JPH0360804B2 - - Google Patents
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- JPH0360804B2 JPH0360804B2 JP57143340A JP14334082A JPH0360804B2 JP H0360804 B2 JPH0360804 B2 JP H0360804B2 JP 57143340 A JP57143340 A JP 57143340A JP 14334082 A JP14334082 A JP 14334082A JP H0360804 B2 JPH0360804 B2 JP H0360804B2
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/33—Fibroblasts
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/13—Tumour cells, irrespective of tissue of origin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/91—Cell lines ; Processes using cell lines
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
この発明は人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤に関す
る。 この発明は人の悪性腫瘍細胞を培養し、その培
養後培地より前記悪性腫瘍細胞を除いて抽出した
もので、人の腫瘍細胞に対し、増殖抑制や細胞致
死効果を特異的に有すものである。この悪性腫瘍
細胞増殖抑制物質は、低分子の物質であり、分子
量1000の分子を篩い分けるアミコン社製のYM2
や、UM10などのフイルターを透過可能であり、
これらを用いて抽出することができる。抽出して
得られたこの物質は、正常細胞に対しても多少の
増殖抑制が認められるが、悪性腫瘍細胞に対する
増殖抑制力とは著しい差異があり、正常細胞に対
して致死効果が認められないことから、この発明
により得られた悪性腫瘍細胞増殖抑制剤は、在来
の抗腫瘍剤のような副作用はほとんどないと考え
られる。 また、人の悪性腫瘍細胞に人の正常細胞を混合
培養してもその培養後培地より抽出したものが同
様の効果が得られる。そして、混合培養後の培地
と新鮮通常培地との比率を選べば、正常細胞は増
殖し、悪性腫瘍細胞の増殖は著しく低下させるこ
とができる。 次に、この発明の効果を確認するために実験方
法について述べる。 実験 １ １ 実験材料とした細胞 人の悪性腫瘍より分離した多種類の培養樹立株
細胞を使用した。すなわち、ヒト腎細胞癌由来樹
立株細胞HRC、ヒト胃癌由来樹立株細胞MK、
ヒト肺癌由来樹立株細胞PC−１、ヒト口腔底癌
由来樹立株細胞KB、およびヒト筋原性肉腫由来
樹立株細胞HMSの５種類を使用した。 ２ 培養 成長用培地には10％牛新生児血清を添加した
Basal Medium Eagle（BME）および５％牛新
生児血清を添加したRPMI1640を成長用培地
（growth medium）として用い、抽出用の培地
としては、血清無添加のBMEを使用した。 まず成長用培地を用い、培養器に飽和状態にな
るまで悪性腫瘍細胞を増殖し、その後１回洗つて
血清を除く。次に、これを抽出用培地にてそのま
ま３〜４日間37℃にて培養するか、または通常の
継代培養の如く、前記増殖細胞のうちから既知の
細胞数を新たに抽出用培地に播き直して３〜４日
間37℃にて培養し、その培地を採取する。 ３ 部分精製 採種した培地を10000，1000の分子篩にかけ、
濾過液を採取する。 ４ 悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の検定法 検定に使用した細胞は実験材料に用いた５種類
の株細胞、および63才の正常人男子前胸部皮膚よ
り採取した正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63を用い、その増殖状況を成長曲線および
濃度反応曲線に表わして調べた。 ａ 成長曲線 既知の細胞数を培養器に播き、濾過済みの抽出
用培地にBME培地と同組成、同量のグルコース、
アミノ酸、ビタミンを加え、さらに新鮮な前述の
血清を10％添加したものを成長用培地として用
い、経日的に細胞数を測定するか、または一定期
間培養した後、細胞数を調べる。 ｂ 濃度反応曲線 培養後培地および新鮮培地を各種割合で混合
し、成長曲線と同様に各種栄養を加えて一定期間
培養した後、細胞数を調べる。 ５ 実験結果 第１図〜第５図は各種細胞の培養後培地におけ
る細胞増殖の経日的変化を成長曲線に表わしたも
のである。いづれの実験においても、実験群は各
種悪性腫瘍細胞の培養後培地をアミコンYM5
（M.W.103）で限界濾過後、栄養源としてグルコ
ース、アミノ酸、ビタミン、血清10％を添加した
培地を用い、対照群は新鮮培地BMEに実験群と
同様の栄養源を添加したものを用いた。細胞の初
期濃度は１×104cellsとし、第１図の実験では35
mmの培養器を、第２図〜第５図の実験では15mmの
培養器を用いた。 第１図の実験はヒト腎細胞癌由来樹立株細胞
HRCの経日的変化を調べたもので、対照群の細
胞は増加しているのに比べ、ヒト腎細胞癌由来樹
立株細胞HRC培養後培養地より抽出した物質を
含む実験群は、増殖が抑制されていることが明ら
かに示されている。 第２図Ａは正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63の経日的変化を、第２図Ｂはヒト胃癌由
来樹立株細胞MKの経日的変化を調べたもので、
いずれも実験群にはヒト胃癌由来樹立株細胞MK
の培養後培地より抽出した物質を含む培地を用い
ている。これらの成長曲線から、正常細胞に比べ
ヒト胃癌由来樹立株細胞MKの実験群は、明確に
成長阻止効果が表われている。 第３図は、ヒト肺癌由来樹立株細胞PC−１の
経日的変化を調べたもので、ヒト肺癌由来樹立株
細胞PC−１の培養後培地より抽出した物質を含
む実験群の細胞は減少し、致死効果が認められ
る。 第４図は、ヒト口腔癌由来樹立株細胞KBの経
日的変化を調べたもので、ヒト口腔癌由来樹立株
細胞KBの培養後培地より抽出した物質を含む実
験群の細胞は、一時増加するが、やがて減少す
る。 第５図は、ヒト筋原性肉腫由来樹立株細胞
HMSの経日的変化を調べたもので、ヒト筋原性
肉腫由来樹立株細胞HMSの培養後培地より抽出
した物質を含む実験群の細胞は減少し、致死効果
が認められる。 第６図、第７図は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細
胞HRCの培養後培地と新鮮培地の各種混合比に
おける濃度反応を調べたもので、第６図はヒト腎
細胞癌由来樹立株細胞HRCの濃度反応曲線を、
第７図は正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63
の濃度反応曲線を表わしている。いづれも培養後
培養地を分子量1000の分子を篩い分ける膜である
アミコン社製YM2により濾過したものを使用し、
百分比は培養後培地と新鮮培地との和に対して培
養後培地の含まれる割合を示している。これらの
図より、培養後培地は正常細胞にも増殖抑制反応
を示すが悪性腫瘍の一例であるヒト腎細胞癌由来
樹立株細胞HRCには増殖抑制効果がより強く認
められる。 表１は、限外濾過法による各分子量の分級
（fraction）の細胞増殖の効果を比較したもので、
正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63と、ヒト
腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを用いている。 表中，，はグループの番号を示し、，
の分子量（M.W.）103以下の分級に特異的にヒ
ト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCに対して増殖抑
制および致死効果を持つものが存在する。ただ
し、この分画は正常細胞へも影響を与えるが、形
態的観察では正常細胞に対する致死効果は認めら
れない。
る。 この発明は人の悪性腫瘍細胞を培養し、その培
養後培地より前記悪性腫瘍細胞を除いて抽出した
もので、人の腫瘍細胞に対し、増殖抑制や細胞致
死効果を特異的に有すものである。この悪性腫瘍
細胞増殖抑制物質は、低分子の物質であり、分子
量1000の分子を篩い分けるアミコン社製のYM2
や、UM10などのフイルターを透過可能であり、
これらを用いて抽出することができる。抽出して
得られたこの物質は、正常細胞に対しても多少の
増殖抑制が認められるが、悪性腫瘍細胞に対する
増殖抑制力とは著しい差異があり、正常細胞に対
して致死効果が認められないことから、この発明
により得られた悪性腫瘍細胞増殖抑制剤は、在来
の抗腫瘍剤のような副作用はほとんどないと考え
られる。 また、人の悪性腫瘍細胞に人の正常細胞を混合
培養してもその培養後培地より抽出したものが同
様の効果が得られる。そして、混合培養後の培地
と新鮮通常培地との比率を選べば、正常細胞は増
殖し、悪性腫瘍細胞の増殖は著しく低下させるこ
とができる。 次に、この発明の効果を確認するために実験方
法について述べる。 実験 １ １ 実験材料とした細胞 人の悪性腫瘍より分離した多種類の培養樹立株
細胞を使用した。すなわち、ヒト腎細胞癌由来樹
立株細胞HRC、ヒト胃癌由来樹立株細胞MK、
ヒト肺癌由来樹立株細胞PC−１、ヒト口腔底癌
由来樹立株細胞KB、およびヒト筋原性肉腫由来
樹立株細胞HMSの５種類を使用した。 ２ 培養 成長用培地には10％牛新生児血清を添加した
Basal Medium Eagle（BME）および５％牛新
生児血清を添加したRPMI1640を成長用培地
（growth medium）として用い、抽出用の培地
としては、血清無添加のBMEを使用した。 まず成長用培地を用い、培養器に飽和状態にな
るまで悪性腫瘍細胞を増殖し、その後１回洗つて
血清を除く。次に、これを抽出用培地にてそのま
ま３〜４日間37℃にて培養するか、または通常の
継代培養の如く、前記増殖細胞のうちから既知の
細胞数を新たに抽出用培地に播き直して３〜４日
間37℃にて培養し、その培地を採取する。 ３ 部分精製 採種した培地を10000，1000の分子篩にかけ、
濾過液を採取する。 ４ 悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の検定法 検定に使用した細胞は実験材料に用いた５種類
の株細胞、および63才の正常人男子前胸部皮膚よ
り採取した正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63を用い、その増殖状況を成長曲線および
濃度反応曲線に表わして調べた。 ａ 成長曲線 既知の細胞数を培養器に播き、濾過済みの抽出
用培地にBME培地と同組成、同量のグルコース、
アミノ酸、ビタミンを加え、さらに新鮮な前述の
血清を10％添加したものを成長用培地として用
い、経日的に細胞数を測定するか、または一定期
間培養した後、細胞数を調べる。 ｂ 濃度反応曲線 培養後培地および新鮮培地を各種割合で混合
し、成長曲線と同様に各種栄養を加えて一定期間
培養した後、細胞数を調べる。 ５ 実験結果 第１図〜第５図は各種細胞の培養後培地におけ
る細胞増殖の経日的変化を成長曲線に表わしたも
のである。いづれの実験においても、実験群は各
種悪性腫瘍細胞の培養後培地をアミコンYM5
（M.W.103）で限界濾過後、栄養源としてグルコ
ース、アミノ酸、ビタミン、血清10％を添加した
培地を用い、対照群は新鮮培地BMEに実験群と
同様の栄養源を添加したものを用いた。細胞の初
期濃度は１×104cellsとし、第１図の実験では35
mmの培養器を、第２図〜第５図の実験では15mmの
培養器を用いた。 第１図の実験はヒト腎細胞癌由来樹立株細胞
HRCの経日的変化を調べたもので、対照群の細
胞は増加しているのに比べ、ヒト腎細胞癌由来樹
立株細胞HRC培養後培養地より抽出した物質を
含む実験群は、増殖が抑制されていることが明ら
かに示されている。 第２図Ａは正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63の経日的変化を、第２図Ｂはヒト胃癌由
来樹立株細胞MKの経日的変化を調べたもので、
いずれも実験群にはヒト胃癌由来樹立株細胞MK
の培養後培地より抽出した物質を含む培地を用い
ている。これらの成長曲線から、正常細胞に比べ
ヒト胃癌由来樹立株細胞MKの実験群は、明確に
成長阻止効果が表われている。 第３図は、ヒト肺癌由来樹立株細胞PC−１の
経日的変化を調べたもので、ヒト肺癌由来樹立株
細胞PC−１の培養後培地より抽出した物質を含
む実験群の細胞は減少し、致死効果が認められ
る。 第４図は、ヒト口腔癌由来樹立株細胞KBの経
日的変化を調べたもので、ヒト口腔癌由来樹立株
細胞KBの培養後培地より抽出した物質を含む実
験群の細胞は、一時増加するが、やがて減少す
る。 第５図は、ヒト筋原性肉腫由来樹立株細胞
HMSの経日的変化を調べたもので、ヒト筋原性
肉腫由来樹立株細胞HMSの培養後培地より抽出
した物質を含む実験群の細胞は減少し、致死効果
が認められる。 第６図、第７図は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細
胞HRCの培養後培地と新鮮培地の各種混合比に
おける濃度反応を調べたもので、第６図はヒト腎
細胞癌由来樹立株細胞HRCの濃度反応曲線を、
第７図は正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63
の濃度反応曲線を表わしている。いづれも培養後
培養地を分子量1000の分子を篩い分ける膜である
アミコン社製YM2により濾過したものを使用し、
百分比は培養後培地と新鮮培地との和に対して培
養後培地の含まれる割合を示している。これらの
図より、培養後培地は正常細胞にも増殖抑制反応
を示すが悪性腫瘍の一例であるヒト腎細胞癌由来
樹立株細胞HRCには増殖抑制効果がより強く認
められる。 表１は、限外濾過法による各分子量の分級
（fraction）の細胞増殖の効果を比較したもので、
正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63と、ヒト
腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを用いている。 表中，，はグループの番号を示し、，
の分子量（M.W.）103以下の分級に特異的にヒ
ト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCに対して増殖抑
制および致死効果を持つものが存在する。ただ
し、この分画は正常細胞へも影響を与えるが、形
態的観察では正常細胞に対する致死効果は認めら
れない。
【表】
６ 動物実験
ヌードマウス1CRNU／NUにヒト腎細胞由来
株化細胞HRCを５×106ケ移殖し着床を確認後２
群に分けた。 移殖７日目よりコントロール群には培地BME
を、実験群には前記１）〜３）で作製した分子量
1000以下の抑制剤原液1000倍濃縮液0.3mlを１日
１回12日間皮下投与し、50日目に腫瘍を取出し秤
量した。 表２はその結果を示す。
株化細胞HRCを５×106ケ移殖し着床を確認後２
群に分けた。 移殖７日目よりコントロール群には培地BME
を、実験群には前記１）〜３）で作製した分子量
1000以下の抑制剤原液1000倍濃縮液0.3mlを１日
１回12日間皮下投与し、50日目に腫瘍を取出し秤
量した。 表２はその結果を示す。
【表】
７ 有効量及び投与方法
ヌードマウス1CRNU／NUに対する有効量及
び投与方法は前記１）〜３）で作成した分子量
1000以下の抑制剤原液の1000倍濃縮液0.3mlを１
日１回皮下に投与する。 ８ 急性毒性試験 15mm径のプラスチツク24穴マルチプレートに正
常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63とヒト腎細
胞癌由来樹立株細胞HRCをそれぞれ１×105ケず
つ植え込み、10％牛胎児血清を添加した市販合成
培地EaglesMEM990μに各種濃度の前記１）〜
３）で作製した抑制剤10μを加えたものを培地
として加え、72時間37℃で100％濃度５％CO2含
有空気中で培養後、メチレンブルー色素取込み量
を620mmでの光学密度値として測定し、これを生
存率−抑制剤濃度線として第１６図に示す。 ９ 製剤化 前記１）〜３）で作成した抑制剤原液を遠心分
離して固形物を除き、凍結乾燥する。その水溶部
分のみを水溶液とし、PH8.0でブタノール抽出
し、水層部分のみをとり、中和後減圧乾燥し、水
に溶し、溶離液0.3％酢酸メタノール（１：１）
で予め平衡化しておいたポリアクリルニトリルゲ
ル（バイオラツドのＰ−２）カラムにかけ、溶離
を電気伝導度モニターで検知し、第２ピーク
（Fr2）として活性部分を得る。 収量は原液１に対して200mgである。 10 ヒトに対する用法 製 剤；前記抑制剤100mgを１mlの水又はプロピ
レングリコールに溶解したものを用いる。 投与方法；静脈注射（点滴） 投与量；体重１Kg当り300mgを投与する。 実験 ２ １ 実験材料とした細胞 53才、及び63才の正常人の男子前胸部皮膚より
採取した正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞、及びヒ
ト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを用いた。 ２ 培養 培地には、10％牛新生児血清を添加したBasal
Medium，Eagle（BME）を用いた。培養条件は、
閉鎖系または５％CO2，100％湿度の大気中で行
なう開放系を用い、37℃で培養した。 混合培養は、上記培地で、まず、人の線維芽細
胞を培養する。培養器に細胞が一面すき間なく生
えた状態になつたとき、ヒト腎細胞癌由来樹立株
細胞HRCを107〜２×107個接種する。なお、こ
のとき用いる培養器は、通称Roux壜（ルーびん）
といわれるものを使用する。そして、混合培養時
には前記Roux壜から前記10％牛新生児血清を排
出し、新しく使用する培地は、前述の血清無添加
のBMEを用い、４日間37℃にて培養後、培地を
採取する。 ３ 透析，濃縮 採取した培地をヴイスキングチユーブ（セロフ
アンでできたチユーブで通常の透析に用いるも
の）に容れ、外側をポリエチレン・グリコールに
てまぶし、水分を抽出して濃縮する。その後、10
ｍＭ重炭酸ナトリウム添加脱イオンにて透析を行
なう。 ４ 癌細胞増殖抑制剤の検定法 検定に用いる癌細胞は、ヒト腎細胞癌由来樹立
株細胞HRC及び人の口腔底癌より樹立したヒト
口腔底癌由来樹立株細胞KBを用いた。採取した
培地及び透析した培地をシヤーレ内の10％血清添
加新鮮培地に添加したものを用い、ヒト腎細胞癌
由来樹立株細胞HRC及びヒト口腔底癌由来樹立
株細胞KBの２種の癌細胞及び正常ヒト線維芽細
胞を培養し、その増殖状況を調べた。 ５ 実験結果 第８図は、10％新鮮血清添加通常培地、20％新
鮮血清添加通常培地、正常細胞培養後に10％血清
を添加した培地、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞培
養後の培地及び混合培養培地の各種条件の培地を
使用し、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを増
殖した時の日数に対する細胞数を示す増殖曲線
で、混合培養後培地で培養したときのみ、癌細胞
増殖抑制及び破壊が認められる。 第９図は、第１図と同様な各種類の培地を使用
し、正常ヒト線維芽細胞を培養したもので、混合
培養後培地においても日数に対する細胞数は増殖
傾向を示す。 第１０図は、混合培養を無血清培地で行ない、
その培地に10％新鮮血清を添加したものと10％血
清添加通常培地とHRC培養後の血清無添加培地
とにヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを培養し
たもので、この結果より無血清培地にて混合培養
を行なつても同様の効果が得られることがわかつ
た。したがつて、この方法によれば、人の癌細胞
増殖抑制剤の抽出が血清の存在に邪魔されずにス
ムーズに行なうことが可能であることがわかる。 第１１図は、混合培養後培地と10％血清添加新
鮮通常培地との和に対する混合培養後培地の各種
の百聞比率による混合を行なつたときのヒト正常
線維芽細胞、及びヒト腎細胞癌由来樹立株細胞
HRCの増殖度を示したものである。正常細胞は
一部比率では正常細胞培地より高い増殖度を示
し、癌細胞は対数的に増殖度が低下する。 第１２図は、第４図と同じ培地またはHRC培
養後培地と10％血清添加通常培地に対する混合培
養後培地またはHRC培養後培地における他の癌
細胞であるヒト口腔底癌由来樹立株細胞KBの増
殖度を示したもので、混合培養後培地の方がその
混合比率が高くなるほど抑制度も高くなる。した
がつて混合培養後培地は、癌細胞増殖抑制に寄与
しており、この抑制は物質によつて惹起されるこ
とを表わしている。 第１３図は、無血清培養培地にて、混合培養を
行なつた培養後培地を透析したものと10％血清添
加通常培地と、HRC培養後培地と、10％血清添
加通常培地との混合割合に対する５日間のHRC
の細胞数の変化を調べたもので、混合培養後培地
抽出物を添加した培地に著明な細胞増殖抑制効果
が認められた。 なお、人の線維芽細胞や癌細胞は様々なものが
あり、一種類に限らず、同様の効果が認められ
る。しかし、正常細胞と癌細胞の混合比率によ
り、力価の変化が認められ、上記実験から、正常
細胞700〜1000万に対し、癌細胞1000万〜2000万
を接種するのが好ましいと考えられる。参考のた
め、第１４図、第１５図を添付する。 第１４図は、10％血清添加通常培地と混合培養
培地との和に対する混合培養培地の割合を横軸に
とり、混合培養の癌細胞HRCと同種の癌細胞
HRCの接種数をそれぞれ変化させた場合の５日
間の癌細胞数を縦軸に示したものであつて、癌細
胞接種数が大きいほど、また、混合培養培地の割
合が高いほど癌細胞数が少なくなつている。 第１５図は、10％血清通常培地と混合培養培地
との和に対する混合培養培地の割合を横軸にと
り、混合培養の癌細胞HRCと異なつた癌細胞KB
の接種数をそれぞれ変化させた場合の５日間の癌
細胞数を縦軸に示したものであつて、癌細胞が異
なるものであつても、第１４図に示す傾向が見ら
れることを示している。 また培地の種類は、BMEに限らず、他の培地
を用いてもよい。血清添加も10％に限らず他の濃
度、または無血清でもよく、牛新生児血清の他、
成牛の血清、仔牛、牛胎児、または他の動物のも
のを使用することもできる。さらに、培養は静置
培養やその他浮遊培養系を用いてもよく、培養器
も様々あるので、適宜選択することは自由であ
る。
び投与方法は前記１）〜３）で作成した分子量
1000以下の抑制剤原液の1000倍濃縮液0.3mlを１
日１回皮下に投与する。 ８ 急性毒性試験 15mm径のプラスチツク24穴マルチプレートに正
常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63とヒト腎細
胞癌由来樹立株細胞HRCをそれぞれ１×105ケず
つ植え込み、10％牛胎児血清を添加した市販合成
培地EaglesMEM990μに各種濃度の前記１）〜
３）で作製した抑制剤10μを加えたものを培地
として加え、72時間37℃で100％濃度５％CO2含
有空気中で培養後、メチレンブルー色素取込み量
を620mmでの光学密度値として測定し、これを生
存率−抑制剤濃度線として第１６図に示す。 ９ 製剤化 前記１）〜３）で作成した抑制剤原液を遠心分
離して固形物を除き、凍結乾燥する。その水溶部
分のみを水溶液とし、PH8.0でブタノール抽出
し、水層部分のみをとり、中和後減圧乾燥し、水
に溶し、溶離液0.3％酢酸メタノール（１：１）
で予め平衡化しておいたポリアクリルニトリルゲ
ル（バイオラツドのＰ−２）カラムにかけ、溶離
を電気伝導度モニターで検知し、第２ピーク
（Fr2）として活性部分を得る。 収量は原液１に対して200mgである。 10 ヒトに対する用法 製 剤；前記抑制剤100mgを１mlの水又はプロピ
レングリコールに溶解したものを用いる。 投与方法；静脈注射（点滴） 投与量；体重１Kg当り300mgを投与する。 実験 ２ １ 実験材料とした細胞 53才、及び63才の正常人の男子前胸部皮膚より
採取した正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞、及びヒ
ト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを用いた。 ２ 培養 培地には、10％牛新生児血清を添加したBasal
Medium，Eagle（BME）を用いた。培養条件は、
閉鎖系または５％CO2，100％湿度の大気中で行
なう開放系を用い、37℃で培養した。 混合培養は、上記培地で、まず、人の線維芽細
胞を培養する。培養器に細胞が一面すき間なく生
えた状態になつたとき、ヒト腎細胞癌由来樹立株
細胞HRCを107〜２×107個接種する。なお、こ
のとき用いる培養器は、通称Roux壜（ルーびん）
といわれるものを使用する。そして、混合培養時
には前記Roux壜から前記10％牛新生児血清を排
出し、新しく使用する培地は、前述の血清無添加
のBMEを用い、４日間37℃にて培養後、培地を
採取する。 ３ 透析，濃縮 採取した培地をヴイスキングチユーブ（セロフ
アンでできたチユーブで通常の透析に用いるも
の）に容れ、外側をポリエチレン・グリコールに
てまぶし、水分を抽出して濃縮する。その後、10
ｍＭ重炭酸ナトリウム添加脱イオンにて透析を行
なう。 ４ 癌細胞増殖抑制剤の検定法 検定に用いる癌細胞は、ヒト腎細胞癌由来樹立
株細胞HRC及び人の口腔底癌より樹立したヒト
口腔底癌由来樹立株細胞KBを用いた。採取した
培地及び透析した培地をシヤーレ内の10％血清添
加新鮮培地に添加したものを用い、ヒト腎細胞癌
由来樹立株細胞HRC及びヒト口腔底癌由来樹立
株細胞KBの２種の癌細胞及び正常ヒト線維芽細
胞を培養し、その増殖状況を調べた。 ５ 実験結果 第８図は、10％新鮮血清添加通常培地、20％新
鮮血清添加通常培地、正常細胞培養後に10％血清
を添加した培地、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞培
養後の培地及び混合培養培地の各種条件の培地を
使用し、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを増
殖した時の日数に対する細胞数を示す増殖曲線
で、混合培養後培地で培養したときのみ、癌細胞
増殖抑制及び破壊が認められる。 第９図は、第１図と同様な各種類の培地を使用
し、正常ヒト線維芽細胞を培養したもので、混合
培養後培地においても日数に対する細胞数は増殖
傾向を示す。 第１０図は、混合培養を無血清培地で行ない、
その培地に10％新鮮血清を添加したものと10％血
清添加通常培地とHRC培養後の血清無添加培地
とにヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCを培養し
たもので、この結果より無血清培地にて混合培養
を行なつても同様の効果が得られることがわかつ
た。したがつて、この方法によれば、人の癌細胞
増殖抑制剤の抽出が血清の存在に邪魔されずにス
ムーズに行なうことが可能であることがわかる。 第１１図は、混合培養後培地と10％血清添加新
鮮通常培地との和に対する混合培養後培地の各種
の百聞比率による混合を行なつたときのヒト正常
線維芽細胞、及びヒト腎細胞癌由来樹立株細胞
HRCの増殖度を示したものである。正常細胞は
一部比率では正常細胞培地より高い増殖度を示
し、癌細胞は対数的に増殖度が低下する。 第１２図は、第４図と同じ培地またはHRC培
養後培地と10％血清添加通常培地に対する混合培
養後培地またはHRC培養後培地における他の癌
細胞であるヒト口腔底癌由来樹立株細胞KBの増
殖度を示したもので、混合培養後培地の方がその
混合比率が高くなるほど抑制度も高くなる。した
がつて混合培養後培地は、癌細胞増殖抑制に寄与
しており、この抑制は物質によつて惹起されるこ
とを表わしている。 第１３図は、無血清培養培地にて、混合培養を
行なつた培養後培地を透析したものと10％血清添
加通常培地と、HRC培養後培地と、10％血清添
加通常培地との混合割合に対する５日間のHRC
の細胞数の変化を調べたもので、混合培養後培地
抽出物を添加した培地に著明な細胞増殖抑制効果
が認められた。 なお、人の線維芽細胞や癌細胞は様々なものが
あり、一種類に限らず、同様の効果が認められ
る。しかし、正常細胞と癌細胞の混合比率によ
り、力価の変化が認められ、上記実験から、正常
細胞700〜1000万に対し、癌細胞1000万〜2000万
を接種するのが好ましいと考えられる。参考のた
め、第１４図、第１５図を添付する。 第１４図は、10％血清添加通常培地と混合培養
培地との和に対する混合培養培地の割合を横軸に
とり、混合培養の癌細胞HRCと同種の癌細胞
HRCの接種数をそれぞれ変化させた場合の５日
間の癌細胞数を縦軸に示したものであつて、癌細
胞接種数が大きいほど、また、混合培養培地の割
合が高いほど癌細胞数が少なくなつている。 第１５図は、10％血清通常培地と混合培養培地
との和に対する混合培養培地の割合を横軸にと
り、混合培養の癌細胞HRCと異なつた癌細胞KB
の接種数をそれぞれ変化させた場合の５日間の癌
細胞数を縦軸に示したものであつて、癌細胞が異
なるものであつても、第１４図に示す傾向が見ら
れることを示している。 また培地の種類は、BMEに限らず、他の培地
を用いてもよい。血清添加も10％に限らず他の濃
度、または無血清でもよく、牛新生児血清の他、
成牛の血清、仔牛、牛胎児、または他の動物のも
のを使用することもできる。さらに、培養は静置
培養やその他浮遊培養系を用いてもよく、培養器
も様々あるので、適宜選択することは自由であ
る。
第１図は、各培地におけるヒト腎細胞癌由来樹
立株細胞HRCの増殖を示す図、第２図Ａは、各
培地における正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63の増殖を示す図、第２図Ｂは、各培地に
おけるヒト胃癌由来樹立株細胞MKの増殖を示す
図、第３図は、各培地におけるヒト肺癌由来樹立
株細胞PC−１の増殖を示す図、第４図は、各培
地におけるヒト口腔癌由来樹立株細胞KBの増殖
を示す図、第５図は、各培地におけるヒト筋原性
肉腫由来樹立株細胞HMSの増殖を示す図、第６
図は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCの培養
後培地と新鮮培地の各種混合比におけるヒト腎細
胞癌由来樹立株細胞HRCの濃度反応を示す図、
第７図は、第６図と同様の各培地における正常ヒ
ト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63の濃度反応を示
す図、第８図は、各培地における癌細胞の増殖を
示す図、第９図は、各培地における正常細胞の増
殖を示す図、第１０図は、無血清培地における癌
細胞の増殖を示す図、第１１図は、混合培養後培
地と新鮮通常培地との各種混合比率の培地におけ
る正常細胞及び癌細胞の増殖を示す図、第１２図
は、混合培養培後地と新鮮通常培地との各種混合
比率の培地における他の種数の癌細胞の増殖を示
す図、第１３図は、無血清培地にて混合培養後の
培地の透析物を添加した培地の癌細胞の増殖を示
す図、第１４図は、各培地における癌細胞接種数
毎の増殖を示す図、第１５図は、各培地における
KB細胞の増殖を示す図、第１６図は、本発明の
抑制剤の急性毒性試験の結果を示す線図である。
立株細胞HRCの増殖を示す図、第２図Ａは、各
培地における正常ヒト２倍体皮膚線維芽細胞
NAS63の増殖を示す図、第２図Ｂは、各培地に
おけるヒト胃癌由来樹立株細胞MKの増殖を示す
図、第３図は、各培地におけるヒト肺癌由来樹立
株細胞PC−１の増殖を示す図、第４図は、各培
地におけるヒト口腔癌由来樹立株細胞KBの増殖
を示す図、第５図は、各培地におけるヒト筋原性
肉腫由来樹立株細胞HMSの増殖を示す図、第６
図は、ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞HRCの培養
後培地と新鮮培地の各種混合比におけるヒト腎細
胞癌由来樹立株細胞HRCの濃度反応を示す図、
第７図は、第６図と同様の各培地における正常ヒ
ト２倍体皮膚線維芽細胞NAS63の濃度反応を示
す図、第８図は、各培地における癌細胞の増殖を
示す図、第９図は、各培地における正常細胞の増
殖を示す図、第１０図は、無血清培地における癌
細胞の増殖を示す図、第１１図は、混合培養後培
地と新鮮通常培地との各種混合比率の培地におけ
る正常細胞及び癌細胞の増殖を示す図、第１２図
は、混合培養培後地と新鮮通常培地との各種混合
比率の培地における他の種数の癌細胞の増殖を示
す図、第１３図は、無血清培地にて混合培養後の
培地の透析物を添加した培地の癌細胞の増殖を示
す図、第１４図は、各培地における癌細胞接種数
毎の増殖を示す図、第１５図は、各培地における
KB細胞の増殖を示す図、第１６図は、本発明の
抑制剤の急性毒性試験の結果を示す線図である。
Claims (1)
- １ ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞、ヒト胃癌由来
樹立株細胞、ヒト肺癌由来樹立株細胞、ヒト口腔
底癌由来樹立株細胞およびヒト筋原性肉胚由来樹
立株細胞から選ばれた人の悪性腫瘍細胞を血清無
添加の培地中で３〜４日間培養し、その培地より
前記腫瘍細胞並びに分子量1000以上のものを除外
してなる人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57143340A JPS5933223A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤 |
| DE8383304845T DE3377141D1 (en) | 1982-08-20 | 1983-08-22 | An agent for inhibiting proliferation of malignant tumour cells |
| EP83304845A EP0102801B1 (en) | 1982-08-20 | 1983-08-22 | An agent for inhibiting proliferation of malignant tumour cells |
| US06/785,229 US4810495A (en) | 1982-08-20 | 1985-10-07 | Agent for inhibiting proliferation of human malignant tumor cells |
| US07/282,458 US4963358A (en) | 1982-08-20 | 1988-12-09 | Agent for inhibiting proliferation of human malignant tumor cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57143340A JPS5933223A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5933223A JPS5933223A (ja) | 1984-02-23 |
| JPH0360804B2 true JPH0360804B2 (ja) | 1991-09-17 |
Family
ID=15336507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57143340A Granted JPS5933223A (ja) | 1982-08-20 | 1982-08-20 | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4810495A (ja) |
| EP (1) | EP0102801B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5933223A (ja) |
| DE (1) | DE3377141D1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59162889A (ja) * | 1983-03-07 | 1984-09-13 | Koken Kk | 人の悪性腫瘍細胞の増殖抑制剤の製造方法 |
| JPS59204122A (ja) * | 1983-05-06 | 1984-11-19 | Koken Kk | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の製造方法 |
| JPS6028931A (ja) * | 1983-07-28 | 1985-02-14 | Koken Kk | ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞の増殖抑制剤の濃縮方法 |
| JPS6028930A (ja) * | 1983-07-28 | 1985-02-14 | Koken Kk | 人の癌由来細胞の増殖抑制剤の精製方法 |
| JPS6043386A (ja) * | 1983-08-20 | 1985-03-07 | Koken Kk | ヒト腎細胞癌由来樹立株細胞の増殖抑制剤の製造方法 |
| JP2691557B2 (ja) * | 1988-04-15 | 1997-12-17 | 興研株式会社 | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤 |
| MD838G2 (ro) * | 1992-07-21 | 1998-09-30 | Alexandr Nicolaenco | Remediu biologic activ cu proprietate imunomodulatoare, procedeu de obţinere a lui, preparat pe baza lui şi procedeu de normalizare a stării fiziologice a omului şi animalelor |
| US5506242A (en) * | 1993-01-06 | 1996-04-09 | Ciba-Geigy Corporation | Arylsufonamido-substituted hydroxamic acids |
| US7297331B2 (en) | 1996-04-03 | 2007-11-20 | The Rogosin Institute | Beads containing restricted cancer cells producing material suppressing cancer cell proliferation |
| US6224912B1 (en) | 1996-04-03 | 2001-05-01 | The Rogo Institute | Cancer-cell proliferation-suppressing material produced by cancer cells restricted by entrapment |
| RU2225211C1 (ru) * | 2002-07-17 | 2004-03-10 | Камакин Владислав Владимирович | Способ коррекции функционального состояния органов пациента |
| JP2004155670A (ja) * | 2002-11-01 | 2004-06-03 | Youichirou Naganushi | 細胞賦活剤、細胞賦活剤製造方法及びその装置 |
| KR20200007802A (ko) | 2017-05-17 | 2020-01-22 | 고쿠리츠겐큐가이하츠호징 노우교 · 쇼쿠힝 산교기쥬츠 소고겐큐기코 | 비트리겔막 건조체의 제조 방법 및 제조 장치 |
| CA3078175C (en) | 2017-10-05 | 2023-06-20 | Medical Corporation Ichikawa Clinic | Method for preparing cell extract component or composition having cytocidal activity |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3865689A (en) * | 1972-11-09 | 1975-02-11 | Hoffmann La Roche | Method of producing carcinoembryonic antigens |
| US4415553A (en) * | 1973-08-06 | 1983-11-15 | Dso "Pharmachim" | Compositions, processes for their preparation and method for treatment of neoplasms |
| FR2302747B1 (fr) * | 1975-03-03 | 1978-09-22 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede d'obtention, a partir de macrophages de mammiferes, d'un produit therapeutique actif, notamment, a l'egard des cellules tumorales humaines et produit therapeutique ainsi obtenu |
| DE2600442A1 (de) * | 1976-01-08 | 1977-07-14 | Karl Dr Med Theurer | Herstellung von biologischen arzneimitteln gegen maligne tumoren und blutkrankheiten aus zell- bzw. gewebekulturen |
| DE2619715A1 (de) * | 1976-05-04 | 1977-11-24 | Max Planck Gesellschaft | Tumor-antigen und verfahren zu dessen herstellung |
| US4059486A (en) * | 1976-11-03 | 1977-11-22 | Monsanto Company | Cell culture process |
| US4228236A (en) * | 1978-05-15 | 1980-10-14 | Northwestern University | Process of producing carcinoembryonic antigen |
| JPS54157815A (en) * | 1978-05-29 | 1979-12-13 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | Anti-tumor substance and its preparation |
| US4559228A (en) * | 1980-05-01 | 1985-12-17 | Torre Daniel M De | Composition and method for the treatment of cancer |
| JPS58138383A (ja) * | 1982-02-13 | 1983-08-17 | Nippon Shinyaku Co Ltd | 生理活性物質の製法 |
| US4588587A (en) * | 1983-03-01 | 1986-05-13 | Pennsylvania Hospital | Method of treatment to inhibit metastasis |
| JPS59204122A (ja) * | 1983-05-06 | 1984-11-19 | Koken Kk | 人の悪性腫瘍細胞増殖抑制剤の製造方法 |
-
1982
- 1982-08-20 JP JP57143340A patent/JPS5933223A/ja active Granted
-
1983
- 1983-08-22 EP EP83304845A patent/EP0102801B1/en not_active Expired
- 1983-08-22 DE DE8383304845T patent/DE3377141D1/de not_active Expired
-
1985
- 1985-10-07 US US06/785,229 patent/US4810495A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-12-09 US US07/282,458 patent/US4963358A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5933223A (ja) | 1984-02-23 |
| US4810495A (en) | 1989-03-07 |
| EP0102801A2 (en) | 1984-03-14 |
| DE3377141D1 (en) | 1988-07-28 |
| US4963358A (en) | 1990-10-16 |
| EP0102801A3 (en) | 1985-01-16 |
| EP0102801B1 (en) | 1988-06-22 |
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