JPH041303B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血液成分の測定法に関する。さらに詳
しくは、小児のマススクリーニングなどに使用さ
れる血液濾紙を用いて測定する際に、該血液濾紙
とエーテル：水：アセトン：アルコールから成る
組成物又は塩化メチレン：水：アセトン：アルコ
ールから成る組成物とを接触せしめ、血色素を変
性固定化した血液濾紙を用いることを特徴とする
血液成分の測定法である。本発明法において測定
される血液成分とはグルコース、ガラクトース、
ガラクトース−１−リン酸、ウリジン−ニリン酸
ガラクトース、オルニチン、フエニルアラニン、
ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、チロシンな
どの糖、アミノ酸類である。 小児のマススクリーニングにおいては、新生児
の代謝異常を早期に発見するため生後５〜７日目
に足蹠をランセツトで穿刺し、所定の濾紙に血液
を吸収せしめて乾燥した血液濾紙を検査センター
に送り検査する方法、いわゆるガスリー検査が行
なわれている。本検査で測定されるのは前述に
糖、アミノ酸などであるが、これによりガラクト
ース血症、フエニルケトン尿症、ヒスチジン血
症、メープルシロツプ尿症、ホモシスチン尿症、
高チロシン血症などが診断される。本検査法は、
まず、血液濾紙を径３〜10mmのデイスクに打ち抜
き、このデイスクと測定試薬とを反応せしめる
か、又は、細菌抑制検査法（Bacterial
inhibition assay，BIA法と略）により目的物質
が測定される。前者の例としては、例えば、前記
血液濾紙デイスクにガラクトースデヒドロゲナー
ゼとNADを作用せしめ、生じたNADHの蛍光又
は可視吸収を測定するガラクトースの微量定量法
などがある。又、BIA法の例としては、例えば、
フエニルアラニンの測定において、代謝拮抗剤β
−２−チエニルアラニンを含む最少栄養平板培地
に枯草菌芽胞を植菌し、そこへ血液濾紙デイスク
を並べ、該菌の発育帯から半定量する方法などが
ある。以上のような測定においては、使用した血
液濾紙デイスクから血色素などが溶出して、光度
計測定の障害となつたりあるいは発育帯が不明瞭
であつたりした。 上記問題に関する公知技術としては、ギ酸、酢
酸、アセトン、水蒸気などを用いる血色素の変性
固定化法が報告されている（名古屋市衛生研究所
報第25巻、17ページ、1978年、トーホクジヤーナ
ル オブ エキスペリメンタル メデイシン
（Tohoku J.Exp.Med.）第133巻、371ページ、
1981年など）。これら先行技術の不利な点は、変
性固定化操作に長時間要したり、高温処理である
ため被測定物が分解されること又は使用する薬剤
に刺激性があることなどである。さらに、変性固
定化後において、使用した薬剤を除去、乾燥する
ために長時間を要したりあるいは特別な装置を必
要とすることがある。すなわち、ギ酸、酢酸など
使用した場合は濾紙に付着した余分の酸を除去す
るためにデシケーター中で減圧下操作し、さらに
活性炭を存在させることも必要であつた。又、有
機溶媒と水との混合系を使用した場合は、低温で
乾燥させようとすると一晩を要した。本発明者ら
は上記欠点を改善すべく研究中に水：アセトン：
アルコールから成る組成物を用いると操作が簡単
であることを知つたが、まだ長時間を要するなど
の欠点があつた。 本発明は上記知見から生まれたものであつて、
その要旨は、血液濾紙とエーテル：水：アセト
ン：アルコールから成る組成物又は塩化メチレ
ン：水：アセトン：アルコールから成る組成物と
を接触せしめることにより該血液濾紙の血色素を
変性固定化し、血色素の溶出を完全に防止した血
液濾紙を用いる血液成分の測定法である。本発明
法では上記のようにして得た変性固定化血液濾紙
を用いて、公知の方法により血液成分を測定する
ことができる。すなわち、その例示としては次の
方法がある。その第一は、前述のガラクトースの
微量定量法のような測定物質と共役するNAD
（Ｐ）又はNAD（Ｐ）Ｈの酸化還元に関する酵素
反応を含む方法である。この方法では反応によつ
て生じた蛍光又は可視吸収の変化を蛍光光度計又
は吸光光度計で測定する。第二は、前述の細菌抑
制検査法を用いる方法である。これらの方法で測
定されるのは前述の糖、アミノ酸などであるが、
本発明の効果は、蛍光又は可視吸収を利用する微
量測定法において、特に、顕著である。 本発明法に使用する血色素の変性固定化試薬は
前述のようにエーテル：水：アセトン：アルコー
ル又は塩化メチレン：水：アセトン：アルコール
から成る組成物である。アルコールはメタノール
又はエタノールのように低沸点のものがよい。変
性固定化に有効な試薬の混合割合は後述のように
広い範囲で選択できる。変性固定化の操作は、例
えば次のように行う事ができる。新生児の先天性
代謝異常児のマススクリーニングに使用されてい
るガスリー紙濾紙（第一化学製）に数滴血液を浸
み込ませ風乾する。このようにして得られた血液
濾紙は１cm径に約20〜30μlの血液を含む。この血
液濾紙から適当の大きさ（通常３mm径）のデイス
クを打ち抜き、これを適当な容器、例えば測定に
用いる試験管に入れ、そこへ前記変性固定化用試
薬を加えて、室温又は37℃位の恒温水槽中で約30
分〜１時間処理する。加える変性固定化用試薬の
量はデイスクに充分浸み込めばよく、３mm径デイ
スク１個の場合は約20μlである。本発明法では上
記時間、すなわち約30分〜１時間で変性固定化と
乾燥が完了するため、別に加熱又は減圧等の乾燥
操作をする必要がない。デイスクが乾燥したら、
そのまま同じ試験管を用いて次の測定操作に移る
こともできる。以上のようにして得られた血液濾
紙デイスクは血色素の溶出が全くなく、反応系へ
の障害もない。又、本発明法により変性固定化の
操作がきわめて迅速、簡単に行うことができるよ
うになつた。変性固定化用試薬の組成を以下に説
明する。すなわち前述の血液濾紙を径３mmのデイ
スクに打ち抜き、これに試験管に入れ、第１表に
示す組成の試薬を20μl加えて血色素の変性固定化
能をみた。変性固定化ならびに乾燥に要する時間
と、得られたデイスクを水に浸し血色素の溶出度
を測定した結果を第１表に示す。同表において、
所要時間は四段階、すなわち＋は１時間以内、
は２時間以内、は４時間以内、〓は４時間を越
えるものを表わし、また、血色素の溶出が認めら
れるものを（×）、認められないものを（○）と
表示した。さらに総合評価を行い、Ｃは変性固定
化に使用可能なもの、Ｂはより好適なもの、Ａは
最も好適なものをそれぞれ表す。

【表】

【表】 第１表に示す結果からわかるように、変性固定
化に適する試薬組成はエーテル：水：アセトン：
メタノールの比が 20〜83：３〜32：２〜48：３〜48であり、好適に
は 20〜83：３〜16：２〜48：７〜40の割合である。 第２表には塩化メチレン：水：アセトン：メタ
ノールの系の場合を示す。表の記述の仕方は第１
表と同じである。

【表】 第２表に示す結果からわかるように、塩化メチ
レン：水：アセトン：メタノールの場合、適する
のは25〜83：３〜20：２〜30：２〜45であり、好
適には50〜83：３〜10：２〜30：２〜30の割合で
ある。 本発明法は以上述べた以外にも濾紙クロマトグ
ラフイー、薄層クロマトグラフイー、澱粉ゾーン
電気泳動などにおけるテイリングの防止又はガス
クロマトグラフイー、液体クロマトグラフイーな
どの充填剤の目詰まりの防止にも有用である。 試験例 1. ガスリー氏口紙（第１化学製）に血液を数滴浸
み込ませ、風乾して血液濾紙を得た。これを径３
mmのデイスクに打ち抜き、１個ずつ試験管に入
れ、さらに第３表に示す組成の変性固定化試薬
20μlを加えて、室温に１時間放置した。 得られた血液濾紙デイスクの血色素が完全に固
定化されているか調べるために、試験管に水を入
れ血色素の溶出をみた。すなわち変性固定化血液
デイスクの水溶出液の蛍光強度を励起波長
381nm，蛍光波長382nmで測定した。標準液は
０・29μM硫酸キニーネ（蛍光強度０・１）及び
対照液は水（同じく０）を用いた。結果を第３表
に示す。同表からわかるように本発明法により変
性固定化された血液デイスクからは血色素の溶出
が全く認められなかつた。

【表】 実施例 1. ガラクトースの測定 既知量のガラクトースを含む各種血液サンプル
を前述ガスリー氏濾紙に浸み込ませ、風乾したの
ち、３mm径に打ち抜いて血液濾紙デイスクを得
た。該デイスクを１個ずつ試験管に入れ、そこへ
エーテル：水：アセトン：メタノールの比が50：
10：10：30の組成物20μlを加え、室温で１時間放
置し血色素の変性固定化処理を行つた。その後試
験管に13mM NDA，５×10^-2mg／mlのガラクト
ース脱水素酵素（ベーリンガーマンハイ社製）、
1M−トリス塩酸緩衝液（ph8・０）を各々10μl加
え、37℃で１時間反応させた。水３mlを加え、生
成したNADHの蛍光を励起波長340nm，蛍光波
長450nmで測定した。結果は第１図に示すよう
に、ガラクトース濃度と蛍光強度の間にはよい直
線性が得られた。 実施例 2. ウリジン−ニリン酸（UDP）ガラクトースの
測定 ガスリー紙濾紙に血液サンプルを浸み込ませ風
乾したのち、３mm径に打ち抜いて血液濾紙デイス
クを得た。該デイスクを試験管に入れ、そこへ塩
化メチレン：水：アセトン：メタノールの比が
70：10：５：15の組成物20μlを加え、室温で１時
間放置して血色素の変性固定化処理を行つた。そ
の後試験管に13mM NDA，０・2u／mlのUDP
ガラクトース−４−エピメラーゼ（シグマ社製）、
０・03u／mlのUDPグルコース脱水素酵素（ベー
リンガーマンハイム社製）、1M−トリス塩酸緩衝
液（ph8・０）を各々10μl加え37℃、１時間反応
させた。以下実施例1.と同様にして、生成した
NADHの蛍光を測定し、検量線からUDPガラク
トース量を求めた。その結果本血液サンプル中の
濃度は０・1mMであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明法によるガラクトースの測定に
おけるガラクトース濃度と蛍光強度の関係を表わ
す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 血液濾紙を用いる測定においてエーテル：
   水：アセトン：アルコールから成る組成物又は塩
   化メチレン：水：アセトン：アルコールから成る
   組成物の作用により該血液濾紙に含まれる血色素
   を変性固定化せしめた血液濾紙を用いることを特
   徴とする血液成分の測定法。