JPH0415416B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞学分野の改良、特に顕微鏡分野の
普通の白色光照射下において正常な又は病的な人
間の血液中に見出される一連の白血球の各々の光
学的識別、同定、比較及び算定を、手動又は自動
の鑑別白血球カウンターによつて従来法よりも正
確かつ迅速にしかも固定処理を行なうことなく単
一の純染料を用いて可能にする超生体血液の顕微
鏡分析方法に関するものである。

エールリツヒはある種の白血球を同定するのに
染色液（アニリン染料）を用いて鏡検及び写真観
察により生体要素をより簡潔に識別することを可
能にした。エールリツヒはある種の染料が染色変
性（異色染色性）であつて、細胞又は白血球の顆
粒の如き成分の染色により細胞は溶解染料の色又
は染料から予期される色とは異なる色を呈するこ
とをはじめて認めた人である。例えば、好塩基球
は染料とは異なる色を呈することが認められてお
り、血球以外の他の組織試料が２種以上の識別可
能な異なる色で染色されることも報告されてい
る。

当分野の従来法では、染色（通常複数種の化学
的に異なる染料を混合して用いる染色の前に、30
分までの処理を必要とする固定処理を行なつてか
ら生物試料を染色にかけることが最も普通になさ
れている。一般に固定剤は、しばしば染着感度を
妨げる防腐剤又は変性剤である。即ち固定剤なる
用語は細胞内の蛋白質及び他の物質の非可逆性変
性を単独で又は一緒になつて生起する１種又はそ
れ以上の有機又は無機物質と定義される。例えば
固定剤としては液状又は気体状のホルムアルデヒ
ド、無水アルコール（メチルアルコール）、ピク
ロホルマール等がある。生細胞は生体染料により
染色されないことがよくあり、固定剤はかかる試
料の染色には不可欠であつた。細胞化学の分野に
は血球の再現性ある染色を確保するのに開発され
た技術に関する情報が相当量あるが、多くの必須
添加剤は通常不安定でかつ急速に劣化するため
に、細胞の同定処理が困難となり、ある場合には
信頼性に欠けることになる。Thomas E.
Nechelesは白血球の分析について“この分野は
50年来ほとんど変化がみられない”と述べてい
る。

しかしながら、染料染色法は実際に、細胞及び
細胞の染色性成分に関する呈色反応についての代
謝的、機能的又は病理学的識別手段として役立つ
ものである。

米国の病院では1900年代の初期に、例えば救急
外科の必要性についての目安として白血球数の計
算を始めており、米国だけでも毎日50万回以上の
鑑別血球計算がほとんど人為的になされている。
鑑別血球計算では白血球総数計算と識別細胞計算
を遅帯なく行なつて報告するのが肝要であるか
ら、時間が重大な要素であり、また所要の分析を
より迅速に与えることが必要である。

白血球計算の価値が確立されてから、迅速血球
分析の要求が起り、MellorsやPapincolaouの研
究（1952年）に始まつて自動鑑別白血球計算器の
開発により1980年までに多くの機器が開発される
に至つた。当初は、血球分類の可能性を調べるの
に“CYDAK”ユニツトが用いられ、これは専門
化された染色法の重要性を示し、各血球像の光学
密度ヒストグラムから特長が導き出された。この
方法により、血球は５種の白血球のうちの４種、
即ち好中球、好酸球、リンパ球及び単球に分別で
きることが確立された。1969年にYoungは５種
の白血球の自動分類についての結果を発表し、
1971年にBacusはその分別法を更に発展させた。

しかしながら、現在自動分別システムは多種染
料の使用及び染料分解システム又は螢光染料を用
いる間接的螢光測定に依存していると解される。

従来の血液染色法では、２種以上の染色液を組
合せて用いる（例えばロマノフスキー液、ギーム
ザ液及びライト液）のが通例であるが、かかる方
法は実際上品質管理が難かしく、また各染料成分
の調製及び試料染色法に標定を必要とする。首尾
良い自動白血球カウンターの開発においては検証
可能な分析にとつて染色再現性がよりいつそう重
要視される。

“LARC”染色剤（商業別自動鑑別白血球カウ
ンターで使用されている）は約十種のチアジン染
料、オエジンＹ及び２，４，５−トリブロモフル
オレセインの混合物であると報告されている（P.
N.Marshall）。現在使用されている染色剤はほと
んどの場合固定用アルコール溶液中のものであ
り、２種以上の染料を組合せて用いている。生体
血液染色の精確な分析は最も困難とされている。
例えば、ロマノフスキー染色液に必須のメチレン
ブルーの制御酸化においてみられる困難性の場
合、組合せて使用される10種の別個の染料の品質
管理が面倒な問題になる。

かくして、限られた数の染料の使用及び普及し
た標定により細胞学的研究においてより高い精度
及び再現性が確保されると認識されている。固定
剤の使用により合成品の導入がなされ、そのため
白血球の分別及び算定における理解と誤解に困難
をもたらしている。例えばPH調節剤や重金属陽イ
オンは細胞化学的試験を予期された方法で実施す
るのを妨げることが報告されている。ある種の染
料、特にアゾ染料は細胞周囲の非特異的沈降現象
を明示するものであり、固定された血液試料にお
ける他の変性現象には空胞、核のクローバー型交
差（clover−leafing）、細胞変形、細胞脱落
（smudge）、理想的染色の妨害等がある。最も有
用かつ貴重な血球分析を得るために、生細胞に近
い細胞について鑑別血球計算をできるだけ短かい
時間で実施する重要性が認識されてきた。アルコ
ール性染料溶液は超生体染色を妨げるが、本発明
者の知る限りでは、調製したばかりの水溶性染料
は試験中超生体血液に最小限の変性作用を与える
にすぎない。すべての染料色素は血球に対して程
度の差はあれ多少とも毒性である。試験下の血球
はできるだけ長時間生存状態にあることが重要で
ある。染色の迅速さは血球の暴露時間を明らかに
短縮するため、白血球細胞を完全に死ぬ前に検査
する機会がより高められる。従つて、より迅速な
自動鑑別白血球計算が探求されている。

血液鏡検分析及び病気の診断を行なう従来法の
研究及び検討により、病理学の分野では染料と血
液試料とを接触前に体温（約37℃）に加温するこ
とはめずらしくないことが認められた。Sabinは
温度制御に“加温箱（warm box）”なるものを
用いている。

更に、従来用いられているある種の染料はきわ
めて感温性であることが指摘される。公知文献に
よれば、クレシレヒトバイオレツトは30℃以上で
は効果的に染色しない。本発明に関する方法の目
的には、染料が37°程度の高い温度でも白血球の
染色に有用であることが重要と考えられるが、本
発明で選択された染料は約40℃までの温度で用い
ても障害はみられなかつた。

本出願人の出願に係る特願昭56−34026号（特
開昭56−140253号公報に対応）においては比較的
少数の異色染色（異染性）染料が１種以上の白血
球の同定に有用であると開示されており、同定及
び識別は多形核白血球（好中球）、好塩基球、一
般的なリンパ球及び単球に特異的に関連してい
る。前記特許出願の目的に有用であると見出され
た染料は全て単球を異色染色して単球が前記白血
球群中の他成分から識別することが一般に観察さ
れる。

塩基性オレンジ21染料（カラーインデツクス
CI No.48035、スペクトル曲線７）の特異性は好
酸球、好塩基球及び単球に関して観察されていた
が、Ｂ−細胞はごく少数であるので最初は看過さ
れていた。

成熟好中球と未成熟好中球との間の光学的分別
によると、成熟顆粒の色がより赤色及び橙色であ
る未成熟顆粒とは異なつている点で可能であるよ
うに思われるのは最初から前記特許出願で観察さ
れた。骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球及
びバンド細胞を含めてこの白血球群は、全ての血
液試料中に常に存在するとは限らずあるいはＴ−
リンパ球（即ちＴ−細胞）及びＢ−リンパ球（即
ちＢ−細胞）の場合に多いようにかなりの数で存
在するので、これらの白血球種が塩基性オレンジ
21により異色且つ分別染色されて全て特異的に同
定されるものではない。

前記特許出願の研究完了に続いて、同様な血液
供給者にこの特異な染料を用いる継続研究を行な
うことにより、メチン、ポリメチン及びキノリン
種のこの選択された塩基性陽イオン型染料を用い
ると異色染色（染色変性）応答により或る種のリ
ンパ球を分別再現できることを確認した。また健
康科学に重要な有用性をもつと確立されている少
くとも10種の顆粒球及びリンパ球細胞をも同定し
得る。

しかもこの識別は瞬時であり、複雑な生化学処
理や血液試料の厄介な予備処理を必要としない。
更には前記染料は毒性が最低限であることも指摘
される。

微小分光光度計による測定では、染色された超
生体白血球の顆粒球の顆粒色を測定するのに十分
な程小さい開孔を有する分光光度計により行な
う。何れの程度まで測定を行なう白血球の他の部
分は、50ナノメーターの程度の色差度合を有する
ことが多い完全に異なる白血球種の色の吸光係数
を与えることは見出されなかつた。多数の細胞に
亘つて一致する認識可能なピークがある。色差が
一致して再現可能ならば、5nｍの程度の色差は
微小分光光度計による測定ではかなりのものであ
ると解される。

未成熟顆粒球のうちで他の細胞から瞬時に同
定、分別し得る細胞は骨髄芽球及び骨髄系列の細
胞即ち前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球である。こ
れらの細胞は多形核白血球即ち好中球の前駆体で
あると考えられており、異色染色されて本発明の
方法による超生体血液分析により容易に分別、同
定及び算定される。

本出願人の出願に係る前記特許出願に開示され
る如く、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及
び単球を互いに分別し前記の前駆体から分別する
のも同時に実施されており、但しこれらの細胞が
全て微小分光光度計による分析下で特定の血液試
料に存在するものとする。

更には、この特異な染料は光学的に異なる色模
様とバンド−リンパ球顆粒の異なる色濃度とを与
えることが見出された。即ちこの特性の白血球細
胞は光学的分別で前記した他の未成熟細胞から特
異に分離し得る。色の識別、色の配列及び色の濃
度は、前記の個々に挙げた細胞全ての人為的計算
が有資格作業員によつて成し得るような程度の大
きさの差異を有する。入手し得る文献が示す所に
よれば自動鑑別計算装置は色の有無による差異、
核に確立された物理的模様及び細胞質中の顆粒の
数、大きさ、配列及び色及び顆粒の数による色濃
度に基づいて開発される。

殆んど信じられぬ程だが完了した基本研究で明
示される如くＢ−リンパ球即ちＢ−細胞をＴ−リ
ンパ球即ちＴ−細胞から分別し得ることである。
また固定剤の不存在下での同じ超生体分析で同じ
染料を用いてこれらの肝要なリンパ球の各々を互
いに定性的且つ定量的に鏡検により同定すること
ができ並びにバンドを含めて前記の個々の未成熟
及び成熟細胞の各々からＴ−細胞及びＢ−細胞を
分別及び算定することができる。

前記の特許出願に開示した如く、単球は異色染
色により応答し同様に同定且つ計算し得る。何故
ならば前記したリンパ球の鏡検分析と競合するこ
となく単球の分析が得られるからである。

出血を抑制する１関数に役立つ小さい塵埃状粒
子の血小板はそれらが橙色に染色されることによ
り同定且つ計算し得ることも記載されている。血
小板の個数はまた血液特性の貴重な目安でもあ
る。

骨髄芽球及び骨髄系列の血球並びにバンド及び
Ｔ−リンパ球及びＢ−リンパ球を更に塩基性オレ
ンジ21が分別し得るという発見により、前記の特
許出願の認識された能力を越えて予期せぬ程に染
料の元の潜在的分野の有用性が拡大された。異色
染色後に前記細胞の１つ又はそれ以上を含む血
漿、リンパ液、血清等の如き流体であつて健康な
組織又は特異物質と思われる組織に伴なう流体の
超生体血液試料フラクシヨンを鏡検して前記した
細胞の各種を分別算定及び比較研究することがで
きる。

前記の特許出願の記載に組合わされた本発明の
技術的進歩は血液学、細胞学及び免疫学に無比の
進歩を確立し、無限領域の人間の健康に研究を行
うことができる。高価な反応剤の必要性、無用な
研究時間及びより正確な資料の集合はこれによつ
て適度に前進される。

病気の診断技術は現在の範囲を超えて新規な範
囲を与える。

現在までの文献には殆んど1000の相異なる染料
が超生体血液試料フラクシヨンの分析及び研究の
目的に有用な染料を見出す試みで研究されてお
り、そのうちの若干はもはや製造されておらず純
粋に巾広い研究の理由により入手し得る。無数の
種類の染料を化学構造と発色団の分類との両方か
ら試験しても理論付けには失敗してしまい、異染
性はごくまれにしか見出されないが該染料は何れ
の既知の分類にも包含されない。しかしながら塩
基性第４級陽イオン型染料種は現在知られている
他の群よりも有用性を与えることが認識された。

本発明に基本的な研究では、塩基性レツド、塩
基性オレンジ及び塩基性バイオレツト色のメチン
及びポリメチン染料20種を白血球の同定目的に試
験した。第１群の９種の塩基性レツドにおいてわ
ずか４種のみが単球の核の瞬間染色を生起する
が、他の細胞型式については殆んど又は全く染色
しなかつた。この染料系列には前記特許出願の塩
基生レツド13及び探究された塩基生レツド35、36
及び49がある。試験中の６種の塩基性バイオレツ
トメチン及びポリメチン染料のうち、塩基性バイ
オレツト７、15、16（前記特許出願に記載）、39及
び40もまた単球を瞬時に且つ選択的に染色する。

６種の塩基性オレンジポリメチン染料も実用試
験にかける。塩基性オレンジ21は、単球を明瞭に
染色するのみならず予期せぬ程多数の他の白血球
を各々分別した仕方で瞬時に染色することでこの
染料系列では特異的である。

20種のポリメチン及びメチン染料は、全て入手
し得る現在の市場目録に挙げた染料並びに従来の
染料技術を探求して見出されたメチン及びポリメ
チン分類の次第にすたれていく染料を表わす。前
記の特許出願は18種のカルボシアニン染料の研究
を報告しておりそのうちの唯１種のみが同様な単
球異色染色を示す。カルボシアニン、キノイド及
びメチン及びポリメチン染料はきわめて同様な化
学構造を有することが多い。

米国特許第2126852号明細書に記載された塩基
性オレンジ21（カラーインデツクス48035）の構造
を詳細且つ特定に研究することにより塩基性オレ
ンジ22の試験法をもたらした。これら２種の化学
構造（実際の試験と共に以下に示した如き）を研
究して驚くべき結果が得られた。塩基性オレンジ
22は染色目的に実用程度の有用性にまで異染性を
示さない。

これらの構造を研究して示される所によれば観
察される唯一の差異は前記構造体中にＢ及び
B′とした示した各塩基性オレンジのインドリル
基が次の点でのみ変化し即ち塩基性オレンジ21の
炭素原子に置換され且つ塩基性オレンジ22の窒素
原子に置換されるメチル基が塩基性オレンジ21に
おける２位から塩基性オレンジ22における１位に
変化していることである。塩基性オレンジ22の置
換基のない２位はまたメチル基の代りに追加のフ
エニル基を再定置させて有する。

広範囲の化学種の染料について３年以上に亘つ
ての探求でも異染性を予期し得る基準はなお観察
されなかつた。塩基性の陽イオン型第４級染料の
うちから最も頻繁に異染性が見出され、メチン及
びポリメチンのうちから比較的より頻繁に異染性
が見出された。

従来技術の記載が示す所によれば、結果を必須
点検するような超生体分析にスライド板の３つの
調剤に３種の染料濃厚物を用いるのは格別なこと
ではない。塩基性オレンジ21を用いると、色の分
別は、１種の染料と１枚のスライド板とで一次顆
粒から瞬時に容易に区別し得る程に識別され、色
は格別に鮮明となる。

本発明によると、１つ又はそれ以上の末梢血球
の白血球が選択的に異色染着されるメチン及びポ
リメチン系列の単一塩基性第４級陽イオン型有機
染料を用いることにより細胞学の技術を進歩さ
せ、これによつて骨髄系列の変種の未成熟細胞と
成熟細胞との間の同定及び識別並びに成熟白血球
同志の同定及び識別に格別の向上を与える。従
来、白血球の分別には細胞化学的手段及び複合染
色剤を使用せねばならず、複合染色剤の面倒な調
製及び既知白血球の単一種の識別及び算定による
顕微鏡分析にはしばしば１時間以上を要してい
た。

本発明を実施するに際して、単一種の純染料
（他の場合には特定の研究に随意に組合せ得る）
を簡単な水性系で末梢静脈血液試料又はその白血
球に富む試料を含めてそのフラクシヨンと接触さ
せて次の種類の前駆体細胞、白血球、血小板等の
各々を異色染色し且つ同定することが実施され、
各成分を精確且つ容易に同定し得る。これらの成
分種には骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄
球、バンド、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ−リ
ンパ球、Ｔ−リンパ球及び単球がある。血小板も
同定計算し得るが、異染性を示さない。

各白血球種は、ある場合に染料色素の収着の有
無によつて、主として可視光域を包含する普通の
光スペクトル（但し肉眼の応答により制限されな
い自動装置に重要である赤外域又は紫外域を除外
するものではない）の範囲内でスペクトル的に同
定し得る異なる色をもつ特性像を反映することに
より分別される。しかしながら螢光染料の応答に
頼る必要はない。

かくして前記の各種の１つを相互に分別でき、
計算でき、何れかの種の総数を測定でき、各種の
形態について研究でき、しかも衛生科学にとつて
きわめて貴重な多くの資料が得られる。

根本的に、前記白血球の各種は染料の特性、白
血球の種類及び分析される試料フラクシヨンに存
在する特定細胞の成分による染料受容量に応じて
同じ純異色色素から分別的に光を収着する。

固定剤の不在下においては、本発明の塩基性染
料は異色染色により収着されるので各種の白血
球、リンパ球又は顆粒球は試料中に存在する他の
各種の芽球、骨髄細胞、白血球又は顆粒球とは異
なる特性光スペクトル又は色を反映する。本発明
で使用される単一オレンジ染料の目立つ程に鮮明
な染色変性は現在知られている限りでは特異的で
顕著である。骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨
髄球、バンド、好中球、好酸球、好塩基球、Ｂ−
リンパ球、Ｔ−リンパ球及び単球を含めて細胞系
列の各種はこうして単一異色染料を収着して可視
光域での分別し得る光スペクトル又は色を呈す
る。前記の特許出願で提案した如く本発明で用い
る染料を他の染料と組合せて用いることはある種
の白血球分析に有用であり得る。

前記特許出願で使用される新規な染料及び新た
に同定した染料の主要な同定基準はそのスペクト
ル曲線である。

本出願人の出願に係る前記の特許出願は一群の
特異な異色染料を単独で（組合せて用いることが
多い）用いて人血試料中に存在する５種の白血球
即ち好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球及び単
球を互いに同定及び分別し得るという発見に基づ
くものである。

本発明は、固定剤を含まない試料又はフラクシ
ヨンに超生体血液分析技術で塩基性オレンジ21
（スペクトル曲線No.７）として知られる染料を水
性系で単独で用いて格別の且つ明瞭な異色染色要
領で前記に同定した系列の人血球及び血小板を染
色するという塩基性オレンジ21染料の能力を発見
して更に進展させたものである。

この個々の細胞種を互いに同定することにより
顕著な程度の識別が反映される。

前記の血液細胞は従来複雑な手段により識別、
同定されたけれども、従来技術では前記細胞種の
各々を互いに単一染料で同定且つ識別し得ること
は全く提案されていない。

染料の同定はカラーインデツクス（CI）から
であり、そこでは塩基性オレンジ21はカラーイン
デツクスNo.48035によつて同定され本明細書では
化学構造及び次のスペクトル曲線によつて同定さ
れる。或る目的で塩基性オレンジ21と組合せて用
いるように前記の特許出願で提案されるスペクト
ル曲線No.２（ブルーボレル）も本明細書に示す。
一般に最大ピークが低く傾斜の変化度数の多い上
部曲線（破線）は紫外線に対する応答曲線を示
し、一般にピークがより少なく高い曲線（実線）
は可視光線に対する応答曲線を示すことに注目さ
れたい。

理論的に拘束する意図ではないが、ほとんどす
べての外部添加剤は蛋白質物質を変形させる傾向
を有することは周知である。従来染色用の血液試
料の調製時には固定剤が広く一般的に使用されて
いた。経験上、固定剤は細胞の異色染色性と本発
明における染料の異染特性との共働関係を妨げる
ことが認められた。超生体技術を用いて固定剤を
含まない超生体試料使用の簡単な手段によりやつ
かいな添加剤の使用は回避される。

なお、超生体染色（supravital staining）と
は、生体から取出した生活組織に染色を加える方
法であり、生体内に染色液を加える生体染色
（vital staining）とは区別されるものであり、本
発明では超生体状態とは固定剤無含有水性媒質中
の生細胞例えば標準の凝固防止剤のみを含有しう
る血液試料を意味し、この生細胞試料に合成有機
染料を添加することに在る。

本発明を実施するに際して、染色は、普通の血
液温度（約37℃）において細胞学者が細胞発色の
起る前に精密な細胞化学的分析を行なう必要や鏡
検の開始前に先に算定したメンバーの白血球、リ
ンパ球及び顆粒球細胞間のスペクトル的識別を人
為的又は自動鑑別白血球計算システムにより行な
う必要がない程充分迅速に起る。

本発明で使用し得る固定剤を含まない血液試料
の例を下記に示す： １ 凝固防止剤（EDTA、クエン酸、ヘパリン
等）を含む全血、 ２ 凝固防止剤含有全血のデキストラン沈降及
び／又は重力沈降により得られた白血球の懸濁
物、 ３ 赤血球を溶解する低張液で血液を処理して主
として白血球及び血小板を残した全血試料、 ４ 髄液、胸膜液又は腹水液の如き他の体液の試
料及び白血球が関与する関節液の試料。

本発明は特に自動鑑別白血球計算システム用に
提供されるものではないが、かかるシステムにつ
いては深く研究された。

米国病理学者協会（College American
Pathologists Conference、コロラド州Aspen）
は1975年８月に“鑑別白血球計算”と題する一連
の論文を発表配布した。これらの論文には自動鑑
別白血球計算機に関する先行技術及び技術的進展
が示されている。更に、米国特許第3916205号及
び同第4146604号明細書では、ある種の螢光染料
の組合せが螢光反応に基づくある種の白血球及び
他の血球の自動鑑別に用いられていることにも注
目されたい。これらの文献は本発明の要旨及び目
的に関連あるものとみなされるが、上記米国特許
の発明は、白血球の鏡検に慣用的な細胞の固定処
理に依存するものであることに注目すべきであ
る。

先行技術は鑑別白血球計算の実施に幾つかの識
別レベルを示しているが、基本的なものは多形核
細胞と単核細胞との分別である。中間レベルで
は、多形核球を好中球、好酸球及び好塩基球に分
別しかつ単球とリンパ球との単核球分離を行なう
ことが原則として可能であるといわれている。

最も難かしいといわれているレベルは、好中球
を成熟形態と未成熟形態とに分別すること及びリ
ンパ球を普通の型と反応性型のものに分割するこ
とであり、このレベルは最初から認識されており
本出願人の前記特許出願に記載されている。現在
知られている限りでは、この開示は単一純色素に
より芽球、骨髄系列、バンド、多形核白血球（好
中球）、好酸球、好塩基球、Ｂ−細胞及びＴ−細
胞並びに単球及び血小板を単一染料及び単一試料
フラクシヨンで簡単に識別する唯一の方法を提供
するものである。

自動鑑別白血球カウンターの技術の現状は白色
光及び簡単な水性染料を用いる限りにおいて、開
発段階にあり、現状では主として準備の複雑な手
動鑑別手段に依存しているようである。自動鑑別
カウンターは、一般に１パターン識別システムと
２細胞化学的分別システムとの２つの群を有する
と言われる。従来の染色法は多少とも成功を収め
ているが、機器オペレーターは細胞基準で操作を
監視でき、通常鑑別計算は100個の細胞について
なされるにすぎない。従来の細胞化学的システム
は正確ながらなお満足できる測定機器の開発及び
熟練したオペレーターを必要とせねばならない。

従来の螢光法を簡単に概説すると次の点が指摘
される： 1.紫可視光線及び紫外線を含めた少くとも２種
の光源が必須であること；2.3番目の光源も必要
であると考えられること；3.白血球種の同定及び
分別に複数種の螢光染料を必要とすること；4.ア
ルコールで固定された血液塗抹を必要とするこ
と；5.所要染色時間が10分台であり、１分間の洗
浄後に乾燥を行なうこと；6.螢光強度が(a)好酸球
から(b)好中球、(c)単球、(d)リンパ球（好塩基球の
同定は示されていない）へと次第に低下する傾向
があること；7.流管システムでは血球はホルムア
ルデヒドで固定されて３種の異なる染料で染色さ
れること；8.検出白血球の螢光は螢光比によつて
鑑別計算され分類されること；9.前記米国特許明
細書には５種の白血球のうち４種のみの同定が示
されていること；10.特定の３種の螢光染料を組
合せて単一染料組成物を調製せねばならず、この
組合せは単に有利というだけではなく、当該方法
に必須であると考えられる。

これに対し、本発明では普通の白色光を必要と
するだけであり、その強度の変更も要求されな
い。また、本前記特許出願の染色又は染色液の１
つのみを用いるに当つて真に“単一”の純染料を
用いて実施できる。しかしながら、前記特願にお
ける純染料は、本明細書と同様に、単一人血試料
分析にスペクトル的識別の向上を図るために組合
せて及び単独で用いることもできる。更に、本発
明は超生体法に基づくものであるから、患者への
直接的、連続的かつ臨界的な白血球観測を所望目
的とする病院での診断及び治療の際に連続監視シ
ステムが可能となる。

超生体染料及び超生体染色という用語は、生体
の血液容器から分岐回路に連続潅流し、白血球の
全種をそれらが観測及び計算用の特殊側管に通送
されるにつれて連続的に監視する可能性を排除す
るものではない。

ほとんどの染料は超生体条件下で用いた場合に
毒性であることは知られている。塩基性オレンジ
21は本明細書の染色目的用に今日まで認められた
染料のうちでも最低の毒性を有する。白血球はす
べての赤血球が37℃の加温箱中で染色されると容
易に損傷を受けることも認められている。また、
一群の細胞に刺激もしくは損傷を与えると染料に
対する反応が著しく変化し得ることも認められて
いる。最大の染色強度を得るのに染色に30分程度
の比較的長い時間を必要とすることは珍らしくな
い。本発明で使用されるリンパ球及び白血球染色
剤はほとんど瞬間的に細胞を染色するので接触後
に時間を要しない。従つて、細胞は現在知られて
いる最も変性の少ない自然の形態で検査にかけら
れる。過度の暴露時間は鮮明な初期識別を妨害し
てしまう。

汎視性染色された試料に固有の制限に基づい
て、過去数10年にわたつて、ある型の血液細胞を
他の型のものからより精確に区別するための多数
の細胞化学的試験法が開発されてきた。一般に、
これらの試験は特定の細胞中で他の型の物質と比
較してより多量に存在するある型の物質を検出す
るかあるいは他の細胞に比して一細胞中の特徴的
な細胞状機能質内におけるある物質を検出するよ
うに考案される。たとえば、非特異エステラーゼ
の活性は単球中においては異常に高く、この活性
は弗化ナトリウムによる阻害に対して特に感受性
であるように思われる。同様に、顆粒球状細胞の
同定は大部分リゾチームの性質の明示に依存す
る。これらの目的のためには、ミエロペルオキシ
ダーゼ及び特異エステラーゼ活性の測定が細胞化
学的試験として有用であつた。好酸球のリゾチー
ム顆粒はシアン化ナトリウムによる阻害に対して
耐性であるミエロペルオキシダーゼを含み、好塩
基球の顆粒は、一部はこれらの中にヘパリンのよ
うな陽イオン性物質が多量に含まれているという
理由で、種々の染料で異色染色される。

塩基性オレンジ21についての研究を更に進める
と前記の特許出願以上に驚くべき進展を示した。
塩基性オレンジ21は或る特異な性質を有すること
は最初から認められており、本発明でも最初の観
察を立証している。

本明細書で認められる如く単球は非染色核反応
を示すが細胞質及び顆粒の色識別により同定され
る。

単球、好中球、好酸球及び好塩基球の同定のた
めの慣用の細胞化学的染色法と比較して、塩基性
オレンジ21による末梢血液白血球の超生体染色は
いくつかの利点をもつ。それは迅速に行なわれ
る、すなわち最大発色のために２分以下を要する
のみである点で有利である。それはまた慣用の細
胞化学的試験に使用されるごとき合成基質及び複
雑なアゾ染料及び発色剤を使用しない点でも有利
である。従来技術による細胞化学的試験は着色剤
の非特異的沈降、基質の劣化及びPH及び金属イオ
ン含量の複雑な調整の必要性のために判断が難し
い。

生血液細胞を用いかつ固定剤を含まない希釈水
性染料による超生体染色に対するこれらの細胞の
親和力の差を利用する前述した超生体染色技術は
慣用の固定剤を用いる場合に屡に生ずる人工物
（artifact）を回避する。本発明によつて提供さ
れる生体染色法は現在使用されている慣用の染色
法よりも染料の細胞的局在（たとえばリゾソー
ム、フイブリル状構造体、核染色質）をより正確
に映し出す。鑑別血球計算の自動化された技術に
おける継続的経験及び改良によつて、末梢血液白
血球の固定剤無含有超生体染色は血液及び骨髄細
胞の細胞化学にとつて重要な資料を与えるであろ
う。

塩基性オレンジ21を同定する命名法はカラーイ
ンデツクスからであるのは認められる。他の名称
によつても同定される。命名法に場合によつては
混同が生じるため、しかも塩基性オレンジ21は特
異に活動するけれどもカラーインデツクスにおけ
るその次の近在物は殆んど同一の化学構造（上記
参照）を有する塩基性オレンジ22でありこれは活
動せず本発明の目的である異染性を示さないとい
う事実のために、本発明で用いる特定の第４級陽
イオン型染料を同定するのにスペクトル曲線と既
知の化学構造に依存するものである。本発明で用
いる全ての活発な染料は単球を異色的に同定する
ことが認められるのは興味深い。

白血球の同定及び識別を理解する手助けとして
この時点で第１図を参照するのが都合良い。

全ての血液細胞は、間葉細胞とも呼ばれる未分
別の幹細胞から生ずるように思われる。幹細胞の
直後の成分は芽球と呼ばれ、特定の骨髄芽球は白
血球の先祖であると理解され、白血球は固定剤が
不存在下の水性系で塩基性オレンジ21に暴露した
時にそれらの超生体分析により識別、同定及び算
定される。骨髄芽球はリゾソーム顆粒の不在によ
りこゝでは同定され、リゾソームは異色染着によ
り骨髄系列の以後の下行細胞３種を特性的に同定
する。３種の下行細胞即ち前骨髄球、骨髄球及び
後骨髄球は異色染色及び色差及び以下に記載され
る色の分布により各々別個に同定される。

前骨髄球は次の手動又は自動観測により容易に
同定される。前骨髄球は一般に前述した骨髄系列
のうちでは卵形の核Ｎ−１は塩基性オレンジ21に
よつては染色されず、全顆粒球細胞の比較的大き
な部分を占める。前骨髄球の細胞質Ｃは橙赤色の
比較的小さな一次顆粒１の多数と橙赤色顆粒の塊
状物間に分布した少数の分散された紫色の顆粒２
とで密に充填されている。

骨髄球はまた面積がわずかに減少した非染色卵
形核Ｎ−２を有する。目立つて識別し得る事実
は、未成熟骨髄球細胞の一般に厚い半円形部分
に、より大きな黄色二次顆粒４が骨髄球中にはつ
きりと発達していることである。２本の仮想線ａ
−a′は個数の増大している骨髄球のより大きな黄
色二次顆粒４を個数の減少しているより小さな橙
赤色一次顆粒６から一括しておりしかも輪郭を描
いている。発達中のより大きな黄色二次顆粒４の
単離成分が認められることにより骨髄球は前骨髄
球とは区別されることが観察される。

後骨髄球は、骨髄系列中の最初の細胞の前記し
た卵形とは異なつて発達中の小裂片模様を示し始
める非染色核Ｎ−３を有する。減少しつつある塊
状体のより小さな橙赤色一次顆粒６は今や後骨髄
球細胞の細胞質Ｃ−２の総面積のうちで比例した
小面積となる。より大きな黄色二次顆粒８は以前
卵形の未染色核Ｎ−３のかなりの中心部分に取つ
て代わると思われ、これは卵形から小裂片形へと
いう言葉上の表現により意図した変化を表わす。

バンドは徐々に独特となり、顆粒の異色染色を
示す最初に挙げた３種の細胞とは別個に置かれる
が、骨髄系列の構成成分である。

現在知られている限りでは、バンドは何れの染
料の異染性によつて他の全ての白血球からは従来
区別されなかつた。

バンドは骨髄系列の先の白血球細胞と比較する
と、全体のバンド寸法と共に面積（容積）が明ら
かに減少した未染色小裂片形核Ｎ−５によつて他
の全ての白血球から区別される。更には小裂片形
の未染色核Ｎ−５は細胞質Ｃ−６の内方成長によ
つて更に二又に分かれるようなる。細胞質中に黄
色二次顆粒１２が数により生長増大することによ
り極めて小さな一群の残留するより小さい橙赤色
一次顆粒１０以外は全て二次顆粒１２によつて取
つて代る。一群の赤色顆粒１０は内方突起物に特
異的に局在され、細胞質Ｃ−６の移動により核Ｎ
−５を分裂させる傾向があることに注目された
い。より大きな黄色二次顆粒１２はバンドのこの
特徴ある対照色群以外は細胞質Ｃ−６を首尾良く
接収した。バンドを分別する重要な特質は10で細
胞質Ｃ−６中に小さな一群の赤色顆粒１０が存在
することである。

バンドを他の全ての白血球から識別するこの目
立つ特質は、大部分のより大きな黄色二次顆粒１
２によつて包囲された小さな橙赤色一次顆粒１０
を知覚するのに適した自動装置の開発に極めて有
用であると示唆される。

単一染料を用いてバンドを他の全ての白血球か
ら容易に、迅速に且つ確実に識別し、同定し、算
定する能力は予期しえぬものであり且つバンド機
能の既知理論には及ばないものである。

好中球は成熟白血球であり、本出願人の前記特
許出願に関与する主要な５種の白血球から認識し
得ることは知られている。

好中球、好酸球及び好塩基球は全て相対的に同
様な物理形状を有する。固定剤を含有しない環境
中で単独の超生体染料として塩基性オレンジ21を
用いて、好中球は細胞質Ｃ−８中の二次顆粒１６
（主として黄色）によつて同定する。核Ｎ−８は
染色されず、一般に分裂する。大きな黄色二次顆
粒１６は細胞質Ｃ−８の大部分を構成する。

好酸球はまた分裂した未染色核Ｎ−１０を有す
るが、大きな二次顆粒１８は細胞質Ｃ−１０の主
要な特徴である顆粒の橙色によつて好中球及び好
塩基球から識別される。

好塩基球の分裂した核Ｎ−１２は塩基性オレン
ジ21によつては染色されないが、好塩基性顆粒２
０を淡青色を有する明るい深紅色に異色すること
により好中球１６及び好酸球１８の顆粒とは二次
顆粒２０は異なる。

前記した細胞系列において図示した白血球の
各々、好中球、好酸球及び好塩基球は実際上それ
らの特異な前駆体バンドから誘導されるものであ
る。図面はこの進行を詳細には示していない。前
骨髄球は単球の前駆体として示してある。

Ｂ−リンパ球及びＴ−リンパ球はそれぞれ必須
の卵形核Ｎ−１４及びＮ−１６を有する。核Ｎ−
１４及びＮ−１６の各々は同様な黄色に染色され
る。各々の場合細胞質Ｃ−１４及びＣ−１６は未
染色のまゝである。またＴ−リンパ球の細胞質Ｃ
−１６の１つの特性はＴ−リンパ球をＢ−リンパ
球から明らかに識別する。これは細胞質Ｃ−１６
中に小さな一群の赤色顆粒２２が存在することで
ある。

本出願人の前記特許出願において認められた如
くかなり顕著な観察は、白血球の同定及び識別目
的に染色変性的に活性であつた塩基性第４級陽イ
オン型染料の全てによつて単球が影響を受けると
いう事実であつた。

塩基性オレンジ21を用いると単球はそれらの一
般に卵形の核Ｎ−１８については染色されない
が、細胞質Ｃ−１８は桃色気味の色を得、細胞質
中には拡散した比較的少数の深紅色及び桃色の顆
粒２４が識別され、該顆粒２４は色合い、濃度及
び色度において桃色気味の細胞質Ｃ−１８とは十
分な程に異なつて細胞質Ｃ−１８とは明らかに光
学的に識別される。

単球の同定及び算定は本出願人の前記特許出願
において記載された如き発見により簡素化され
た。単球の同定に細胞化学で用いられている標準
的な弗化物感応性非特異エステラーゼ反応はその
完了にしばしば１時間以上を要しかつ良好な結果
を得るのに正確な細胞化学的処理を必要とする。
これに対し、前記した染色の何れか１つを用いた
場合には軟層浮遊物、血液全体又は分離したフラ
クシヨンの染色及び検査を化学的調整なしに何分
台の時間で簡単に実施できる。塩基性オレンジ21
のみを用いる本発明による単球の染色はその細胞
質及び細胞質中の顆粒について瞬間的になされ
る。

異染性染料は最終的には同定をなし得ない時点
まで細胞を染色してしまうことも認められる。即
ち分析を迅速に行わないと、本明細書に報告した
色差が失われるか又は大きな程度に減少してしま
う。しかしながら、実際の染色は迅速に起るので
最大の識別を得るのに長い待ち時間は必要ではな
い。

従来法では単球の同定及び分別は、非特異エス
テラーゼ反応、固定された細胞調製、
Hexazotization、PH調節及び前記特許出願によ
る染料の何れか１つを用いる場合には簡単な染料
と血液試料との水性系における接触によつて所望
ならば１分以内でなし得ることを行なうのに約60
分をも要する複数の染料による染色を伴なう時間
のかかる複雑な細胞化学的処理によつて実施され
ていた。本発明の方法による特定の染料を用いる
と単球の細胞質の瞬時的な選択的染色がなされ
る。

提案した最終用途及び本発明の目的に使用され
る特異的染料は蒸留水に溶かした約１％の純塩基
性オレンジ21濃度での過ずみ水溶液として調製
される。この染料濃度は特に限定的ではなく、変
化し得る。水溶液は調製したばかりのものを用い
るのが好ましく、また有毒な添加剤を含まないこ
とが好ましい。染料と特定種の白血球との染色変
性反応の妨害は従来の固定剤の使用により総じて
阻止され得る。

本明細書で用いられる“超生体”という用語の
適用範囲は重要であり、これは原血液試料にもま
た生体から新しく取出した生細胞もしくは殺した
ばかりの細胞又は均等物にも適用される。この用
語を用いる場合、それはすべての固定剤を排除せ
んとするものであるが、凝固防止剤（ヘパリン、
EDTA等）の使用は許容される。血球は骨髄、
尿及び例としてリンパ組織及び脾を含めて他の血
球含有生物試料からも採取され得る。

本発明の一般的実施態様を以下に説明する。

選択された塩基性第４級陽イオン型染料（こゝ
では塩基性オレンジ21）の蒸留水中の１％溶液を
調製する。実施上必要ならば、かかる染料を２種
以上互いに溶液として組合せて使用することもで
きる。塩基性オレンジ21（スペクトル曲線No.７）
は特異的である。

選択され、予じめ同定された単一純染料（又は
前記特許出願の第表〜第表に示される如き純
染料の２種以上を組合せて用い得る）の水溶液を
可溶化して簡単な染料水溶液を作る（この際染料
水溶液の容量割合及び染料濃度は個々特定の細胞
学的分析に最適条件を与えるように考察される）。
個々の利点を有する染料の特定の組合せは本発明
の範囲内で若干の実験により生起され得る。

血液試料は、赤血球を遠心分離、低張溶解、重
力沈降、密度勾配沈降等により除去した新しい静
脈血液試料又はかかる物理化学的方法により得ら
れた白血球に富む血漿試料等の種々の原体からの
ものを利用できる。固定剤は使用しない。

得られた染料水溶液と血液試料は共に調製した
ばかりのものを普通の血液又は体温（約36〜40
℃）の温度において一緒にすることが好ましい。
一般に比較的高い温度の方がより迅速且つ鮮明な
染色が得られる。塩基性オレンジ21は感温性であ
るとは思われない。

染料溶液と血液試料とは約１：４の容量比で合
する場合に良好な結果が得られる。得られた混合
物を数秒間弱く攪拌し、その直後にこの混合物の
一滴を覆いガラスを用いる湿スライド板として光
顕微鏡又は自動鑑別白血球計算装置により検査す
る。染料と血球とを接触させる他の方法には、約
１％濃度で染料を含浸させた既知の媒体、例えば
ゼラチン、エマルジヨン等を用いる方法がある。
血液試料を固定すると、本発明による染料の白血
球との特異的な染色変性作用が著しく妨害され
る。

塩基性オレンジ21染料を用いると次の細胞を互
いに同定及び識別し得る；骨髄芽球、前骨髄球、
後骨髄球、骨髄球、バンド、好中球、好酸球、好
塩基球、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球及び単球。
算定及び他の研究用の識別手段の外観は図面で先
に展開させた。

後記の実施例は本発明による新規方法の理解を
助けるためのものである。本発明方法の利点とし
ては白血球総数及び各種白血球の計算、病気（特
に白血病）の診断及び種々の臨界的治療、例えば
化学療法、放射線療法、ACTH等を受けている
患者の監視に利用できる。

全ての白血球種の同定及び算定は病気の診断及
び治療にきわめて重要であることは知られてい
る。

次に本発明を実施例により更に説明する。

実施例 １ （塩基性オレンジ21、スペクトル曲線No.７） 広範囲の一連のメチン、ポリメチン、キノイド
及び／又はカルボシアニン染料を用い、これらか
ら白血球の識別染色に関して塩基性オレンジ21が
特異的に染色変性であることが見出された。試験
した大きな群の染料のうちで前記種類の染料は構
造上類似しているのみならず塩基性オレンジ22の
場合には置換基の小さな差異によつてのみ異なる
構造（前記参照）を塩基性オレンジ21は有する。

本出願人の前記特許出願におけるよりも拡大し
た群のうちで塩基性オレンジ21のみが特異的な異
染性を示すことを見出した。

正常な個体からの末梢血液50mlを一連のヘパリ
ン添加管に得る。

２本の試験管に、蒸留水に溶かした塩基性オレ
ンジ21染料の１％溶液10mlを37℃で混合した。使
用温度はこの染料に対して臨界的であると観察さ
れない。

鏡検により、褐色顆粒を有すると最初記載され
る好酸球は非染色小裂片状核と共に細胞質中に橙
色の大きい顆粒を有していた。好塩基球は同様な
幾何形状を有することが観察されたが、顆粒は淡
青色の色合で全体の色調が明かるい深紅色であつ
た。核も小裂片状であるが染色されなかつた。単
球は非染色卵形核及び深紅色及び桃色の顆粒を含
む桃色細胞質により明らかに識別される。非染色
には幾分スライド板を読み取る前の時間に応じて
きわめて青白色気味がある。

全く顕著なことには、成熟好中球と未成熟好中
球との染色差は、本発明者による研究で今までに
観察された染料又は従来技術に報告された染料よ
りも更に特異的である。成熟好中球は細胞質中の
主として黄色のより大きな顆粒及び裂片状未染色
核によつてスペクトル的に同定し得る。未成熟顆
粒（第１図参照）は細胞質中の橙赤色顆粒及び一
般に卵形の非染色核によつて同定されるのが観察
された。

実施例 ２ ナイロン網ガーゼのマイクロカラムに
FicellHypaque富化フラクシヨンを通送させるこ
とによりヘパリン添加バキユテーナー管に、正常
な個体から得られた末梢血液の50ml試料から人血
のＴ−細胞及びＢ−細胞に富む浮遊物を調製す
る。従来技術で知られている選択した緩衝剤を用
いて温度制御条件下でＴ−細胞及びＢ−細胞に富
む浮遊物をカラムから溶離させる。

Ｔ−細胞についてはＴ−細胞ロゼツト及びＢ−
細胞については表面免疫グロブリン検出を用いて
前記の回収された浮遊物のフラクシヨンを免疫学
分析にかける。塩基性オレンジ21染料の１％水溶
液の１滴を別個の試験管中で前記の回収した浮遊
物の５滴に配合する。各々の試験管は大体２×
10⁶個のリンパ球を有する。Ｔ−細胞ロゼツト組
成物によりＴ−細胞として同定したリンパ球は顕
微鏡での観察により小さな群の５〜10個又はそれ
以上の赤色顆粒を含有する。免疫学法によりＢ−
細胞として同定したリンパ球は細胞質中にまれに
のみ赤色に染色された１つの顆粒を示すが；Ｂ−
リンパ球の大部分は細胞質中に赤色顆粒を有しな
かつた。核は卵形でありＴ−細胞とＢ−細胞との
両方共黄色に染色された。染料のローダニルブル
ー及びカルボシアニンＫ−５（前記特許出願参照）
は一般にリンパ球を染色するが、顆粒は塩基性オ
レンジ21染料を用いた時程には鮮明ではない。

塩基性オレンジ21を用いることは現在の方法学
よりも優れた新規で迅速な方法をＴ−リンパ球及
びＢ−リンパ球又は細胞を同定、識別及び算定す
るのに与えるものである。現在の方法では不安定
な生物学的反応剤（羊の細胞）を用い、高価で時
間のかかる放射性同位体技術を必要とし、温度及
び反応培地のPH等を含む多数の変数の制御を必要
とし、これはもはや必要とは思われない。

実施例 ３ 正常で健康な人の末梢血液試料は、前骨髄球、
骨髄球及び後骨髄球を含めて骨髄系列の未成熟白
血球を一般に示さない。これらの未成熟白血球は
或る病気の状態に見出され、例えばガンによる骨
髄の侵入、重病に見出される如き類白血病性反
応、慢性顆粒白血病等に見出される。一連の試験
において、塩基性オレンジ21は正常な白血球に対
する１変数である病気持ちの白血球を染色するこ
とが観察された。即ち標準又は健康で正常な末梢
血液試料を比較することにより、好酸球の顆粒は
暗橙色に染色されるが、急病患者の好酸球の顆粒
は黄金色に染色されることが観察された。

実施例 ４ 末期に乳ガンにかかつた48才の女性患者は死亡
直前に敗血症と高熱とを併発した。その決定的時
期に彼女の白血球数は45000／mm²に上昇した。標
準ライト染料を用いることにより、末梢血液の白
血球の60％は特徴ある未分裂核を有するバンドで
あることが確認された。

固定剤の不存在下で超生体染料として塩基性オ
レンジ21の１％水溶液で患者の血液試料を染色す
る。

バンドは、黄色に異色染色された大多数のより
大きな（二次）顆粒の中に小さな群の赤色染色
（一次）顆粒が堅実に存在し並びに代表的な未分
裂核が存在することにより同定された。

即ち単に核の大きさ及び形状についてよりもバ
ンドの細胞質成熟及び一次顆粒対二次顆粒の識別
色に基づいてバンド形を積極的に同定、識別及び
算定することができる。

実施例 ５ 未治療の慢性リンパ球白血病にかかつているこ
とが知られている患者５人は末梢静脈血液試料の
供血者である。

通常の免疫学標識（Ｔ−細胞ロゼツト、IgG表
面標識）を用いるとこれらのリンパ球は型式が全
てＢ−細胞であることが確認された。

一連の試験管中で、各供血体試料のフラクシヨ
ン５滴を塩基性オレンジ21の調製したこの過済
み１％水溶液１滴と混合する。光顕微鏡下で湿ス
ライド板として鏡検したスライド板は、細胞質中
にＴ−リンパ球即ちＴ−細胞の特徴であるような
一群の赤色顆粒を細胞の何れもが含まないことを
示した。病気にかかつた細胞は全て正常なＢ−リ
ンパ球即ちＢ−細胞と同様に核が黄色に染色され
た。

これらの試験結果は遅滞なくまた厄介な細胞学
に依ることなく、Ｔ−細胞が存在しないという結
果を確認し、慢性リンパ球白血病はＢ−細胞に関
連する病気であるという現在の理論を補強した。

実施例 ６ 62才の男性患者が39.5℃の温度の悪寒、発熱で
病院に収容された。Ｘ−線での検査により肺臓の
右下部葉に広範囲の肺炎を示した。血液培養は肺
炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）に対して陽性
である。抗生物質での治療前に通常のライト染料
を用いると、白血球数は36000／mm²である。血液
は多数の前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球並びに成
熟好中球を含有した。

染色体の研究によると患者は白血病ではなくて
類白血病性反応を有すると診断される。

ヘパリン添加末梢血液試料を得、しかもこれ
を、塩基性オレンジ21の調製したての１％水溶液
１滴と血液フラクシヨン５滴とを用いて固定剤の
存在しない超生体分析にかける。染料試料を攪拌
し、直ちに湿スライド板として検査した。前骨髄
球は明るい橙赤色又は深紅色又は紅色に染色され
た一次顆粒によつて分別された。骨髄球は後骨髄
球と対比すると細胞質中に小割合の黄色顆粒乃至
橙赤色顆粒を有し、後骨髄球の赤色顆粒（リゾソ
ーム）は、顕著な２種の色調模様を付与する細胞
質のより小さな部分端部で集合している。好中球
は主として黄色の二次顆粒細胞質によつて同定さ
れる。結果が証明する所によれば塩基性オレンジ
21染料は顆粒細胞が成熟する種々の認識段階の瞬
間的な識別を提供し、血液又は組織流体液剤にお
いて顆粒細胞を同定し得るものである。

前記のように、本発明は自動鑑別白血球計算装
置に応用した場合にその技術的進歩性がいつそう
強調されることになるが、現在本発明方法をその
まま実施し得る好便な自動装置は知られていな
い。医学分野の当業者には、種々の目的のために
鑑別白血球計算を迅速かつ正確に行なう重要性は
良く認識されている。米国では毎日50万回もの鑑
別白血球計算が行なわれていると推定され、その
ほとんどが手動法でなされており、それに要する
コストは年７億５千万ドルにも及ぶであろう。

かような白血球計算は手動であれ自動であれ、
医療業務において同定、スペクトル的識別、算定
及び診断補助という基本的要件を有する。これら
の基本事項における改善は明らかに補助自動装置
における改良をもたらすであろう。

血球計算は手動又は自動に拘らず、病気の検査
及びその種類の決定においてきわめて重要な補助
資料を与える。原因不明の発熱；生体感染又は化
膿性感染、化膿性付属器、胆のう、卵管（フアロ
ピオ管）；種々の段階の種々の病気にかかつた患
者の予後；ホジキン病等の悪性腫瘍；肺病；副腎
皮質ステロイドによる患者治療の監視；種々の急
性及び慢性白血病；骨の無菌性梗塞と骨髄炎との
診断鑑別；細菌感染及び他の多くの医療上の問題
について正確な白血球計算、分析及び細胞学的考
察により診断、予後及び治療が助成される。

前記のように、“染色変性（又は異染性）”とい
う用語は、用いられる染料の特異的な性質ばかり
でなく、各種白血球の種々の成分（例えば核及び
細胞質）の特質にも関連するものであり、両者は
相乗作用で染色変性反応を起して分別されるスペ
クトル応答を与え、それによつて細胞化学におけ
る前述した改良が得られる。本質的に各種白血球
は、染着された各細胞が個々に異なる光スペクト
ルを呈するように単一異色染料を特異的に染着す
る（あるいは染着しない）。

或る顆粒状白血球が種々の染料に対して相異な
る親和力を有することは周知であり即ち好塩基球
は塩基性染料に対して親和力を有し、好酸球は酸
性染料に対して親和力を有するが、好中球は酸性
染料及び塩基性染料の何れによつても強くは染色
されず、塩基性オレンジ21の特異性を表わし得る
形態学的特徴又は化学的挙動は示唆されず、然る
に塩基性オレンジ21はＴ−リンパ球とＢ−リンパ
球との間に見出されるような鮮明な区別を与え且
つバンドに特異な区別を与える。

この事実は、化学構造において前述した如く２
個の第２級基の位置が変化している塩基性オレン
ジ22が前記の用途に全く作動しないことを考えれ
ばより神秘的である。

単球の同定、識別及び算定は価値ある診断意義
を有する。血液中に単球の個数が増大すると急性
結核、敗血症又は血得被毒及びホジキン病の如き
リンパ腫の存在が診断で示される。減形成貧血又
は無形成貧血から回復しつつある人の血液中に単
球の個数が増大すると患者にとつて良好な予後を
与えるものである。この方法による単球の迅速且
つ正確な鏡検分析は貴重な診断法の幅広い応用に
つながる。

多形核白血球（好中球）の検出、同定及び算定
は全ての血液評価に臨界的なパラメーターとな
る。これらの操作は好中球の個数が増大する肺炎
又は腹膜炎のような急性感染症の診断に特に重要
であり、また化学療法及び放射線療法を受けてい
る患者の監視に重要である。好中球数の減少は薬
物毒性の発現としての不可抗力的感染、脾の機能
亢進及び急性白血病において起り得る。

好中球の絶対数が1000／mm³以下に下がると感染
の危険が急に高くなる。本発明における特定染料
は、好中球の構造を同定する特徴である顆粒又は
リゾソームを瞬間的に染色する。

好酸球は好塩基球と同様にアレルギー反応に関
与する。リンパ球は炎症に関与し、より多大には
免疫反応及び抗原に対する応答に関与する。好酸
球は細胞質の大きな橙色顆粒と未染色核の裂片形
状とによつて瞬間的に同定される。

好酸球数は臨床疾患の治療における向副腎皮質
性ホルモン（ACTH）の投与を追跡するのに用
いられる。従来法では好酸球と混同される人工物
及び不定形の物が導入された。従来法による血球
計算の正確さは血液試料の調製から計算完了まで
の時間の経過と共に低下し、また複数の染料の使
用が必須である。更に、酸及び塩基染色がしばし
ば要求され、用いた染料は放置すると溶液から晶
出する傾向がある。

リンパ球、特にブルーボレルで同定し得るリン
パ球は炎症及び免疫に関係があることは知られて
おり、慢性リンパ性白血病及び百日咳にかかつた
患者の血液中で数が増加する。一方、リンパ球数
は化学療法及び放射線療法を受けている患者、例
えばリンパ腫及び遺伝性免疫不全症候群にかかつ
た患者の血液中では減少し得る。

好塩基球はヘパリン、セロトニン及びヒスタミ
ンの如き陽イオン性物質に富む大きい顆粒を含む
細胞質を有する。好塩基球は例えばアレルギー反
応に関与する。

本発明の主要な技術的進歩は、リンパ球を分別
染色する１つの特異な染料が存在するという知見
にあり、従来リンパ球はわずか１種として低温で
のブルーボレルによつて染色されており、ブルー
ボレルはリンパ球各種の人為的及び自動的同定及
び検査に単一の純粋な形で使用できる。本発明に
よる特異的塩基性オレンジ21と前記特許出願に記
載された染料との組合せを用いることにより潜在
的な利点が見出され得ることは明らかである。

Ｔ−細胞及びＢ−細胞の従来の研究では、それ
らの識別はより複雑な生化学的製剤及び方法を伴
ない、例えば次のものがある：1.酸性ホスフアタ
ーゼ（酵素）；2.非特異エステラーゼ；3.人間の
イムノグロブリン（I_gＧ）の断片；4.螢光染料及
び5.SRBC−約14日の有効寿命を有する羊の赤血
球製剤、これはＴ−細胞を同定するのにロゼツト
形成用の基剤である。

Ｔ−リンパ球は末梢血液中に60〜80％が見出さ
れ、胸管中に85〜90％が見出される。これらの細
胞は異性移植拒否症に関与していることは知られ
ておりＴ−細胞とＢ−細胞との両方は免疫学及び
病理学に重要な要件である。Ｂ−細胞数はごく少
なく胚中枢及び髄索において10〜30％である。

薬物付加物はＴ−細胞をかなり減少させる。

先天性の免疫学疾病の大部分はＴ−細胞とＢ−
細胞とのシステムに関連する。新形成病気はまた
免疫遺伝システムを伴なうことも知られており、
患者はＴ−リンパ球とＢ−リンパ球とのシステム
の特異物質を有することが認められている。成人
のリンパ腫は大部分がＢ−細胞起源を有するが、
然るに幼年期のリンパ腫はＴ−細胞標識を所持
し、これは幼年期初期ではより活発な胸腺に関与
すると思われる。

慢性リンパ球白血病はＢ−細胞に関与してお
り、白血病細胞はＢ−細胞でありＴ−細胞の集落
は何ら有しない。この簡単な概略から、これらの
細胞の容易な同定、比較及び算定の重要性は大い
に有意義である。

全ての場合に、鏡検は臨床鏡検法で標準的に用
いられる白色光の照射を伴なうと意図される。自
動鑑別白血球計算は普通の白色光照明で現在可能
とされているが、知られてる限りでは市販の装置
は本発明では直接有用ではない。本発明の方法
は、コンピユーターに関連した自動鑑別白血球計
算手段の首尾良い開発を遅らせている問題の多く
を克服できるものである。

“染色変性（異染性）”という用語は、ある種
の細胞による染着時に明らかに色を変える染料に
ついてエールリツヒ（1897）がはじめて用いたも
のと考えられる。染色変性を示すといわれる染料
は組織を異なる色で染色する比較的少ない純染
料、メチン、ポリメチン及びカルボシアニンを含
む主として塩基性陽イオン型染料の性質として検
討されてきた。染色変性はまた、同じ染料により
染色された場合異なる物質が異なる色スペクトル
を呈するものと定義される。細胞学では染色変性
顆粒又は他の細胞成分はそれらの染色に用いた染
料とは異なる色を呈するものである。

“染色変性”という用語には本来二つの要素が
関与してくる。一方は生体細胞（及びその特殊部
分）の特質又は性状であり、他方は染料の特性で
ある。細胞内の構造を刺激して染色変性を示すの
に必須の特性を有する染料は非常に数少ない。
Conn（第９版）には“この反応を示す純染料は数
少ない”と報告されており、３以上の区別される
色スペクトルを伴なう現象を示している文献はほ
とんどない。ある文献には、“軟骨に対して紫色
の染色変性を示す淡緑青色核染料”が報告されて
いる。しかしながら、慣用の予備染色法により化
学的及び物理的性状が変わる固定組織に通常適用
されている染料の場合には、細胞標本内における
自然な生物構造体間の本質的な相互作用が染色に
より変化し、染色しなければ反応し得るものに対
して感応性でなくなる場合が生じ、その結果染着
が起らなくなる。

螢光染料も周知である。螢光においては、選択
した狭い周波数で吸収されるよりも多くの光エネ
ルギーが選択した狭い周波数に亘つて放出される
が、反射される全光線は吸収される全光線以下で
ある。螢光異染性は知られている（例、アクリジ
ン クロモフオア種中の或る染料）。しかしなが
ら染色変性のこの特性は本発明で用いた用語「染
色変性」の範囲内にない。本発明による前記の用
語はConn（第９版）及び「Synthetic Dyes in
Biology、Medicine and Chemistry」及び
「Rational Use of Dyes in Biology」に見出さ
れる用語の使用法と一致しており、これらの文献
には、「螢光染色変性」の記載は認められない。

しかしながら、本発明の目的に有用な染料は溶
液中での螢光特性の如き或る螢光を示し得るが、
「螢光染色変性」の特性に依存して本発明の目的
に作動させるものではない。本発明で用いた用語
染色変性は所与の波長光線に対する螢光応答とは
別個である。

染料を更に分類するのに「カラーインデツク
ス」の如き特異的発色団を用いる。本発明の目的
に有用な染料は同定した種類中にごくわずかの染
料を包含する。１種として最大の有用性と最高の
見込みを有するのはメチン、ポリメチン、キノリ
ン及びカルボシアニン染料であり、こうして同定
した発色団は陽イオン種の他の発色団同志で橋か
けをする。例えばメチン又はポリメチン基は１つ
又はそれ以上のキノリン含有発色団同志の間で架
橋することが見出された。

有用な代表染料はアリールメタンとして同定さ
れた広い種類下にあることが見出され；そのうち
本発明の目的に有用な少数の選択した染料の１つ
はトリアミノトリアリールメタン（ホフマン、バ
イオレツト）であり、別のはフエニル ナフチル
メタン（ナイトブルー）である。これらの染料
は、試験したこの種のきわめて多数から有効であ
ると見出された一般的な種類のうちわずか２つの
みである。少しのみ有効であると知られた他の種
類にはオキサジン、チアジン及びインダミンがあ
る。カラーインデツクス分類システムに挙げた他
の種類の発色団は何れも有効な種類でなかつた。

本発明の異染性染料を包含する広義の塩基性染
料は助色団が第１級、第２級又は第３級アミン基
である染料であり；１つの窒素原子が第４級窒素
原子として少くとも作用し、無色陰イオン、最も
多くはハロゲン酸、の添加時に塩を形成し得る。
ハロゲン酸はイモニウム塩基と比較すると比較的
強力であるから、ほとんどの場合反応時に弱酸性
であり、酸性PHを示す。有機発色団は正電荷を有
する陽イオンであり、ハロゲンイオンはその陰イ
オン又は負電荷を与える。

塩基性オレンジ21、ポリメチン染料が白血球分
類の目的に見込みがあると先ず見出された本出願
人の前記特許出願に続いて、カラーインデツクス
に同定された他の塩基性オレンジ染料の試料、即
ち22、27、42、44及び46を見出し、染色変性につ
いてこれらはポリメチン種にあると報告された染
料である。塩基性オレンジ24、25、26及び28も試
験した。これらの染料の何れもポリメチンではな
い。ポリメチン及びメチン塩基性オレンジを含ん
で試験した塩基性オレンジの全てのうちで、塩基
性オレンジ21染料のみが本発明の目的に有用性を
有する。

ポリメチン種のうちの塩基性レツド13及び塩基
性バイオレツト16は前記特許出願における白血球
同定に異染的に価値があると確認されたので、カ
ラーインデツクスの同様に同定したしかも入手し
得るメチン及びポリメチンレツド及びバイオレツ
トを包含するように探索を拡大させた。試験下の
塩基性レツド14，15，27，37，68及び102は単球
及び／又は他の白血球を染色するのに必須な染色
変性の特性がないことを見出した。しかしなが
ら、塩基性レツド３５，３６及び４９（全てポリ
メチン）は前記特許出願で最初から有用性を有し
ている如く白血球の鑑別異色染色に有用であるこ
とが確認された。

塩基性バイオレツト（染料）７，15，16，39及
び40（また全てポリメチン）は有効且つ有用であ
ると見出された。しかしながらカラーインデツク
スでポリメチンとして分類されない塩基性バイオ
レツト14は塩基性バイオレツト16の如く白血球を
染色するのに染色変性を発現しなかつた。

カラーインデツクスは前記染料の全てを同定す
ると主張したけれどもスペクトル曲線は全ての染
料同定用の最後の裁定物として依存する。何故な
ら前記カラーインデツクスNo.に関連するこれらの
曲線は利用し得るからである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法により塩基性オレンジ21
染料を用いて種々の発現段階の白血球細胞を異色
染色した際に得られる種々細胞の形状及び染色状
況を示す図解図であり、第２図は本発明で使用さ
れる塩基性オレンジ21染料に特有のスペクトル曲
線を示す。第１図中Ｎ−１，Ｎ−２，Ｎ−３，Ｎ
−５，Ｎ−８，Ｎ−１０，Ｎ−１２，Ｎ−１４，
Ｎ−１６及びＮ−１８はそれぞれ各細胞の核であ
り、Ｃ，Ｃ−１，Ｃ−２，Ｃ−６，Ｃ−８，Ｃ−
１０，Ｃ−１２，Ｃ−１４，Ｃ−１６及びＣ−１
８は各細胞の細胞質である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人間の血液試料に存在する白血病性リンパ芽
   球を含めて正常な又は病的な血液白血球を選択的
   に且つスペクトル的に決定させる人間の血液の分
   析方法であつて、固定剤を含まず超生体状態で少
   なくとも１種の白血球を含有する含水状態の血液
   試料を調製して染料の塩基性オレンジNo.21と接触
   させることから成り、白血病性リンパ芽球を含め
   て正常な又は病的な血液白血球の血液成分に存在
   する染料着色済みの白血球種の各々は塩基性オレ
   ンジNo.21を異色染色的に且つ分別的に吸収してお
   り、この異色染色且つ分別吸収は(イ)核及び細胞質
   の固有の発色及び模様の有無及び(ロ)細胞質に存在
   するか又は存在しない顆粒の個数、大きさ、配列
   又は模様及び１色又はそれ以上の発色によつて確
   認することを特徴とする人間の血液の分析方法。 ２ 供血者試料中の人間の血液は次の血球種；骨
   髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド、
   リンパ球、Ｂ−細胞、Ｔ−細胞及び単球の１つ又
   はそれ以上を含有し、各々の１つを互いに光学的
   に同定し得る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 正常な又は病的な白血球はＢ−細胞及びＴ−
   細胞であり、これらは各々個々に同定できしかも
   前記分析の一部として同定且つ算定し得るもので
   ある特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 染料の塩基性オレンジNo.21と患者の供血試料
   との接触後に、かくして染色した又は未染色の供
   血体白血球を、同様に調製した比較用の基体標準
   である既知の健康な血液試料と顕微鏡下に比較
   し；診断される前記の供血体試料に存在する細胞
   質及び核中の顆粒の着色性について前記標準から
   の差異を記録し、こうして前記供血体試料フラク
   シヨンにおける前記標準からの変性を示している
   白血球の１つ又はそれ以上に作用している病気の
   有無を決定して患者の検査及び病気の治療の診断
   に役立つように供血試料を分析する特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血体試料のフ
   ラクシヨンとの接触後に、健康な標準体と比較す
   るようにして、核の色及び模様の有無又は変化に
   より且つ細胞質中の顆粒の個数、大きさ、配列又
   は模様及び１色又は多色着色又は着色の変化又は
   割合あるいは細胞質の着色の有無により、前記試
   料に存在する異色染色的に且つ分別的に染色させ
   た後の白血球種の各々を同定、算定及び対比して
   人間の病気の研究に供血試料を分析することから
   なる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血体試料のフ
   ラクシヨンとの接触後に、個々の血液細胞種を異
   色染色により互いに分別して分析中に存在する同
   定種を分類且つ算定し、これによつて供血試料に
   存在するリンパ球又は白血病性リンパ芽球を選択
   的に且つスペクトル的に識別する人間の血液の分
   析を行うことから成る特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ７ 染色変性により分別したリンパ球及びリンパ
   芽球は更に人為的観測により同定及び算定する特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ８ 染色変性により分別したリンパ球及びリンパ
   芽球は更に物理的な光スペクトル応答手段により
   同定及び算定する特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ９ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血試料との接
   触後に、Ｔ−リンパ球の顆粒以外には染色されて
   いない細胞質中に一群の赤色顆粒が認められ且つ
   Ｂ−リンパ球の細胞質の場合には前記一群の赤色
   顆粒が不在である（前記Ｔ−細胞及びＢ−細胞の
   核は黄色に染色されている）ことによりＴ−細胞
   をＢ−細胞から識別して、Ｔ−細胞及びＢ−細胞
   の光学的同定、識別及び算定を行なつて超生体人
   血を分析することから成る特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 １０ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血試料との
   接触後に、染色されていない核の回りに大多数の
   黄色顆粒よりなる細胞質部分に別個に比較的小さ
   な群落の橙赤色顆粒が存在することによりバンド
   細胞を前記試料に存在する他の白血球から識別し
   て、バンド細胞の光学的識別、算定及ひ比較を行
   なつて超生体人血を分析することから成る、特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 １７ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血体試料フ
   ラクシヨンとの接触後に、細胞質中に主として橙
   赤色の一次顆粒が存在することにより前骨髄球を
   識別し；より小さな半月形の主として橙赤色の一
   次顆粒と細胞質のより厚い半月形のより小さな塊
   状物の黄色二次顆粒との混合物が存在することに
   より骨髄球を識別し；より小さな半月形のより小
   さな塊状物の橙赤色一次顆粒と細胞質を成す半月
   形の別の部分のより大きな比例して厚い塊状物中
   に黄色の二次顆粒とが存在することにより後骨髄
   球を識別し；細胞質を成す二次黄色顆粒の主要部
   分中に比較的小さな一群の橙赤色一次顆粒が存在
   することによりバンドを識別し；実質的に全ての
   黄色細胞質顆粒が存在することにより好中球を識
   別して、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、バンド及
   び好中球を含有する顆粒球骨髄系列の固体の各々
   の光学的識別、算定及び比較を行ない（前記系列
   の各成分により実質的に染色されずに残る核の領
   域は明らかに比例して減少し、該系列の最初に挙
   げた３つの成分は最終に挙げた２つの成分よりも
   一般に大きい全細胞寸法を有する）これによつて
   人血試料の分析を行なうことから成る特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １２ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血試料との
   接触後に、白色光吸収装置により血液試料に存在
   する成分種の何れか１種又は全てを同定、識別及
   び算定でき、即ち成熟白血球、未成熟白血球及び
   人血試料に存在する他の血液フラグメント成分を
   互いに選択的に識別して、好中球、好酸球、好塩
   基球、リンパ球、リンパ芽球及び単球並びに骨髄
   芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球、血小板、バ
   ンド、Ｂ−細胞及びＴ−細胞より本質的になる血
   液成分種の全てを識別、算定でき、これによつて
   人血試料を識別分析することからなる特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 １３ 染料の塩基性オレンジNo.21と供血試料との
   接触後に、分別的に染色した人間の血球成分種の
   個数、大きさ、配列又は模様及び１色又はそれ以
   上の着色又は着色の変化又は割合を評価し、健康
   な標準体と比較するようにして細胞核の色及び模
   様の有無又は変化により且つ細胞質中の顆粒の個
   数、大きさ、配列又は模様及び１色又はそれ以上
   の着色又は着色割合の変化により又は細胞質の着
   色の有無により人間の病気の研究及び診断に供血
   試料を分析することから成る、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。