白色粉末を得た。この醗
酵産物の化学的及び物理的性質を第７表に示す。 第７表 醗酵産物の代表的分析結果 嵩比重（ｇ／cm3） 0.03 水分（％） 8.1 １％溶液のPH 6.34 溶解度（ｇ／100ml水、25℃） 33.00 溶解度（ｇ／200ml水、70℃） 32.40 粗繊維含有量（％） ＜0.10 アシツド・デタージエント・フアイバー（acid
detergent fiber）含有量（％） ＜0.10 灰分（％） 55.3 粗脂肪（％） ＜1.0 粗蛋白（％） 11.10 小計 66.40 炭水化物〔デイフエレンス（difference）によ
る）（％） 33.60 溶解性炭水化物（ガス−液体クロマトグラフイに
よる）（％） フラクトース ND グルコース ＜1.00 ガラクトース ＜1.00 ラクトース ＜1.00 スクロース ND 短鎖脂肪酸類（揮発性） 酢酸カルシウム（酢酸として測定）（％） 37.0 プロピオン酸カルシウム（プロピオン酸として測
定） 42.20 短鎖脂肪酸類（不揮発性） 乳酸カルシウム（乳酸として）（％） ＜2.00 コハク酸カルシウム（コハク酸として）（％）
ND ビタミン類（mg／100ｇ） チアミン ＜0.10 リボフラビン ＜0.10 ピリドキシン ＜0.10 コバラミン ＜0.01 ナイアシン ＜0.10 無機物（％） カルシウム 16.69 リン 0.19 ナトリウム 1.15 マグネシウム 0.29 小計 18.32 無機物（ppm） アルミニウム 65.48 バリウム 3.45 硼素 6.58 クロム 3.57 銅 2.91 鉄 31.34 マンガン 3.98 ストロンチウム 78.76 亜鉛 8.07 小計 204.15 実施例 ６ 限外過されたスイート・ホエーの醗酵 また限外過されたスイート・ホエー中に存在
するラクトースが、菌株CLS917と1218の共同培
養体によるプロピオン酸の醗酵産生に基質として
用いられた。醗酵は下記培地：乾燥スイート・ホ
エー・パーミエート〔30000ドルトンの限外過
サイズ排除（ultrafilter size exclusion）〕とし
て供給されるラクトース（２％）、酵母エキス
（1.0％）および炭酸カルシウム（0.6％）中で行
つた。醗酵条件には、38℃の温度、水酸化アンモ
ニウムを自動もしくは手動で添加することによる
PHの5.5〜6.0の維持、およびニユー・ブランズビ
ツク・フアーメンター中200rpmの速度での撹拌
が含まれる。培養物の一部を醗酵開始時と醗酵
4hr、8hrおよび24hrに取り出した。これらの試料
は前記実施例に記載の方法を用いて酢酸
（ACET）、プロピオン酸（PROP）および乳酸
（LACT）が分析された。醗酵24hrの試料のこれ
ら代謝酸産物の濃度を第８表に示す。 【表】 実施例 ７ 原料としてのセロビオースの使用 ラクトースは、この発明に用いる基質として現
在好ましいものであるが、他の多くの炭水化物類
も代謝酸産物類の生産用基質として有用である。
ひとつのこのような炭水化物として非酪農源から
しばしば実際に見出されるものは、セルロースの
部分消化から生成する二糖類のセロビオースであ
る。第２表について記載された一般的な手順によ
つてセロビオース上で菌株CLS917および1218が
共同培養されると、プロピオン酸、酢酸および乳
酸が産生される。結果を第９表に集約した。プロ
ピオン酸は、いずれの菌株によつても単独では満
足すべき濃度にまで産生されない。 【表】 実施例 ８ 製パン法の研究への、醗酵産物のプロピオン酸
塩の使用 プロピオン酸カルシウムは従来、カビ類の増殖
を阻害することによつてパン類や他の製パン業の
産物の貯蔵寿命を増大させるために使用されてき
た。実施例５の方法と同様にして、細胞類を除去
し得られた液を濃縮し噴霧乾燥された全スイー
ト・ホエーの醗酵生成物が、かび増殖による汚染
の阻止に対するプロピオン酸カルシウム含有量の
影響を測定するために製パン法の研究に用いられ
た。この研究において、その噴霧乾燥された流動
性の粉末が二つの製パン処方に用いられた。第一
の処方では、プロピオン酸カルシウムの最終濃度
がほぼ0.25％になるよう、上記の乾燥品をパン生
地に（小麦粉の重量ベースで）最終濃度0.5％で
添加された。他の活性成分としては0.1％のリン
酸モノカルシウムと0.9％のTeklactm（食品用グ
レードのラクトース製品）とを含有している。第
二の処方には、最終濃度0.5％の前記醗酵産物と
ほぼ0.25％濃度の唯一の活性成分のプロピオン酸
カルシウムとが含有されている。第三のパン生地
は対照として用いるために作製され全く活性成分
を含有していなかつた。 研究の結果、前記の乾燥された醗酵産物はパン
生地処方に伝統的に用いられているプロピオン酸
カルシウム含有量に基づく濃度で用いると、かび
増殖による汚染を阻害するのに有効であるという
ことが示された。第一と第二の処方で複数個のパ
ンが製造され、これらはこの研究が終了した30日
間標準条件下で貯蔵しても全くかびの増殖を示さ
なかつた。第三のパン生地はこの実験の対照とし
ての役目をはたすものであり、製造された複数個
のパンは貯蔵７〜10日後にかび増殖を示した。 全スイート・ホエー中に存在するラクトースを
菌株CLS917（エル・カセイ・サブスペシイズ ラ
ムノスス）と1218（ヴイ・クリセテイ）との共同
培養によつて醗酵させるというこの発明によれば
プロピオン酸カルシウムが産生されるということ
はこの実施例から明らかである。この醗酵産物
は、0.25％０のプロピオン酸カルシウム（小麦粉
重量基準の最終濃度）で用いられると（乾燥形
態、液状形態のいずれでもよい）、標準貯蔵条件
下のパンのかび増殖を有効に阻止することができ
る。 前記の実施例は、これらの実施例に具体的に用
いられた試薬および／または操作条件の代りに、
包括的もしくは具体的に記載されたこの発明の試
薬および／または操作条件を用いても同様に成功
裡に繰返して行なうことができる。前記の記載か
ら、この発明の技術分野の当業者ならば、この発
明の特徴をこの発明の思想と範囲を逸脱すること
なく容易に理解でき、この発明を種々の用途や条
件に適用するために種々の変更と改良をすること
ができるであろう。 産業上の利用性 この明細書と実施例とから分かるように、この
発明は産業上有用であり、種々の公知の産業上の
用途を有するプロピオン酸カルシウムの製造法を
提供するものである。
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