JPH0372274B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、ガラスコーテイングチユーブに関
する。さらに詳しくは酵素、抗原、抗体等のペプ
チド含有機能性化合物を固定化してなる固定化ガ
ラスコーテイングチユーブ及びその製造法に関す
る。 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化ガラスが診断用や合成用の
バイオリアクターとして用いられるようになり、
ことにかような固定化ガラスをチユーブ内面に被
覆した固定化ガラスコーテイングチユーブが液体
クロマトグラフやガスクロマトグラフ用のカラム
等に用いられるようになつた。これらのコーテイ
ングチユーブの製造法としては、溶融法によつて
SiO₂系のガラスを作成し、これを適当な細管に
引張るか又はその周りをポリイミド樹脂などで被
覆することによつてガラスコーテイングチユーブ
を得、このガラス表面をアルカリ処理して水酸基
を生成させ、これにシランカツプリング剤をエス
テル結合で導入した後、このカツプリング剤に直
接又は変成した後酵素等のペプチド含有化合物を
付加させて固定化する方法が知られており、実用
化されている。 しかし上記従来の方法においては、ガラスコー
テイングチユーブ自体の作製も特殊な装置を必要
としかつ高温加熱を必要とする点不利であり、さ
らにガラス表面に水酸基を生成させる工程が必要
であり、それによつて生成しうる水酸基の単位表
面積当りの量は限度があつて酵素等の固定量にも
制限があり、ガラス被覆面当りの固定量を増大し
活性の高い固定化ガラスコーテイングチユーブを
得ることは困難であつた。そのため、被覆ガラス
にハニカム処理（ホイスカー生成処理）等の特殊
な粗面化処理を行なつてガラス表面積をできるだ
け広くすることも行なわれている。 この発明は、かような問題点に鑑みなされたも
のである。この発明の発明者らは金属アルコキシ
ドを原料とし、これを緩和な条件下で加水分解し
て生成するゲル状物を酵素等固定用担体として用
いることに想着し、これにより熱処理等を必要と
せずかつ水酸基を生成させる工程を行なうことな
く、担体表面積当りの固定量が増大された固定化
ガラスコーテイングチユーブが得られる事実を見
出しこの発明に到達した。 かくしてこの発明によればチユーブ内面に被覆
する固定化用担体として、金属アルコキシドの加
水分解で生成する水酸化金属化合物及び／又はそ
の縮合物からなるガラス様ゲル体を用いてなるペ
プチド含有化合物の固定化ガラスコーテイングチ
ユーブが提供される。 この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツク製造分野で知られた
金属アルコキシドが種々適用でき、具体的にはSi
（OCH₃）₄、Si（OC₂H₅）₄、Ti（OC₃H₇）₄、Ｖ
（OC₂H₅）₃、Al（OC₃H₇）₃、NaOCH₃等の低級ア
ルコキシ金属が挙げられ、これらのうち低級アル
コキシシランを用いるのが通常好適である。な
お、これら二種以上の混合物を用いてもさしつか
えはない。 この発明のチユーブを製造するに当つて、まず
上記金属アルコキシドの溶液が所望のチユーブ内
に被覆される。通常上記溶液をチユーブ内に通じ
ることによつて簡便に被覆を行なうことができ
る。これによつてチユーブ内面に金属アルコキシ
ド含有溶液の薄層がコートされる。この際、用い
る金属アルコキシド含有溶液は金属アルコキシド
の加水分解が実質的に生じていないものを用いる
必要がある。この溶媒としては易揮発性の親水性
溶剤やその含水物を用いるのが適当であり、例え
ば含水メタノールや含水エタノールが好適に用い
られる。水のみを溶剤とすることもできるが、こ
の際金属アルコキシドの選択によつては加水分解
が急激に進み過ぎてゲル化し被覆操作が困難とな
る惧れがあり、また乾燥上不利であり好ましくな
い。 上記被覆された薄層内の金属アルコキシドは加
水分解によつてガラス様ゲル体を形成する。かよ
うな加水分解は緩和な条件でかつ溶媒の蒸散と共
に進行する。例えば低級アルコキシシランを用い
た場合通常PH１〜３程度に調製された水性（含
水）溶媒を用い、これをチユーブ内に被覆した
後、室温下で放置することにより加水分解を迅速
（通常数分程度）に行なうことができる。ことに
この方法によればチユーブ内に薄層の溶液が被覆
されるため、溶媒の蒸散は速められ、それにより
被覆前にはほとんど進行しない加水分解が進行す
るものと考えられる。 ただし、上記加水分解は室温下のごとき緩和な
条件下で行ない加温を避けできるだけ加水分解物
（例えばSi（OH）₄）の高縮合化が防止されたゲル
体を形成させることが必要である。 例えば、金属アルコキシドとしてSi（OC₂H₅）₄
を用いた場合にはチユーブ内面に被覆されたガラ
ス様のゲル体が得られるがその組成はSi
（OC₂H₅）₄の加水分解物であるSi（OH）₄又はその
低縮合物からなるため、従来のコーテイングチユ
ーブのSiO₂系ガラスにアルカリ処理により生成
された水酸基に比して非常に多数の水酸基をそれ
自身有している。従つて従来の固定化ガラスに比
して多量の酵素等を固定化できるものと考れられ
る。他の金属アルコキシドについても同様に、得
られたガラス様ゲル体は水酸化金属化合物やその
低縮合物からなるため、多量の酵素等を固定化で
きるものと考えられる。 このようにして得られたガラス様ゲル体コーテ
イングチユーブは、そのままもしくは任意に乾燥
して以下の工程に供される。ただし、かようなガ
ラス様ゲル体のコーテイングチユーブ自体、従来
のガラスコーテイングチユーブとはその表面活性
が異なるため、特殊な分離分析用カラムとしても
使用でき、さらに高温処理（通常、300〜500℃）
してSiO₂系ガラスコーテイングチユーブに変換
することもできる。ことに、SiO₂系ガラスコー
テイングチユーブの製造法としては従来に比して
簡便であり、極めて有用である。従つてこの観点
から、この発明は金属アルコキシドの一種又は二
種以上を含有する溶液をチユーブ内面に被覆し、
金属アルコキシドを加水分解してガラス様ゲル体
の被覆層を形成し、これを加熱処理することを特
徴とするガラスコーテイングチユーブの製造法を
も提供するものである。 上記ゲル体に反応させるシランカツプリング剤
としては、アミノ基、チオール基、エポキシ基な
どの官能性基を有する当該分野で公知のシラン誘
導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロピル
トリエトキシシラン、γ−クロロプロピルトリメ
トキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、γ−
グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−
β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリメ
トキシシラン等が使用される。かようなシランカ
ツプリング剤との反応は、当該分野で公知の条件
下で行なわれる。例えばγ−アミノプロピルトリ
エトキシシランを用いた場合、このカツプリング
剤を水に溶解して１〜10wt％水溶液、好ましく
は2wt％水溶液としかつPHを３〜５に調整した
後、この溶液を前記チユーブ内に注入し加温下数
時間接触させた後、水洗して未反応のカツプリン
グ剤を除去することにより得られる。かようなチ
ユーブは従来のガラスコーテイングチユーブに比
して内面に多くのカツプリング基を有している。 このようにして処理されたチユーブ内面に公知
の方法で酵素、抗原、抗体等のペプチド含有化合
物が固定化される。例えば、カツプリング剤とし
てγ−アミノプロピルトリエトキシシランを用い
てアミノアルキル基を水酸基にエステル結合で多
数導入したゲル体被覆チユーブを用いる場合、上
記アミノアルキル基にゲルタルアルデヒドを用い
てアルデヒド基を有するシツフベースを導入し、
これに酵素等を接触させてアルデヒド基と酵素等
のアミノ基間でさらにシツフベースを形成させて
結合することにより固定化を行なうことができ、
これ以外にもアミノアルキル基をジアゾ化して芳
香族アミノ基を導入してこれに酵素等を固定化し
てもよく、またカルボジイミドを用いてアミノア
ルキル基と酵素等との間に直接ペプチド結合を行
ない固定化を行なつてもよく酵素等の種類に応じ
て適宜選択すればよい。他のカツプリング剤使用
時にも同様に直接又は適宜変換したカツプリング
基によつて酵素等を固定化することができる。 固定化用の酵素としては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウリカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体を固定化することもで
きる。 なお、この発明に用いるチユーブとしては、ガ
スクロマトグラフ、液体クロマトグラフ等の分野
や各種診断用、合成用のカラム用チユーブが適用
でき、キヤピラリーカラム等の細管を用いること
もできる。そしてその材質としては、金属、ガラ
ス、セラミツクス、プラスチツク等のいずれでも
よく、通常ガラスが適当である。 このようにして得られたこの発明の固定化ガラ
スコーテイングチユーブは従来の固定化ガラスコ
ーテイングチユーブに比して酵素等の固定量は増
大されており、種々の分野でバイオリアクターと
して有用であり、クロマトグラフ用カラムとして
も有用である。 さらにこの発明のコーテイングチユーブの製造
法によれば、高温加熱処理を行なうことなくチユ
ーブ内に担体を被覆でき、さらに固定化に当つて
水酸基を導入する工程を必要としないため従来に
比して大幅にコストを低減できる。そして溶液を
用いるため細管等の内面にも簡便に被覆でき極め
て薄いコーテイングも可能である。そして得られ
た固定化ガラスコーテイングチユーブも従来に比
して活性が高く有利である。 以下、この発明を参考例によつて説明する。 参考例 １ （ゲル状物の作製） テトラエトキシシランSi（OC₂H₅）₄10ｇエタノ
ール10ml、水3.8ml及び塩酸（IN）1.4mlの混合物
（PH２）を室温で均一になるまで約１時間攪拌混
合した。この混合物を空気中に約４日間放置して
加水分解と水及びエタノールの蒸発を進め、約
120℃で乾燥させてSi（OH）₄系のゲル状物を得た。 （アミノアルキル化） 得られたゲル状物を乳鉢で粉砕し、ふるいを通
して平均粒径60/80、80/120、120/200のビーズを
得た。 5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し、上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、攪拌機、温度計、ジムロートを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、激しく攪拌されながら３時間反応を行
なつた。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフ
イルターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランを除去した後、
デシケーターで乾燥させて粒径の異なる三種のア
ミノアルキル化ゲル状物を得た。このアミノアル
キル化ゲル状物はデシケーター内で保存する。 （酵素の固定化） 上記アミノアルキル化ゲル状物（ビーズ状）を
各々二官能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）
のリン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスビ
レーターで減圧させつつ約30分攪拌下反応させ
た。続いてさらに約30分常圧で攪拌下反応させ
た。反応温度は25℃であつた。これをPH7.0のリ
ン酸塩緩衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この
処理によりゲル状物のアルデヒド基を有するシツ
フベースが導入される。 得られたゲル状物を１mg／ml（グルコースオキ
シダーゼ／PH7.0リン酸塩緩衝液）中に浸漬し、
25℃下まず30分減圧下で緩やかに攪拌して反応を
行ない、続いて60分常圧下で緩やかに攪拌して固
定下反応を行なつた。この処理によりグルコース
オキシダーゼのアミノ基が反応に関与し、担体
（ゲル状物）のアルデヒド基とさらにシツフベー
スを形成し固定化される。このようにしてこの発
明のグルコースオキシダーゼ固定化ゲル状物（ガ
ラス）が各々得られた。 （活性試験） 上記固定ガラスビーズのうち200メツシユのも
のの固定化度合を従来と比較するためボルタンメ
トリー法により活性試験を行なつた。まず、1wt
％のβ−Ｄグルコース溶液（PH7.0リン酸塩緩衝
液）10mlを、上記この発明の固定化ガラスビーズ
１ｇを入れたビーカーに注入し15分間緩かに攪拌
して反応させ、反応液から９mlを採取して５％ヨ
ウ化カリウム溶液１mlを添加した。この操作によ
り、酵素反応により発生した過酸化水素でI^-がI₂
（aq）に酸化される。このI₂をボルタンメトリー
法により還元し、還元波を測定することによりI₂
量が定量でき、ひいては固定化ガラスビーズにお
ける酵素の固定化の程度すなわち活性の程度がわ
かる。 従来のガラスを担体として前記と同様にして得
た固定化ガラスビーズとこの発明の固定化ガラス
ビーズとのボルタンメトリー法による結果を表１
に示す。

【表】 このようにこの発明のチユーブ内に被覆された
固定化ガラスは従来のガラスを担体とするものに
比して明らかに酵素活性が高いことが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ チユーブ内面に被覆する固定化用担体とし
   て、金属アルコキシドの加水分解で生成する水酸
   化金属化合物及び／又はその縮合物からなるガラ
   ス様ゲル体を用い、このガラス様ゲル体にシラン
   カツプリング剤残基を介してペプチド含有化合物
   を固定化してなるペプチド含有化合物の固定化ガ
   ラスコーテイングチユーブ。 ２ 金属アルコキシドの一種又は二種以上を含有
   する溶液をチユーブ内面に被覆し、金属アルコキ
   シドを加水分解してガラス様ゲル体の被覆層を形
   成し、これにアミノ基、チオール基又はエポキシ
   基から選ばれる官能性基を有するシランカツプリ
   ング剤を反応させ、その反応体にペプチド含有化
   合物を固定化することを特徴とする固定化ガラス
   コーテイングチユーブの製造法。