【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、ヒアルロン酸の収率のよい製造方法
に関する。
ヒアルロン酸は、鶏冠や臍の緒等の主として動
物の結合組織中に含まれている。そして、かかる
結合組織から抽出・精製して得た純度の高いヒア
ルロン酸は、女性の肌を美しくする特効薬である
ことが知られている。
しかし、いかに純度の高いヒアルロン酸であつ
ても、ヒアルロン酸が低分子に分解されてしまつ
たものであると、人の肌をなめらかにしたり、肌
の皺を延ばしたりする効果が天然状態のヒアルロ
ン酸に比べて著しく低いことが種々の研究によつ
て明らかにされている。
ところで、天然状態のヒアルロン酸は、高分子
（分子量略150万〜200万）であり、このヒアルロ
ン酸は高い粘度を示すのに対し、ヒアルロン酸が
分解して低分子となればなるほど粘度が低くなる
傾向にある。したがつて、化粧品業界では、化粧
品原料として用いるヒアルロン酸の品質の良否
は、粘度が高いか低いかによつて判断しているの
が現状である。
また、ヒアルロン酸を抽出するには、前処理と
して結合組織に酸やアルカリ剤又は酵素等を添加
し、結合組織中の蛋白質を分解させてヒアルロン
酸を遊離の状態にしなければならない。
しかして、ヒアルロン酸は高分子の化合物であ
るから蛋白質を分解させる際、ヒアルロン酸も酸
や酵素の作用を受けて分解し、低分子のものにな
つてしまう。
そこで、従来より、ヒアルロン酸の分解を可及
的に低く押え、結合組織の蛋白質のみを分解する
研究がなされ、例えば、結合組織をその形状のま
ま加熱処理した後細断し、而る後プロテアーゼ処
理をする方法（特開昭52−105199号）等が提案さ
れている。
しかしながら、上記従来法によるヒアルロン酸
の製造方法では、加熱によりヒアルロン酸の分解
を進行し難くすることによつて比較的高粘度のヒ
アルロン酸が得られるが、収率の点で必ずしも満
足できるものとは言い難い。
本発明は、ヒアルロン酸を収率よく製造する方
法を提供することを目的としてなされたものであ
り、予め加熱処理したヒアルロン酸含有原料をペ
ースト化した後、プロテアーゼ処理することを特
徴とするものである。
化学的に純粋なヒアルロン酸は、次のような構
造式のものであり、
グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの二糖
を反復構成単位とする分子量50万〜250万の多糖
類である。
そして、このヒアルロン酸を食塩水中で処理す
ると、解離しているナトリウムイオンがヒアルロ
ン酸を構成するグルクロン酸のカルボキシル基と
結合し、ヒアルロン酸はナトリウム塩を形成し
て、ヒアルロン酸ナトリウムに変化する。
しかして、本発明でいうヒアルロン酸とは、上
述の化学的に純粋なヒアルロン酸ばかりでなく、
そのナトリウム塩も含むものである。
本発明においては、まず、ヒアルロン酸含有原
料を加熱処理して、原料中に含まれている蛋白質
を熱変性させる。本発明で使用する原料は、ヒア
ルロン酸が含まれている動・植物性組織であれば
特に制限がなく例えば、鶏冠・臍の緒・眼球・皮
膚・軟骨等を挙げることができる。これらの原料
の中、鶏冠は、蛋白質の含量が略10％程度と低
く、蛋白質の分解が容易であるので、特に望まし
い。原料の加熱処理は如何なる方法をとつてもよ
いが、熱水中に原料を浸漬する方法をとると能率
よく行うことができる。加熱温度や時間は、原料
中の蛋白質が熱変性する範囲内であれば、特に制
限がなく、熱水による加熱法を採用する場合、60
〜100℃の熱水中に原料を20〜40分間浸漬すると
よい。
尚、凍結した原料を用いる場合には、原料をそ
のまま加熱してもよいが、後の試験例にも示すよ
うに原料を流水中等に入れ緩慢解凍した後、加熱
処理すると、比較的高粘度のヒアルロン酸を一層
収率よく製造することができる。
次に、加熱処理した原料をペースト化する。こ
のペースト化によりヒアルロン酸の収率が向上す
る。ペースト化に先だち、加熱処理後の原料を細
断機により薄く切断したり、または肉挽き用チヨ
ツパーなどで細断しておくと、ペースト化がしや
すくなる。ペースト化の一例を示せば、原料に、
原料重量に対して略１〜３倍の清水を加え、ホモ
ゲナイザーにて10〜30分間ホモゲナイズを行え
ば、原料は破砕・微粒子化され、ペーストに仕上
げることができる。尚、ペースト化には、ホモゲ
ナイザーの他に、高速撹拌機や擂潰機を用いても
よい。
次に、ペースト化した原料に蛋白分解酵素を添
加し、一定温度条件下に一定時間保持してプロテ
アーゼ処理する。使用する蛋白分解酵素は、市販
しているものであれば種類を問わず使用すること
ができ、一例を挙げれば、ペプシン・トリプシ
ン・パパイン・ブロメリン・フイシン等がある。
蛋白分解酵素の添加量は、使用する原料の蛋白質
の含有量によつて異なるが、鶏冠を使用する場
合、鶏冠に対して0.01〜0.05％が適当である。臍
の緒等の比較的蛋白質含有量の多い原料を使用す
る場合には、蛋白分解酵素を多目に添加すること
が望ましい。プロテアーゼ処理の温度と時間は、
使用する原料によつて異なるが、鶏冠を使用する
場合、35〜45℃で３〜10時間の範囲が適当であ
る。
最後に、プロテアーゼ処理したペーストからヒ
アルロン酸を抽出して、粗製のヒアルロン酸を得
た後、このヒアルロン酸を精製して精製ヒアルロ
ン酸を得る。ヒアルロン酸の抽出・精製は、常法
によればよく、一例を挙げれば、プロテアーゼ処
理したペーストを過して固形物を除去し、得ら
れた液にCPC（塩化セチルピリジニウム）を添
加してヒアルロン酸をCPCに吸着させて沈澱さ
せる。そして生じた沈澱物を分取し、分取した沈
澱物を食塩水中に溶解させた後、この食塩水にエ
タノールを添加して、再びヒアルロン酸を沈澱さ
せ、生じた沈澱物を分取すれば粗製のヒアルロン
酸を得ることができる。そして、この粗製のヒア
ルロン酸を清水中に溶解させた後、更にこの溶液
にエタノールを加え蛋白質分解物等の不純物を沈
澱させて除去し、而る後、この溶液に食塩水を加
えればヒアルロン酸が沈澱するので、生じた沈澱
物を分取すれば、精製ヒアルロン酸を得ることが
できる。尚、この抽出・精製法で得られる精製ヒ
アルロン酸はヒアルロン酸のみを単離した固形状
のものであるから、化粧品原料とするときは、清
水や油脂に溶解させて使用する。
以上述べたように、本発明によれば、予め加熱
処理したヒアルロン酸含有原料を、細断に止めな
いでペースト化した後にプロテアーゼ処理するこ
とにより、プロテアーゼ処理済みペーストから常
法によりヒアルロン酸を抽出・精製すれば、原因
は定かではなが、ヒアルロン酸を収率よく製造す
ることができる。
実施例
−20℃で30日間凍結保存した鶏冠５Kgを20℃の
流水中に入れ、２時間かけて緩慢解凍を行つた。
この鶏冠を80℃の熱水中に30分間浸漬した後、
取り出し、細断機にて厚さ２mmに切断した。
切断した鶏冠には清水15を加え、ホモゲナイ
ザー（(株)日音医理科器械製作所製「ヒスコトロ
ン」）にて20分間鶏冠組織を破砕・微粒子化して、
鶏冠のペースト20Kgを得た。
このペーストにプロテアーゼ（天理製薬(株)製
「アマノP3」）を1.5ｇ加え、40℃で５時間酵素処
理を行つた後、ペーストを過して液18Kgを得
た。
この液に10％CPC（塩化セチルピリジニウ
ム）水溶液900mlを添加して沈澱物を生じさせ、
沈澱物を別した。得られた沈澱物を0.4Mの食
塩水15中に入れて溶解させた後、更にこの食塩
水にエタノール23を加えて再び沈澱物を生じさ
せた。
この沈澱物を別・エタノール洗じよう・風乾
した結果、粗製のヒアルロン酸120ｇが得られた。
上記方法で得られた粗製のヒアルロン酸100ｇ
に清水10を加えてヒアルロン酸を溶解させ、更
にエタノール15を加えて、遠心分離機にて
10000γ・ｐ・ｍで30分間遠心分離した後、上澄
液20を採取した。
この上澄液に3Mの食塩水１を加えて沈澱物
を生じさせ、この沈澱物を別・エタノール洗じ
よう・風乾した結果、精製ヒアルロン酸43.3ｇが
得られた。
試験例
次の四つの方法により、それぞれ精製ヒアルロ
ン酸を試作した。
対象区Ａ
−20℃で30日間凍結保存した鶏冠５Kgを20℃の
流水中に入れ、２時間かけて緩慢解凍を行つた。
この鶏冠を80℃の熱水中に30分間浸漬した後、取
り出し、肉挽き用チヨツパーにかけて鶏冠を細断
した。
この細断した鶏冠を用いて、以降は実施例と同
じ方法でヒアルロン酸の抽出・精製を行つた。
対象区Ｂ
−20℃で30日間凍結保存した鶏冠５Kgをそのま
ま80℃の熱水中に30分間浸漬した後、取り出し、
肉挽き用チヨツパーにかけて鶏冠を細断した。
この細断した鶏冠を用いて、以降は実施例と同
じ方法でヒアルロン酸の抽出・精製を行つた。
テスト区Ａ
−20℃で30日間凍結保存した鶏冠５Kgを実施例
と同じ方法で前処理及びヒアルロン酸の抽出・精
製を行つた。
テスト区Ｂ
−20℃で30日間凍結保存した鶏冠５Kgをそのま
ま80℃の熱水中に30分間浸漬した後、取り出し、
この鶏冠を用いて、以降は実施例と同じ方法でヒ
アルロン酸の抽出・精製を行つた。
上記四つの方法でヒアルロン酸の抽出・精製を
した場合の精製ヒアルロン酸の収率を算出すると
共に、得られた精製ヒアルロン酸の粘度を測定し
たところ、表−１の結果が得られた。
The present invention relates to a method for producing hyaluronic acid with high yield. Hyaluronic acid is mainly contained in the connective tissues of animals, such as cockscombs and umbilical cords. Highly pure hyaluronic acid extracted and purified from such connective tissue is known to be a magic medicine for beautifying women's skin. However, no matter how pure hyaluronic acid is, if hyaluronic acid has been broken down into low molecules, the effect of smoothing human skin and smoothing out wrinkles will be due to hyaluronic acid in its natural state. Various studies have revealed that it is significantly lower than that of acids. By the way, hyaluronic acid in its natural state is a polymer (molecular weight approximately 1,500,000 to 2,000,000), and this hyaluronic acid exhibits high viscosity, but as hyaluronic acid decomposes and becomes lower molecular weight, the viscosity becomes lower. There is a tendency to Therefore, in the cosmetics industry, the quality of hyaluronic acid used as a cosmetic raw material is currently judged by whether the viscosity is high or low. Furthermore, in order to extract hyaluronic acid, it is necessary to add acid, alkaline agents, enzymes, etc. to the connective tissue as a pretreatment to decompose proteins in the connective tissue and liberate hyaluronic acid. However, since hyaluronic acid is a high-molecular compound, when proteins are decomposed, hyaluronic acid is also degraded by the action of acids and enzymes and becomes a low-molecular compound. Therefore, research has been carried out to suppress the decomposition of hyaluronic acid as low as possible and decompose only the proteins in connective tissue. A processing method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 105199/1983) has been proposed. However, in the conventional method for producing hyaluronic acid described above, hyaluronic acid with a relatively high viscosity can be obtained by making it difficult to proceed with the decomposition of hyaluronic acid by heating, but the yield is not necessarily satisfactory. It's hard to say. The present invention has been made for the purpose of providing a method for producing hyaluronic acid with high yield, and is characterized in that a hyaluronic acid-containing raw material that has been heat-treated in advance is made into a paste, and then treated with a protease. be. Chemically pure hyaluronic acid has the following structural formula: It is a polysaccharide with a molecular weight of 500,000 to 2,500,000 whose repeating constituent units are disaccharides of glucuronic acid and N-acetylglucosamine. When this hyaluronic acid is treated in saline, the dissociated sodium ions combine with the carboxyl group of glucuronic acid that constitutes hyaluronic acid, forming a sodium salt and changing to sodium hyaluronate. Therefore, the hyaluronic acid referred to in the present invention refers not only to the above-mentioned chemically pure hyaluronic acid, but also to
It also includes its sodium salt. In the present invention, first, a hyaluronic acid-containing raw material is heat-treated to thermally denature the protein contained in the raw material. The raw materials used in the present invention are not particularly limited as long as they contain animal or vegetable tissues that contain hyaluronic acid, and include, for example, cockscombs, umbilical cords, eyeballs, skin, cartilage, and the like. Among these raw materials, chicken comb is particularly desirable because it has a low protein content of about 10% and the protein is easily decomposed. Although any method may be used to heat the raw material, it can be efficiently carried out by immersing the raw material in hot water. There are no particular restrictions on the heating temperature or time as long as the protein in the raw material is thermally denatured.
It is best to soak the raw material in hot water at ~100°C for 20-40 minutes. In addition, when using frozen raw materials, the raw materials may be heated as they are, but as shown in the test examples below, if the raw materials are placed in running water, etc., slowly thawed, and then heat treated, a relatively high viscosity Hyaluronic acid can be produced with higher yield. Next, the heat-treated raw materials are made into a paste. This paste formation improves the yield of hyaluronic acid. Prior to making a paste, it is easier to make a paste by cutting the heat-treated raw material into thin pieces using a shredder or using a meat grinder. To give an example of pasting, raw materials include
By adding approximately 1 to 3 times the weight of fresh water to the weight of the raw material and homogenizing it with a homogenizer for 10 to 30 minutes, the raw material can be crushed and made into fine particles and made into a paste. In addition, in addition to a homogenizer, a high-speed stirrer or a crusher may be used for making a paste. Next, a protease is added to the paste-formed raw material, and the material is maintained at a constant temperature for a certain period of time to perform protease treatment. Any type of protease can be used as long as it is commercially available, and examples include pepsin, trypsin, papain, bromelin, and fuicin.
The amount of protease added varies depending on the protein content of the raw material used, but when using chicken comb, the appropriate amount is 0.01 to 0.05% based on the chicken comb. When using raw materials with relatively high protein content, such as umbilical cord, it is desirable to add a large amount of proteolytic enzyme. The temperature and time of protease treatment are
Although it varies depending on the raw material used, when using chicken comb, a range of 3 to 10 hours at 35 to 45°C is appropriate. Finally, hyaluronic acid is extracted from the protease-treated paste to obtain crude hyaluronic acid, and then this hyaluronic acid is purified to obtain purified hyaluronic acid. Extraction and purification of hyaluronic acid may be carried out by conventional methods. For example, a paste treated with protease is filtered to remove solids, and CPC (cetylpyridinium chloride) is added to the resulting liquid to extract hyaluronic acid. The acid is adsorbed onto CPC and precipitated. Then, the precipitate formed is separated, the separated precipitate is dissolved in saline, ethanol is added to the saline, hyaluronic acid is precipitated again, and the precipitate formed is separated. Crude hyaluronic acid can be obtained. After dissolving this crude hyaluronic acid in clean water, ethanol is further added to this solution to precipitate and remove impurities such as protein decomposition products, and then saline is added to this solution to dissolve hyaluronic acid. is precipitated, and purified hyaluronic acid can be obtained by separating the resulting precipitate. The purified hyaluronic acid obtained by this extraction and purification method is a solid form of isolated hyaluronic acid, so when used as a raw material for cosmetics, it is used by dissolving it in clean water or oil or fat. As described above, according to the present invention, a hyaluronic acid-containing raw material that has been heat-treated in advance is made into a paste without being shredded, and then treated with a protease, thereby extracting hyaluronic acid from the protease-treated paste using a conventional method.・If purified, hyaluronic acid can be produced in good yield, although the cause is not clear. Example 5 kg of chicken combs that had been frozen and stored at -20°C for 30 days were placed in running water at 20°C and slowly thawed over 2 hours. After soaking this cock comb in hot water at 80℃ for 30 minutes,
It was taken out and cut into 2 mm thick pieces using a shredder. Add Shimizu 15 to the cut chicken comb, and crush the chicken comb tissue into fine particles for 20 minutes using a homogenizer (Hiscotron, manufactured by Nichion Medical Instruments Manufacturing Co., Ltd.).
Obtained 20kg of chicken comb paste. 1.5 g of protease ("Amano P3" manufactured by Tenri Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to this paste, and after enzyme treatment was performed at 40° C. for 5 hours, the paste was filtered to obtain 18 kg of liquid. Add 900 ml of 10% CPC (cetylpyridinium chloride) aqueous solution to this solution to form a precipitate.
Separate the precipitate. The obtained precipitate was dissolved in 0.4M saline solution 15, and then ethanol 23 was added to the saline solution to form a precipitate again. This precipitate was separated, washed with ethanol, and air-dried to obtain 120 g of crude hyaluronic acid. 100g of crude hyaluronic acid obtained by the above method
Add 10 parts of pure water to dissolve the hyaluronic acid, add 15 parts of ethanol, and use a centrifuge to dissolve the hyaluronic acid.
After centrifugation at 10,000 γ·p·m for 30 minutes, 20% of the supernatant was collected. One part of 3M saline solution was added to this supernatant to form a precipitate, and this precipitate was separated, washed with ethanol, and air-dried to obtain 43.3 g of purified hyaluronic acid. Test Example Purified hyaluronic acid was prototyped using the following four methods. Target area A: 5 kg of chicken combs that had been frozen and stored at -20°C for 30 days were placed in running water at 20°C and slowly thawed over 2 hours.
The chicken comb was immersed in hot water at 80° C. for 30 minutes, then taken out and put through a meat grinder to shred the chicken comb. Using this shredded chicken comb, hyaluronic acid was extracted and purified in the same manner as in the example. Target area B: 5 kg of chicken combs that had been frozen and stored at -20°C for 30 days were immersed in hot water at 80°C for 30 minutes, then taken out.
Shred the chicken comb through a meat grinder. Using this shredded chicken comb, hyaluronic acid was extracted and purified in the same manner as in the example. Test Area A 5 kg of chicken combs that had been frozen and stored at -20°C for 30 days were pretreated and hyaluronic acid was extracted and purified in the same manner as in the example. Test Area B: 5 kg of chicken combs that had been frozen and stored at -20°C for 30 days were immersed in hot water at 80°C for 30 minutes, then taken out.
Using this chicken comb, hyaluronic acid was extracted and purified in the same manner as in the example. When hyaluronic acid was extracted and purified using the above four methods, the yield of purified hyaluronic acid was calculated, and the viscosity of the obtained purified hyaluronic acid was measured, and the results shown in Table 1 were obtained.
【表】
尚、表中において収率とは、原料の凍結鶏冠に
対して得られた精製ヒアルロン酸の収量を百分率
（重量比）で表わしたものである。
また粘度とは、得られた精製ヒアルロン酸を
0.2％水溶液とし、ウベローデ型粘度計にて測定
した動粘度である。[Table] In the table, the yield refers to the yield of purified hyaluronic acid obtained from frozen chicken combs as a raw material, expressed as a percentage (weight ratio). In addition, viscosity refers to the purified hyaluronic acid obtained.
This is the kinematic viscosity measured using an Ubbelohde viscometer as a 0.2% aqueous solution.