【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
（利用分野）
本発明はポリアクリルアミドによる粒状微生物
菌体の包括固定化に関するものである。
（従来技術と解決すべき課題）
一般にバイオリアクターに用いるために微生物
を包括固定する担体としては寒天、カラギーナ
ン、アルギン酸カルシウム或いはポリアクリルア
ミド等が知られているが、寒天やカラギーナンを
担体として用いる場合にはゲル化させる前に約40
℃以上に保持しなければならず、アルギン酸カル
シウムの場合はその必要はないがリン酸イオンの
存在下で溶解する虞れがある。いずれの場合も天
然物であるため分解され易く、機械的強度も小さ
い。ポリアクリルアミドはその機械的強度は大き
いが、重合熱のコントロールが難しいこと、粒状
にするために用いるヘキサン、トルエン、クロロ
ホルム等の疎水性有機溶媒が時として固定化され
る微生物にとつて甚だ有害な場合があること等が
知られている。
これらの問題点を解決すべく特開昭61−124385
号公報には、微生物、アルギン酸ナトリウム及び
アクリルアミドモノマー溶液を混合した後、塩化
カルシウム水溶液−重合開始剤混合液中に滴下し
て粒状ポリアクリルアミド固定化物を得る方法が
開示されている。しかしながらこの方法では微生
物の種類によつては粒状にならないものがあり、
或いはアルギン酸カルシウムによる粒状化とアク
リルアミドの重合を同時に進行させるので、重合
が完了する迄の間に可成りの量のアクリルアミド
モノマーが外部に漏洩する等の欠点がある。
（発明の目的）
発明者らは上記の点に鑑み、種々の微生物に適
用できる機械的強度の大きな微生物固定化法を得
る目的で鋭意検討を行つた。その結果、まず粒状
アルギン酸カルシウム−微生物固定化物を調製
し、次いでポリアクリルアミド重合系で重合させ
ることにより上記目的を充分に達成し得ることを
見出し本発明を完成させるに至つたものである。
（発明の構成）
本発明は、微生物とアルギン酸ナトリウム混合
溶液を塩化カルシウム水溶液中に滴下し、得られ
た微生物−アルギン酸カルシウム固定化物をアク
リルアミドモノマー重合用水溶液に浸漬し、次い
で重合開始剤を添加して重合操作を行うことを特
徴とする微生物の固定化法である。
本発明の方法は、まず最初に0.1〜2.0％アルギ
ン酸ナトリウム水溶液及び包括固定化する微生物
をよく混合し、これを常法どおり0.5〜2.0％塩化
カルシウム水溶液中に滴下せしめて粒状のアルギ
ン酸カルシウム−微生物固定化物を得る。次いで
アクリルアミドモノマー重合用水溶液にこの粒状
のアルギン酸カルシウム−微生物固定化物を浸漬
する。
本発明に用いるアクリルアミドモノマー重合用
水溶液は、例えばよく知られているものとして、
アクリルアミドモノマー、架橋剤としてＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミド或いはＮ，
N′−プロピレンビスアクリルアミド及び重合促
進剤としてＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチ
レンジアミン或いはベータージメチルアミノプロ
ピオニトリルを含有する水溶液、すなわち通常よ
く用いられるポリアクリルアミド重合系より重合
開始剤を除いた形の水溶液を挙げることができ
る。
前記粒状固定化物を浸漬すると、アクリルアミ
ドモノマー重合用水溶液は該粒状アルギン酸カル
シウム−微生物固定化物に浸透し、その中の水と
置換され平衡化する。次にこのものを引き上げ、
このものに重合開始剤を添加して重合操作を行
う。添加の方法は重合開始剤水溶液、例えば過硫
酸アンモニウム水溶液をこのものに噴霧するか、
或いはこの水溶液と十分混合する等により行わ
れ、粒状アルギン酸カルシウム−微生物固定化物
内部に浸透したアクリルアミドを重合させる。
ポリアクリルアミド重合系を含む粒状固定化物
は、既にアルギン酸カルシウムによつて粒状化を
完了しており、また粒状物内でアクリルアミドが
重合する際発熱はみられるが粒子と粒子との間に
十分の空間が存在するので重合熱は容易に発散す
ることができる。従つて、微生物に与える影響は
最小限に抑制され、且つポリアクリルアミドを確
実に粒状化することができるので機械的強度の大
きいものを得ることができる。
以下更に実施例により詳細に説明する。
実施例
まず下記組成の１〜５液を調製した。
１液 シユードモナス属菌 Pseudomonas
spOS−Ｋ−29（FERM Ｐ−7846）懸濁液 0.4
ｇcell／ml
２液 １％アルギン酸ナトリウム水溶液
３液 １％塩化カルシウム水溶液
４液 アクリルアミドモノマー重合用水溶液
アクリルアミドモノマー 20％
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド ２％
Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラミチレンジアミン
１％
５液 0.25％過硫酸アンモニア水溶液
１液及び２液各１をよく混合し、これを常法
により３液２中にベリスタポンプ及びシリコン
チユーブ（内径３×外径８mm。）を用いて滴下し
た。滴下終了して約30分後形成された粒状アルギ
ン酸カルシウム−微生物固定化物（直径３〜４
mm）２を網目１mm角ステンレス製網篭により
別して引上げ４液600ml中に浸漬した。時々撹拌
しながら20分後４液から粒状固定化物を前記網篭
によつて別し引上げた。次にこのものを５液
600ml中に静かに１分間浸漬した後５液から引上
げ約20分間放置した。こうして得られた粒状ポリ
アクリルアミド−アルギン酸カルシウム−微生物
固定化物について下記条件により測定した微生物
活性及び機械的強度は表１の通りであつた。
(a) 微生物活性は酸素消費量の測定により生菌体
を100％として示した。
(b) 反応に対する機械的強度は、合成培地
（K2HPO40.05％ｗ／ｖ、（NH4）2SO40.1％ｗ／
ｖ、MgSO40.05％ｗ／ｖ、ラセミ２，３−ジ
クロロ−１プロパノール0.2％ｖ／ｖ及び中和
剤CaCO30.1％ｗ／ｖ含有水溶液）20を50
容ジヤフアメンターに入れ、固定化物と共に反
応温度30℃、攪拌回転数300rpm、通気10／
分の反応条件で連続反応を行わせ、固定化物の
破損状況を目視観察により判定した。
比較例 １
まず下記組成の１〜７液を調製した。
１液 シユードモナス属菌 Pseudomonas
spOS−Ｋ−29（FERM Ｐ−7846）懸濁液0.4ｇ
cell／ml
６液 アクリルアミド水溶液
アクリルアミドモノマー 20％
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド ２％
７液 トルエン−クロロホルム液
トルエン−クロロホルム（１：1v／ｖ）
混合有機溶媒にＮ，Ｎ，N′，N′−テトラメチ
レンジアミン２％ｗ／ｖを添加混合したもの
１液及び６液各１をよく混合した後過硫酸ア
ンモニウム５ｇを加えたものを７液２と共によ
く攪拌させながら重合した。重合終了後得られる
ポリアクリルアミド−微生物固定化物を網目１mm
角ステンレス製金網によつて別し水でよく洗浄
した。このものについて実施例１と同様の試験を
行つた結果を表１に示した。
比較例 ２
実施例１において調製した１〜５液と同一組成
の液を調製した。
１液及び２液各１に４液600mlを添加しよく
混合したものを常法により実施例１と同様にし
て、過硫酸アンモニウム0.25％ｗ／ｖを含む３液
２混合液中に滴下した。しかしながら本菌の場
合はうまく粒状にならなかつた。
比較例 ３
実施例１において調製した１〜３液と同一組成
の液を調製した。
１液及び２液各１をよく混合し、これを常法
により実施例１と同様にして、３液２中に滴下
させた。滴下終了して約30分後形成された粒状ア
ルギン酸カルシウム−微生物固定物（直径３〜４
mm）を網目１mm角ステンレス製網篭により別
し、水でよく洗浄した。このものについて実施例
１と同様の試験を行つた結果を表１に示した。
(Field of Application) The present invention relates to entrapping immobilization of particulate microbial cells using polyacrylamide. (Prior art and problems to be solved) Generally, agar, carrageenan, calcium alginate, polyacrylamide, etc. are known as carriers for entrapping and immobilizing microorganisms for use in bioreactors. is about 40 minutes before gelling.
It is necessary to maintain the temperature above 0.degree. C., and although this is not necessary in the case of calcium alginate, there is a risk that it will dissolve in the presence of phosphate ions. In either case, since they are natural products, they are easily decomposed and have low mechanical strength. Although polyacrylamide has great mechanical strength, it is difficult to control the heat of polymerization, and the hydrophobic organic solvents used to make it into particles, such as hexane, toluene, and chloroform, are sometimes extremely harmful to immobilized microorganisms. It is known that there are cases. In order to solve these problems, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-124385
The publication discloses a method in which microorganisms, sodium alginate, and an acrylamide monomer solution are mixed and then dropped into a calcium chloride aqueous solution-polymerization initiator mixture to obtain a particulate polyacrylamide immobilized product. However, with this method, some types of microorganisms may not become granular.
Alternatively, since granulation with calcium alginate and polymerization of acrylamide proceed simultaneously, there are drawbacks such as a considerable amount of acrylamide monomer leaking to the outside until the polymerization is completed. (Object of the Invention) In view of the above points, the inventors conducted extensive studies with the aim of obtaining a microorganism immobilization method with high mechanical strength that can be applied to various microorganisms. As a result, the inventors discovered that the above object could be fully achieved by first preparing a granular calcium alginate-immobilized microorganism and then polymerizing it using a polyacrylamide polymerization system, leading to the completion of the present invention. (Structure of the Invention) The present invention involves dropping a mixed solution of microorganisms and sodium alginate into an aqueous calcium chloride solution, immersing the obtained microorganism-calcium alginate immobilized product in an aqueous solution for acrylamide monomer polymerization, and then adding a polymerization initiator. This method of immobilizing microorganisms is characterized by carrying out a polymerization operation. In the method of the present invention, first, a 0.1 to 2.0% sodium alginate aqueous solution and microorganisms to be entrappingly immobilized are thoroughly mixed, and this is dropped into a 0.5 to 2.0% calcium chloride aqueous solution in a conventional manner to form granular calcium alginate-microorganisms. Obtain the immobilized material. Next, this granular calcium alginate-microorganism immobilized product is immersed in an aqueous solution for acrylamide monomer polymerization. The acrylamide monomer polymerization aqueous solution used in the present invention is, for example, well-known:
Acrylamide monomer, N as a crosslinker,
N'-methylenebisacrylamide or N,
A polymerization initiator is obtained from an aqueous solution containing N'-propylenebisacrylamide and N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine or beta-dimethylaminopropionitrile as a polymerization accelerator, that is, a commonly used polyacrylamide polymerization system. Examples include aqueous solutions in which the When the granular immobilized product is immersed, the aqueous acrylamide monomer polymerization solution permeates the granular calcium alginate-microorganism immobilized product, replaces the water therein, and equilibrates. Then pull this thing up,
A polymerization initiator is added to this material to perform a polymerization operation. The method of addition is to spray an aqueous polymerization initiator solution, for example, an aqueous ammonium persulfate solution, or
Alternatively, the acrylamide that has penetrated into the granular calcium alginate-microorganism immobilized product is polymerized by sufficiently mixing with this aqueous solution. The granular immobilized material containing the polyacrylamide polymerization system has already been granulated with calcium alginate, and although heat is generated when acrylamide polymerizes within the granular material, there is sufficient space between the particles. is present, so the heat of polymerization can be easily dissipated. Therefore, the influence on microorganisms is suppressed to a minimum, and since the polyacrylamide can be reliably granulated, a product with high mechanical strength can be obtained. The present invention will be explained in more detail below with reference to Examples. Example First, solutions 1 to 5 having the following compositions were prepared. 1 liquid Pseudomonas
spOS-K-29 (FERM P-7846) suspension 0.4
gcell/ml 2 parts 1% sodium alginate aqueous solution 3 parts 1% calcium chloride aqueous solution 4 parts Aqueous solution for acrylamide monomer polymerization Acrylamide monomer 20% N,N'-methylenebisacrylamide 2% N,N,N',N'-tetramichi diamine
1% 5 parts 0.25% ammonia persulfate aqueous solution Mix 1 part each of 1 part and 2 parts well, and drop this into 3 part 2 using a Verista pump and a silicone tube (inner diameter 3 x outer diameter 8 mm) using the usual method. did. Approximately 30 minutes after the completion of dropping, a granular calcium alginate-microorganism immobilized product (diameter 3-4
mm) 2 was separated using a 1 mm square stainless steel mesh basket and immersed in 600 ml of the 4-pulling liquid. After 20 minutes with occasional stirring, the granular immobilized material was separated from the 4 liquids using the mesh basket and pulled up. Next, add 5 liquids of this stuff.
After being gently immersed in 600 ml of water for 1 minute, it was removed from the 5th solution and left for about 20 minutes. The microbial activity and mechanical strength of the thus obtained granular polyacrylamide-calcium alginate-microorganism immobilized product were measured under the following conditions as shown in Table 1. (a) Microbial activity was expressed based on the measurement of oxygen consumption, assuming that viable bacterial cells were 100%. (b) The mechanical strength for the reaction was determined using synthetic media (K 2 HPO 4 0.05% w/v, (NH 4 ) 2 SO 4 0.1% w/v).
v, MgSO 4 0.05% w/v, racemic 2,3-dichloro-1 propanol 0.2% v/v and neutralizing agent CaCO 3 0.1% w/v aqueous solution) 20 to 50
Place the container in a fermenter together with the immobilized material at a reaction temperature of 30°C, stirring speed of 300 rpm, and aeration of 10%.
A continuous reaction was carried out under reaction conditions for 10 minutes, and the state of damage to the immobilized product was determined by visual observation. Comparative Example 1 First, solutions 1 to 7 having the following compositions were prepared. 1 liquid Pseudomonas
spOS-K-29 (FERM P-7846) suspension 0.4g
cell/ml 6 liquids Acrylamide aqueous solution Acrylamide monomer 20% N,N'-methylenebisacrylamide 2% 7 liquids Toluene-chloroform solution Toluene-chloroform (1:1v/v) Mixed organic solvent with N,N,N',N' - Addition and mixing of 2% w/v of tetramethylenediamine After thoroughly mixing 1 each of liquid 1 and liquid 6, 5 g of ammonium persulfate was added thereto, and the mixture was polymerized with liquid 7 while stirring well. After completion of polymerization, the polyacrylamide-microorganism immobilized material was
It was separated using a square stainless steel wire mesh and thoroughly washed with water. The same tests as in Example 1 were conducted on this product, and the results are shown in Table 1. Comparative Example 2 Liquids having the same composition as Liquids 1 to 5 prepared in Example 1 were prepared. 600 ml of liquid 4 was added to each of liquid 1 and liquid 2, mixed well, and the mixture was added dropwise to a mixture of liquid 3 and liquid 2 containing 0.25% w/v of ammonium persulfate in the same manner as in Example 1 using a conventional method. However, in the case of this bacterium, it did not form into particles well. Comparative Example 3 Liquids having the same composition as Liquids 1 to 3 prepared in Example 1 were prepared. One part each of liquid 1 and liquid two were mixed well, and this was added dropwise into liquid 3 in the same manner as in Example 1 using a conventional method. Approximately 30 minutes after the completion of dropping, granular calcium alginate-microorganism immobilized matter (diameter 3-4
mm) was separated using a 1 mm square stainless steel mesh basket and thoroughly washed with water. The same tests as in Example 1 were conducted on this product, and the results are shown in Table 1.
【表】
（発明の効果）
本発明の方法により粒状アルギン酸カルシウム
−微生物固定化物にポリアクリルアミド重合操作
を施して得られる粒状ポリアクリルアミド−アル
ギン酸カルシウム−微生物固定化物の方法は、確
実に且つ固定化される微生物の活性をかなりよく
保持することが容易にでき、その粒状固定化物は
優れた機械的強度を有するものである。[Table] (Effects of the Invention) The method of the present invention can reliably and immobilize granular polyacrylamide-calcium alginate-microorganisms, which is obtained by subjecting granular calcium alginate-microorganisms immobilized material to polyacrylamide polymerization. The granular immobilized product has excellent mechanical strength.