【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
〔イ〕 発明の目的
本発明は、哺乳類及び鳥類等動物の皮膚、靭
帯、血管壁などを構成する結合組織繊維を出発原
料となし、これより、水溶性ペプチドを得て、さ
らに、これを分画して得られる、繊維芽細胞増殖
促進剤に関する。
（産業上の利用分野）
本発明による繊維芽細胞増殖促進剤（以下、こ
れを、細胞増殖物質と略記する。）は、わが国の
薬事法で定められた、医薬品、医薬部外品、化粧
品に広く利用することが出来る。その適応領域
は、内科的疾患、皮膚、口腔、眼、耳、鼻、肛
門、陰部などの潰瘍（ただれ）、外傷などである。
さらに具体的に利用分野を述べれば、例えば、
上述した各部位に用いられる、絆創膏類、ガー
ゼ、リント布、パルプ繊維（製紙類）、及び他の
繊維を用いて織布された素材に含浸させて、局所
に貼布して用いる医療用又は、化粧料やさらに点
眼点鼻などの薬剤、坐剤、及び軟膏類又は液剤な
どに配合して用いることが出来る。
又、本発明による細胞増殖物質は、皮膚及び真
皮の発育促進、皮膚の老化防止、並びに創傷治癒
促進、毛髪発育促進を目的にした、各種の薬剤又
は化粧料中に用いてもよく、さらに、内部的な疾
患としては、例えば、胃や十二指腸潰瘍に対する
治療に当つて、直接又は、他の薬剤と併用して用
いることが出来る。
すなわち、本発明による細胞増殖物質は組織の
再生修復に係わる、繊維芽細胞の活性を高める。
（従来の技術）
結合組織繊維を出発原料となし、これより各種
の抽出物を得て、化粧料等に用いることは、古く
から知られている。とくに、最近では、その水溶
性の加水分解物を用い、保湿剤として化粧料への
応用が進んでいる。
これらの加水分解物は、一般にエラスチンペプ
チドあるいは、コラーゲンペプチドと称される
が、その利用に当つては、通常は、酸、アルカ
リ、プロテアーゼなどの各種の酵素を用い、加水
分解したものが用いられてきた。そして、これら
に関する公知刊行物を調査すれば、例えば第１表
に示すものがある。
[B] Purpose of the invention The present invention uses connective tissue fibers that constitute the skin, ligaments, blood vessel walls, etc. of animals such as mammals and birds as a starting material, obtains water-soluble peptides from these fibers, and further separates them. The present invention relates to a fibroblast proliferation promoter obtained by (Field of Industrial Application) The fibroblast proliferation promoter (hereinafter abbreviated as cell proliferation substance) according to the present invention can be used in pharmaceuticals, quasi-drugs, and cosmetics as stipulated by Japan's Pharmaceutical Affairs Law. It can be used widely. The areas of application include medical diseases, ulcers (sores) of the skin, oral cavity, eyes, ears, nose, anus, genitals, etc., and trauma. If we describe the field of use more specifically, for example,
For medical use, which is used for each of the above-mentioned areas, by impregnating a woven material using adhesive plasters, gauze, lint cloth, pulp fibers (paper products), and other fibers and applying it locally. It can be used by blending it into cosmetics, medicines such as eye and nasal drops, suppositories, ointments, liquids, and the like. Furthermore, the cell proliferation substance according to the present invention may be used in various drugs or cosmetics for the purpose of promoting the growth of the skin and dermis, preventing skin aging, promoting wound healing, and promoting hair growth. As for internal diseases, for example, it can be used directly or in combination with other drugs in the treatment of gastric or duodenal ulcers. That is, the cell proliferation substance according to the present invention increases the activity of fibroblasts involved in tissue regeneration and repair. (Prior Art) It has been known for a long time to use connective tissue fibers as a starting material, from which various extracts are obtained and used in cosmetics and the like. In particular, recently, its water-soluble hydrolyzate has been increasingly used as a moisturizing agent in cosmetics. These hydrolysates are generally called elastin peptides or collagen peptides, but when they are used, they are usually hydrolyzed using various enzymes such as acids, alkalis, and proteases. It's here. If we investigate publicly known publications related to these, we will find, for example, those shown in Table 1.
【表】
そのなかで、本発明者が、目的となす細胞増殖
物質の検索を行つている過程で、前表（第１表）
中に示した、その(ホ)の特許公開公報によれば、組
織の構造蛋白を加水分解し、これより分子量が
1000〜75000の各種の蛋白ペプチドの複合物に、
細胞増殖に対する刺激作用を有することが開示さ
れるに至つた。
（発明が解決しようとする問題点）
本発明者は、第１表中に示される、それぞれの
公知な抽出条件をもとに、これらの有効利用をは
かるために、適正かつ正確な細胞増殖能を測定す
る試験法を確立する必要があつた。
すなわち、先願（特開昭59−152333号）におけ
る検索法にあつては、とくに具体的に示されてい
ないが、従来、細胞増殖能について、これを評価
する場合に、株化した細胞が用いられてきた。
本発明者は、本発明を完成するに当り、皮膚の
正常繊維芽細胞をもとにし、評価する方法を採用
（後記）した。すなわち、その試験法とは、モル
モツトの皮膚正常繊維芽細胞により行うものであ
る。つまり、この試験法を確立するに当つては、
さまざまな株細胞を用いて検討を加えたが、それ
らは、正常細胞とは異なり、生体における細胞の
機能モデルとはいいがたく、したがつて、即、治
療分野に利用出来る、最善の試験法としては、株
化されていない、正常な繊維芽細胞をもとに、こ
れに対して直接的に、増殖促進作用を有する物質
の検索が必要であつた。
そこで、実験に当つては、公知なあらゆる方法
で得られた結合組織繊維の加水分解物（水溶性の
エラスチンペプチドやコラーゲンペプチド、及び
両方が混在するペプチドなど）をもとに、逐次、
分画処理を進めながら、その作用の著しい物質を
求める方法を取つた。その結果、これらの水溶性
ペプチドは、第３図に示すごとく、繊維芽細胞に
対する増殖促進作用を示す成分は、10000以上の
分子量には、ほとんど含まれていないことがわか
つた。さらに又、分子量1000以下の成分にはまつ
たく作用は無いことがわかつた。同時に、分子量
が1000以下の成分にあつては、その高濃度投与
は、細胞に対して毒性作用を示すことがわかつ
た。又、分子量5000以下の成分にほとんど増殖促
進作用が見られないこともわかつた（第３図）。
このことから、結合組織繊維の加水分解物（エ
ラスチン、コラーゲン、又は、その両方を含む水
溶性のペプチドなど）中の細胞増殖物質は、分子
量が5000〜10000の範囲の間にあることがわかつ
た。
一方、この細胞増殖物質の作用の程度につい
て、既知の繊維芽細胞成長因子（FGF：フイブ
ログラスト グロス フアクター）と比較してみ
れば、その作用は、FGFが極めて微量のｎｇ単
位から作用を示すのに対し、本試験で求められ
た、細胞増殖物質はFGFと同様の細胞増殖能を
達成するには、FGFの104〜5倍程度が必要であり、
又、最大投与量における作用の程度は、FGFと
比べて、緩和なものであることがわかつた（第２
〜３図）。したがつて、このことから、本物質と
FGFの作用機序とは、異なつたものと推定され
る。そして目的とする物質を得るに当つては、前
述した5000〜10000の範囲の分子量から、これを
さらに分画して、単一なペプチドとなしても、そ
の活性が向上しないことから、最終的には、作用
ペプチドは複数であることを意味しており、結合
組織繊維からの加水分解して得られた水溶性ペプ
チドの本質は、その開発に当つて目的を達成する
上で、最善の手段が、分子量5000〜10000の間に
ある分画処理物を用いることが良いことがわかつ
た。
（細胞増殖促進作用の測定に関する注解）
細胞増殖促進作用を表現する方法は、今日一般
に知られている成長因子でも、的確に効力を表現
する方法はない。細胞毒性を表現する方法として
は、さまざまな方法が示され、増殖率の抑制とし
て、細胞数、蛋白量等で定量的に示される。そこ
で本発明者らは、この細胞毒性試験と逆に増殖率
の促進能について、定量的に表現する方法を鋭意
検討した結果、目的物質を加えない対照群の細胞
増殖率をゼロ近くに抑制する事により、目的物質
の細胞増殖作用を、定量的に表現する方法を開発
した。この方法をより具体的に示せば、培養液に
加える血清の量を調節する事により行う方法であ
る。
つまり、本試験法を確立するに当つては、さま
ざまの株細胞で検討してきたが、それらは正常細
胞とは異なり、生体での細胞の機能のモデルとは
いいがたいことから、ここでは、正常組織から取
り出した、初代細胞で検索することとした。すな
わち、モルモツトの皮膚から無菌的に細胞を分離
し、一定期間継代した変異していない細胞を対象
として、目的物質の細胞増殖度を表現する事とし
た。たとえばモルモツト（ハートレー系、雌）か
ら採取した繊維芽細胞は、５％牛胎児血清
（FBS）を添加したイーグルのMEM培地中で盛
んに分裂増殖し、その倍数増殖時間は、「第１図」
に示す様に、約48時間であり、採取後、約１年で
株化した。
そこで本発明の目的物質の細胞増殖率表現のた
めには、出来るだけ正常に近い細胞という条件か
ら、採取後６ケ月までに増殖継代した細胞を凍結
保存する事により、目的物質の分離の為に使用し
た。
この方法は、まず、直径3.5cmのペトリデイシ
ユ（コーニング社製）に、１mlの培養液あたり４
〜５×104個の細胞を植え、低濃度のFBSを加え
たイーグルのMEM培地を、２〜３日目ごとに交
換する。細胞数は、２〜３日目ごとにビユルケル
チユルクの血球計算盤を用いて測定する。尚、こ
の際同時に蛋白量、核酸量を測定しても良い。目
的物質は生理食塩水にて調製し、培地あたり10分
の１の量を、培地交換の都度添加し、対照には同
量の生理食塩水のみ添加する。
〔ロ〕 発明の構成
本発明は、結合組織繊維の加水分離物中から分
離（抽出）した、水溶性ペプチドの分子量の範囲
が5000〜10000のものを、繊維芽細胞増殖促進剤
となすことから構成される。又、その基本的な条
件及び操作における要旨は、次のＡ〜Ｂで示すご
とくであるが、さらに具体的には、実施例により
以下に詳記する。
(A) 抽出における出発原料、すなわち、結合組織
繊維は、エラスチン、コラーゲン等を含む哺乳
動物及び鳥類などの皮膚、靭帯、血管壁などで
ある。
(B) 実施例では、特定した抽出分離の条件下で、
もつとも簡易な方法を示すも、その抽出法とし
ては、従来から知られている塩析分離、有機溶
媒沈殿、透析、限外濾過、ゲル濾過、及び、イ
オンクロマト等々の、さまざまな蛋白質の抽出
法の組合わせにより得ることが出来る。
実施例 １
水に可溶な結合組織繊維加水分解物は、公知の
方法によつて得ることが出来る。例えば、新鮮な
哺乳動物及び鳥類の凍結靭帯、あるいはそれらの
皮膚又は血管壁10Kgを細砕し、精製水50を加え
る。これを希水酸化ナトリウム溶液でアルカリ処
理した後、希硫酸溶液を加えて酸処理をした後、
中和し、ブレンダーにて撹拌し、蛋白分解酵素
（プロナーゼ、エラスターゼ、コラゲナーゼ等）
を加えて部分的に加水分解した後、煮沸して酵素
を失活させ、濾過して水に可溶な結合組織繊維加
水分解物を得る。この水溶液を限外濾過膜（分画
分子量10000、ミリボア製）で濾過し、通過した
溶液（分子量10000以下）をさらに限外濾過膜
（分画分子量5000又は1000）で濾過し、通過しな
い濃縮部（分子量5000又は1000以上）を0.22μｍ
のフイルター（ミリボア製）で濾過した後、得ら
れた液、又は、得られた液を凍結乾燥して粉末と
なす。
実施例 ２
実施例−１と同様に、酸処理、アルカリ処理、
さらに酵素分解処理によつて、水に可溶な結合組
織繊維加水分解物を得たのち、これに精製水を２
倍量加えて、限外濾過膜（分画分子量10000）で
濾過し、通過した溶液をゲル濾過する。用いる担
体としては、セフアデツクス、アガロース、セフ
アクリル等があげられるが、たとえばセフアデツ
クスＧ−50で分画して、分子量範囲5000〜10000
の分画を採取し、0.22μｍのフイルターにて無菌
濾過した後、凍結乾燥して100〜160ｇの粉末を得
る。
〔ハ〕 発明の効果
本発明による、結合組織繊維からの加水分解物
からの抽出分画物は、前記したごとくの、正常細
胞による繊維芽細胞増殖促進作用が明らかであ
り、細胞毒性を示さない。すなわち、本発明者ら
が研究（検索）中の過程で、例えば、特開昭59−
152333号に示された、細胞増殖刺激作用物質が見
出されているが、これらは、その分子量が1000〜
75000の範囲を規定し、その範囲内にあるすべて
のものが、細胞増殖刺激作用を有するごとく報告
されている。しかし、本発明者が新しく開発し
た、前記した試験法によつて、検索（追試）した
結果は、分子量1000以下の成分には、細胞毒性の
発現、さらに、10000以上の成分には、ほとんど
目的となす細胞増殖作用もないことがわかつた。
つまり、従来から知られている、加水分解してな
る水溶性のエラスチンや、コラーゲン由来のペプ
チドには、保湿剤としての機能はあつても、本発
明が目的となす、細胞増殖物質ではないことがわ
かつたのである。
このことは、これらの抽出物の医薬及び化粧品
類への応用に当つては、最も重要となる。すなわ
ち、第１に安全性の確保が充分に配慮されている
ことが、医薬及び化粧料への配合に当つては、何
よりも大切な要件であり、正常細胞に対して、毒
性を示す様では、それは本発明の目的とする用途
としては不適格となるからである。
本発明による細胞増殖物質は、その安全性から
も優れたものであり、又、外傷損傷部位に対する
作用は、本発明によるごとく、分子量が5000〜
10000の範囲の成分に活性があることから、これ
を用いることは、損傷部の治癒効果を高めるのに
最善である。尚、外用塗布剤（料）を目的となす
場合では、その用いる量を、細胞増殖作用の程度
から求めるときは、粉末換算で0.1％前後が適量
と推定出来る。
次に、二〜三の皮膚塗擦料を製し、その処方を
示す。
処方例 １
クリーム
本発明の物質 ……0.1ｇ
ステアリン酸 ……14.0
ワセリン ……2.0
モノステアリン酸グリセリン ……2.5
ポリオキシエチレンソルビタンモノステアリン酸
エステル ……1.5
香料・防腐剤 ……適量
プロピレングリコール ……10.0
水にて ……100とする。
処方例 ２
乳液
本発明の物質 ……0.1ｇ
ステアリン酸 ……2.0
セタノール ……1.5
ワセリン ……3.0
ラノリンアルコール ……2.0
流動パラフイン ……10.0
ポリオキシエチレンモノオレイン酸エステル（10
E.O.） ……2.0ｇ
香料・防腐剤 ……適量
グリセリン ……3.0
プロピレングリコール ……5.0
水にて ……100とする。
処方例 ３
ローシヨン（毛髪用又は肌用）
本発明の物質 ……0.1ｇ
95°アルコール ……20.0
プロピレングリコール ……3.0
香料・防腐剤 ……適量
水にて ……100とする。
処方例 ４
被覆保護剤
ガーゼ又はリント布や、コラーゲン不織布に、
処方例１〜３を塗布、又は、本発明の物質を適当
量含浸させ、必要により、抗生物質、副腎皮質ホ
ルモン剤、その他、抗炎症剤などとの処方を組
み、外傷部などに貼布する剤となす。（本発明物
質を直接、局所損傷部に散布し、ガーゼ等で被覆
する剤となしても良い。）
上記した処方例によるものは、外用塗布を主体
として用いる際の、一つの形態を示したものであ
るが、外傷（切傷）、火傷などにおいて、皮膚組
織の再生修復作用を早める。又、外傷のない肌に
対しては、荒れ症肌に有効であり、肌の老化を防
ぎ、小じわの防止に役立つ。
ただし、本発明による細胞増殖物質は、これを
従来の結合組織繊維から、加水分解して得られ
た、水溶性のペプチドなど（例えば、第１表中に
示すごとくの、広い範囲にわたる分子量分布をも
つた抽出物）と対比するとき、肌に対する保湿性
又は湿潤性効果は、公知な従来の抽出物の方が高
くこの点では劣る。
しかし、細胞増殖促進作用については、第１表
中に示すごとくの抽出物が、ゼロ又は、ごく弱い
作用しかないのに対して、本発明による抽出物で
は、第２〜３図に示すごとく、活性が高いことで
ある。[Table] In the process of searching for the desired cell growth substance, the inventors discovered the above table (Table 1).
According to the patent publication (e) shown in the figure, the structural protein of the tissue is hydrolyzed, and the molecular weight is lowered from this.
A complex of 1000 to 75000 various protein peptides,
It has now been disclosed that it has a stimulatory effect on cell proliferation. (Problems to be Solved by the Invention) Based on the known extraction conditions shown in Table 1, the present inventor has determined the appropriate and accurate cell proliferation ability in order to effectively utilize them. It was necessary to establish a test method to measure In other words, although the search method in the earlier application (Japanese Unexamined Patent Publication No. 152333/1983) is not specifically stated, conventionally, when evaluating cell proliferation ability, it is necessary to has been used. In completing the present invention, the present inventor adopted an evaluation method based on normal skin fibroblasts (described later). That is, the test method is performed using normal guinea pig skin fibroblasts. In other words, in establishing this test method,
We have conducted studies using various cell lines, but these are different from normal cells and cannot be said to be functional models of living cells. Therefore, it was necessary to search for a substance that has a direct proliferation-promoting effect on normal fibroblast cells, which have not yet been established. Therefore, in the experiment, based on hydrolysates of connective tissue fibers (water-soluble elastin peptides, collagen peptides, peptides containing both, etc.) obtained by all known methods,
While proceeding with the fractionation process, we adopted a method of searching for substances with significant effects. As a result, as shown in FIG. 3, it was found that these water-soluble peptides contained almost no component exhibiting a proliferation-promoting effect on fibroblasts with a molecular weight of 10,000 or more. Furthermore, it was found that components with a molecular weight of 1000 or less had no eye-catching effect. At the same time, it was found that when components with a molecular weight of 1000 or less are administered at high concentrations, they exhibit toxic effects on cells. It was also found that components with a molecular weight of 5000 or less had almost no growth-promoting effect (Figure 3). From this, it was found that the cell growth substances in the hydrolyzate of connective tissue fibers (such as water-soluble peptides containing elastin, collagen, or both) have molecular weights in the range of 5,000 to 10,000. . On the other hand, when comparing the degree of action of this cell growth substance with the known fibroblast growth factor (FGF), it is found that FGF has an effect from an extremely small amount of ng. On the other hand, the cell growth substance found in this test requires about 104 to 5 times the amount of FGF to achieve the same cell growth ability as FGF.
In addition, the degree of effect at the maximum dose was found to be milder than that of FGF (Second
~Figure 3). Therefore, from this, this substance and
The mechanism of action is presumed to be different from that of FGF. In order to obtain the target substance, even if it is further fractionated into a single peptide from the molecular weight range of 5,000 to 10,000 as mentioned above, its activity will not improve, so the final This means that there are multiple active peptides, and the essence of water-soluble peptides obtained by hydrolysis from connective tissue fibers is the best means to achieve the purpose when developing them. However, it was found that it is better to use a fractionated product with a molecular weight between 5,000 and 10,000. (Comments regarding measurement of cell proliferation-promoting effect) There is no method to accurately express cell proliferation-promoting effect, even for growth factors that are generally known today. Various methods have been shown to express cytotoxicity, and inhibition of proliferation rate is quantitatively expressed by cell number, protein amount, etc. Therefore, as a result of intensive study on a method to quantitatively express the ability to promote proliferation rate in contrast to this cytotoxicity test, the present inventors found that the cell proliferation rate in the control group to which no target substance was added was suppressed to near zero. As a result, we developed a method to quantitatively express the cell proliferation effect of target substances. More specifically, this method is carried out by adjusting the amount of serum added to the culture solution. In other words, in establishing this test method, we have investigated various cell lines, but these are different from normal cells and cannot be said to be models of cell function in the living body, so we will discuss them here. We decided to search using primary cells taken from normal tissues. That is, cells were aseptically isolated from the skin of guinea pigs, and unmutated cells that had been subcultured for a certain period of time were used to express the degree of cell proliferation of the target substance. For example, fibroblasts collected from guinea pigs (Hartley strain, female) actively divide and proliferate in Eagle's MEM medium supplemented with 5% fetal bovine serum (FBS), and the multiplication time is shown in Figure 1.
As shown in Figure 2, it took about 48 hours, and the strain was established in about one year after collection. Therefore, in order to express the cell proliferation rate of the target substance of the present invention, in order to isolate the target substance, it is necessary to cryopreserve cells that have been expanded and subcultured up to 6 months after collection, in order to obtain cells that are as close to normal as possible. used for. In this method, first, 4 mL of culture solution per 1 ml of culture solution was placed in a Petri dish (manufactured by Corning) with a diameter of 3.5 cm.
~5 x 104 cells are plated and Eagle's MEM medium supplemented with low concentration of FBS is changed every 2-3 days. Cell counts are determined every 2-3 days using a Bjürkercijürk hemocytometer. Incidentally, at this time, the amount of protein and the amount of nucleic acid may be measured at the same time. The target substance is prepared in physiological saline, and 1/10th the amount per medium is added each time the medium is replaced, and only the same amount of physiological saline is added to the control. [B] Structure of the Invention The present invention uses a water-soluble peptide with a molecular weight range of 5,000 to 10,000, which is separated (extracted) from a hydrolyzed isolate of connective tissue fibers, as a fibroblast proliferation promoter. configured. Further, the basic conditions and operations are as shown in the following A to B, and more specifically, they will be described in detail below using Examples. (A) The starting materials in the extraction, ie, connective tissue fibers, are the skin of mammals and birds, ligaments, blood vessel walls, etc., including elastin, collagen, etc. (B) In the examples, under the specified extraction separation conditions,
Although this is a very simple method, various protein extraction methods such as conventionally known salting-out separation, organic solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and ion chromatography can be used. can be obtained by a combination of Example 1 A water-soluble connective tissue fiber hydrolyzate can be obtained by a known method. For example, 10 Kg of fresh frozen mammalian and avian ligaments, or their skin or blood vessel walls, are crushed and 50 kg of purified water is added. After alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution and acid treatment with dilute sulfuric acid solution,
Neutralize, stir in a blender, and remove proteolytic enzymes (pronase, elastase, collagenase, etc.)
is added for partial hydrolysis, then boiled to inactivate the enzyme, and filtered to obtain a water-soluble connective tissue fiber hydrolyzate. This aqueous solution is filtered through an ultrafiltration membrane (molecular weight cutoff 10000, manufactured by Millibore), and the solution that passes through (molecular weight 10000 or less) is further filtered through an ultrafiltration membrane (molecular weight cutoff 5000 or 1000), and the concentration section that does not pass through is filtered. (molecular weight 5000 or 1000 or more) to 0.22μm
After filtering with a filter (manufactured by Millibore), the obtained liquid or the obtained liquid is freeze-dried to form a powder. Example 2 Similar to Example-1, acid treatment, alkali treatment,
Furthermore, after obtaining a water-soluble connective tissue fiber hydrolyzate by enzymatic decomposition treatment, purified water was added to it for 2 hours.
Add double the amount, filter through an ultrafiltration membrane (molecular weight cut off 10,000), and gel-filtrate the solution that passes through. Examples of carriers used include Cephadex, agarose, and Cephacryl.
A fraction is collected, sterile filtered through a 0.22 μm filter, and then freeze-dried to obtain 100 to 160 g of powder. [C] Effects of the invention The fraction extracted from the hydrolyzate from connective tissue fibers according to the present invention has a clear effect of promoting fibroblast proliferation by normal cells as described above, and does not exhibit cytotoxicity. . That is, in the process of research (search) by the present inventors, for example,
No. 152333, cell proliferation-stimulating substances have been discovered, but these have molecular weights of 1000 to 1000.
75,000, and everything within that range has been reported to have cell growth-stimulating effects. However, the results of a search (additional test) using the above-mentioned test method newly developed by the present inventors revealed that components with a molecular weight of 1,000 or less exhibit cytotoxicity, and that components with a molecular weight of 10,000 or more have almost no purpose. It was found that there was no cell proliferation effect.
In other words, although the conventionally known water-soluble elastin produced by hydrolysis and collagen-derived peptides have a function as a moisturizing agent, they are not cell growth substances, which is the purpose of the present invention. I realized that. This is of utmost importance when applying these extracts to medicines and cosmetics. In other words, first and foremost, ensuring safety is the most important requirement when incorporating into pharmaceuticals and cosmetics, and ensuring that the product does not exhibit toxicity to normal cells. , because it would be unsuitable for the intended use of the present invention. The cell proliferation substance according to the present invention is excellent in terms of its safety, and its action on trauma-damaged areas is as follows:
With active ingredients in the range of 10,000, its use is best to enhance the healing effect of the injured area. In addition, when it is intended as an external liniment, the appropriate amount can be estimated to be around 0.1% in terms of powder when determining the amount to be used based on the degree of cell proliferation effect. Next, a few skin rubs will be made and their formulations will be given. Formulation example 1 Cream Substances of the present invention...0.1g Stearic acid...14.0 Vaseline...2.0 Glyceryl monostearate...2.5 Polyoxyethylene sorbitan monostearate...1.5 Flavoring/preservatives...Appropriate amount of propylene glycol... 10.0 With water ……100. Formulation example 2 Emulsion Substances of the present invention ……0.1g Stearic acid ……2.0 Cetol ……1.5 Vaseline ……3.0 Lanolin alcohol ……2.0 Liquid paraffin ……10.0 Polyoxyethylene monooleate (10
EO)...2.0g Flavoring/preservative...Appropriate amount of glycerin...3.0 Propylene glycol...5.0 With water...100. Prescription Example 3 Lotion (for hair or skin) Substance of the present invention...0.1g 95° alcohol...20.0 Propylene glycol...3.0 Flavor/preservative...Add appropriate amount of water to 100. Prescription example 4 Covering and protecting agent For gauze or lint cloth, collagen nonwoven fabric,
Apply Prescription Examples 1 to 3 or impregnate with an appropriate amount of the substance of the present invention, combine with antibiotics, adrenal corticosteroids, other anti-inflammatory agents, etc. as necessary, and apply to the injured area etc. Agent and eggplant. (The substance of the present invention may be applied directly to a locally damaged area and covered with gauze, etc.) The above prescription example represents one form when used mainly for external application. However, it accelerates the regeneration and repair action of skin tissue in cases of trauma (cuts), burns, etc. In addition, it is effective for rough skin, prevents skin aging, and helps prevent fine wrinkles on skin without trauma. However, the cell growth substance according to the present invention is a water-soluble peptide obtained by hydrolyzing conventional connective tissue fibers (for example, as shown in Table 1, it has a molecular weight distribution over a wide range). When compared to Motta extract), the moisturizing or moisturizing effect on the skin is higher with known conventional extracts, which are inferior in this respect. However, in terms of cell proliferation promoting action, the extracts shown in Table 1 have no or very weak action, whereas the extracts according to the present invention have no or very weak action, as shown in Figures 2 and 3. It has high activity.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
第１図は、本発明において用いた細胞の増殖曲
線である。第２図は、結合組織繊維加水分解物を
培地あたり1.0mg／ml添加したものイ、及び0.1
mg／ml添加したものロの細胞増殖曲線を示す。
尚、ハは対照群（生理食塩水添加群）の増殖曲線
である。第３図は本発明の繊維芽細胞増殖促進剤
を培地あたり0.5mg／ml添加したものａ、結合組
織繊維加水分解物の分子量10000以上のフラクシ
ヨンを、培地あたり0.5mg／ml添加したものｂ、
及び分子量5000以下のフラクシヨンを、培地あた
り0.5mg／ml添加したものｃの細胞増殖曲線であ
る。尚、ｄは対照群を示す。第４図は本発明の繊
維芽細胞増殖促進剤のセフアデツクスＧ−50によ
る溶出曲線である。
FIG. 1 is a growth curve of cells used in the present invention. Figure 2 shows 1.0 mg/ml of connective tissue fiber hydrolyzate per medium, and 0.1
The cell growth curve of the cell added with mg/ml is shown.
In addition, C is the growth curve of the control group (physiological saline addition group). Figure 3 shows a case in which the fibroblast proliferation promoter of the present invention was added at 0.5 mg/ml per medium, b, a case in which a fraction of connective tissue fiber hydrolyzate with a molecular weight of 10,000 or more was added at 0.5 mg/ml per medium,
This is the cell growth curve of c, which contains a fraction with a molecular weight of 5000 or less added at 0.5 mg/ml per medium. Note that d indicates a control group. FIG. 4 is an elution curve of the fibroblast proliferation promoter of the present invention using Cephadex G-50.