JPH036792B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、非水系反応に用いる固定化酵素の
製造法に関する微量の水の存在下に、有機溶媒中
で酵素反応を行わせしめる、いくつかの非水系酵
素反応が知られている。 酵素固定化に用いる優れた固定化樹脂重合物の
一つとして、ポリアルキレングリコールの両末端
に光重合可能なエチレン性不飽和基を有する化合
物が結合してなる光重合性樹脂（以下「光重合樹
脂」と記す）を原料としてこれに光線を照射して
光重合せしめて得た固定化重合物が知られてい
る。 （European J.Appl.Microbiol.Biotechnol.６
325、（1979））。 本発明者らは、このような光重合性樹脂を用い
て、非水系反応に用いる固定化酵素を製造すべく
研究を開始した。 上記固定化樹脂重合物は、有機溶剤の透過性が
より高いものが望ましいので、光硬化性樹脂は、
一般に、有機溶剤に可溶性のものが使用される。
従つて、酵素固定化の場合の重合反応は、有機溶
剤中で行われることが多い。ところが、酵素水溶
液と有機溶剤とを混合した場合には、有機溶剤が
親水性であれば酵素は沈澱してしまい、親油性で
あれば、酵素水溶液と均一に混じり合わず、いづ
れにしても目的とする固定化酵素は得れない。親
油性有機溶剤と酵素水溶液とを均一に混じり合う
ようにするために、乳化剤を用いる方法が考えら
れるが、この方法を試験したところ、必ずしも望
しい結果が得れなかつた。 そこで本発明者らは、更に研究した結果、予め
酵素水溶液を水を吸着することのできる担体に接
触せしめて、担体に吸着せしめ、得られた酵素水
溶液吸着担体を有機溶剤中にて光重合性樹脂と混
合し、光重合反応を行わせしめれば、効率良く酵
素を固定化する事ができることを知り、この知見
に基づいてこの発見を完成した。 本発明に用いられる光重合性樹脂としては、例
えば以下のものが挙げられる。 (1) 分子量400〜6000のポリエチレングリコール
１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸２
モルでエステル化したポリエチレングリコール
ジ（メタ）アクリレート類。 (2) 分子量200〜4000のポリプロピレングリコー
ル１モルの両末端水酸基を（メタ）アクリル酸
２モルでエステル化したポリプロピレングリコ
ールジ（メタ）アクリレート類。 (3) 分子量400〜6000のポリエチレングリコール
１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシアネ
ート、キシリレンジイソシアネート、イソホロ
ンジイソシアネート等のジイソシアネート化合
物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）アク
リル酸２−ヒドロキシエチル等の不飽和モノヒ
ドロキシエチル化合物２モルを付加した不飽和
ポリエチレングリコールウレタン化物。 (4) 分子量200〜4000のポリプロピレングリコー
ル１モルの両末端水酸基をトリレンジイソシア
ネート、キシリレンジイソシアネート、イソホ
ロンジイソシアネート等のジイソシアネート化
合物２モルでウレタン化し、次いで（メタ）ア
クリル酸２−ヒドロキシエチル等の不飽和モノ
ヒドロキシ化合物２モルを付加した不飽和ポリ
プロピレングリコールウレタン化物、等。 本発明の光硬化性樹脂として、例えば、下記の
構造式を有するものが挙げられる。（European
J.Appl.Microbiol.Biotechnol.６、325（1979））。 上記の例に見られるように本発明の光重合性樹
脂は、ポリアルキレングリコールの両末端に光重
合可能なエチレン性不飽和基を有するものであ
る。 本発明の非水系反応に用いる固定化酵素を製造
しようとする場合、このような光重合性樹脂を、
予め酵素水溶液と、水と吸着できる担体とを接触
せしめて得た酵素水溶液吸着担体を、有機溶媒中
にて混合し、この混合物に光照射して光重合性樹
脂を重合せしめれば良い。 水を吸着する事のできる担体としては、例えば
セライト、石英砂、白土、活性炭、ガラス繊維あ
るいはビーズ、ケイ酸ゲル、フロリジル、アルミ
ナ、炭酸カリシウム、硫酸カリウム、ブドウ糖、
β−サイクロデキストリン、セルロース、カゼイ
ン、澱粉、寒天がある。 これらの担体の形状はいづれも有機溶剤に不溶
性のものである。より多くの水が吸着できるよう
表面積がより大きなものが望ましい。 担体により多くの酵素蛋白を吸着せしめるには
酵素水溶液は、より濃度の高いものが好ましい。
酵素水溶液の溶媒は緩衝液であつても良く、ある
いは無機塩、その他酵素を安定化せしめるに有効
な抗酸化剤等を含有する水溶液であつても良い。 有機溶剤としては光重合性樹脂を溶解するが、
固定化重合物を溶解しないような溶媒であり、極
性、非極性を問わない。 例えば以下のものがある。 石油ベンジン、ヘキサン、フプタン、ベンゼ
ン、石油エーテル、トルエン、酢酸エチル、アセ
トン、アルコール、ジオキサンエチレングリコー
ル、ホルムアミド、ピリジン、テトラヒドロフラ
ン、ジメチルスルホキシド、シメチルホルムアミ
ド。 光重合性樹脂と酵素水溶液吸着担体の混合割合
いは、光重合物が生成されるに必要な最少限の光
重合性樹脂が含まれる様な割合いがより経済的で
あるが、固定化重合物の強度等を考慮してより好
ましい範囲に定められる。 光重合反応を行わせしめるための光線は、250
から600nｍの範囲が最も望ましい。 固定化重合物は、薄膜状になるようにしても良
く、あるいは、ビーズ状になるようにしても、あ
るいはその他の形状にしても良い。 このような固定化酵素を用いて非水系酵素反応
を行うには有機溶剤に溶解した基質と固定化酵素
を好ましい範囲の温度下で暫時、接触せしめれば
良い。 非水系酵素反応としては、リパーゼによるエス
テル交換方法（特開昭52−104506号公報特開昭55
−843976号公報）、ステロイドの酸化、還元、水
酸化、または脱水素反応、脂溶性ビタミン、プロ
スタグランジン等の生理活性物質を基質とする
か、これらの生理活性物質を生成せしめる反応
等、基質及びその生成物が脂溶性物質である酵素
反応がある。 実施例 １ セライト0.25ｇを、リゾープスデレマーの生産
したリパーゼ（生化学工業製試薬、フアイングレ
ード、600単位）５mgを溶解した0.2mlの0.3M
TES バツフアー（PH6.5）に加え、良く混合し
た。 これを実験区１ではENTP（平均分子量2000）
0.5ｇ、及びベンゾインエチルエーテル５mgをヘ
キサン0.4mlに溶解した溶液に、実験区２では
ENT（平均分子量4000）0.5ｇ、及びベンゾイン
エチルエーテル５mgをアセトン0.4mlに溶解した
溶液に、投入し、良く混合した。ついで混合物を
透明フイルム上に流し込み、300ないし400nｍの
近紫外線を表裏に３分づつ照射し、重合反応を行
わせしめた。重合物を３×３mmの大きさに切断し
固定化リパーゼを調製した。 この固定化リパーゼを予め用意してあつたヘキ
サン10ml中にオリーブ油2.5ｇ、ステアリン酸2.5
ｇを含む反応液に投入し、40℃にて１時間、振と
うした。オリーブ油中のトリグリセリドに導入さ
れたステアリン酸量を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ 実施例１に示した実験区１の固定化リパーゼを
用いてその安定性を検討した。実施例１に示す方
法において、１時間毎に反応液を新らしいものと
交換してくり返し反応を行なつた結果を表−２に
示す。セライトに吸着したリパーゼは４回目で約
半分の活性になつてしまうのに対し固定化リパー
ゼは完全に安定であつた。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ (イ)ポリアルキレングリコールの両末端に光重
   合可能なエチレン性不飽和基を有する化合物が結
   合してなる光重合性樹脂及び(ロ)予め水を吸着する
   ことができる担体と酵素水溶液とを接解せしめて
   得た酵素水溶液吸着担体とを、有機溶媒中にて混
   合し、これに光線を照射して光重合性樹脂を重合
   せしめることを特徴とする非水系反応に用いる固
   定化酵素の製造法。