JPH042600B2 - - Google Patents
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- JPH042600B2 JPH042600B2 JP63054436A JP5443688A JPH042600B2 JP H042600 B2 JPH042600 B2 JP H042600B2 JP 63054436 A JP63054436 A JP 63054436A JP 5443688 A JP5443688 A JP 5443688A JP H042600 B2 JPH042600 B2 JP H042600B2
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- JP
- Japan
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- amylase
- inhibitor
- streptomyces
- derived
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、ストレプトマイセス
（Streptomyces）属菌から得られる新規アミラー
ゼ阻害物質Ｔ−76およびその製造方法に関する。 （従来の技術） アミラーゼ阻害物質に関する研究は古くから行
われており、植物、微生物などに由来するペプチ
ド系およびオリゴ糖系のいくつかのアミラーゼ阻
害物質が知られている。 植物由来のアミラーゼ阻害物質としては、小麦
から得られた耐熱性の塩基性タンパクが特に有名
である。微生物由来のアミラーゼ阻害物質として
は、上田らのペプチド様物質（Agric.Biol.
Chem.、37、2025（1973））、村尾らのHaim
（Agric.Biol.Chem.、44、1679（1980））および
Paim（Agric.Biol.Chem.、47、453（1983））、後藤
らのＸ−２（特公昭第54−11395号公報）、原田ら
のAI−Ｂ（特公昭第59−10193号公報）、宮川らの
Ｉ−1001C（特開昭第61−74587号公報）、フオル
カー エーデイングら（特公昭第62−36040号公
報）どのに記載のペプチド系の阻害物質が知られ
ている。 アミラーゼ阻害物質を投与することにより、例
えば、消化器官、口腔などの体内においてアミラ
ーゼ活性が阻害される。そのため、高脂肪症、糖
尿病などの治療薬として、または虫歯の予防薬と
して効果的に用いられ得る。臨床診断のための各
種分析用試薬としても有用である。例えば、ヒト
血液中または尿中の体液成分は、通常、微生物由
来のアミアーゼを用いて測定されるか、このとき
に、該体液にはじめから含有されているヒト由来
のアミラーゼが働き測定結果に正の誤差を与え
る。そのため、このヒト由来のアミラーゼ目的活
性を阻害してそのような誤差を与えないようにす
るために用いられる。このようなに用いられるア
ミラーゼ阻害物質は、ヒトその他の高等動物由来
のアミラーゼを選択的に失活させ、細菌由来およ
びカビ由来のアミラーゼを失活させない阻害物質
である。 従来知られている阻害物質のうち、ヒトその他
の高等動物由来のアミラーゼを選択的に失活さ
せ、細菌由来およびカビ由来のアミラーゼを失活
させない阻害物質は、村尾ら（前出）、後藤ら
（前出）、宮川ら（前出）およびフオルカー エー
デイングら（前出）のアミラーゼ阻害物質だけで
ある。しかし、村尾ら（前出）および後藤ら（前
出）の阻害物質は微生物による生産性が低く、実
用的ではない。宮川ら（前出）は阻害物質を高率
で生産するストレプトマイセス属菌も見いだし、
アミラーゼ阻害物質Ｉ−1001Cを提供している
が、この阻害物質は、ペプシン、トリプシン、α
−キモトリプシン、サーモライシン、パパインお
よびフイシンのいずれのプロテアーゼによつても
不活化される。これに対して、フオルカー エー
デイングら（前出）のアミラーゼ阻害物質は比較
的プロテアーゼの作用を受けにくいが、やはり
徐々にタンパク分解により不活性化される。 このように、既知のアミラーゼ阻害物質は、そ
の生産性および安定性の点に問題がある。所望の
作用特異性を有し、広い温度範囲およびPH範囲に
おいて作用しかつ安定であり、そして、プロチア
ーゼにより不活化されないため種々の予防薬また
は分析用に用いられ得るアミラーゼ阻害物質、お
よび該阻害物質を効果的に製造する方法の開発が
期待されている。 （発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり
その目的とするところは、高等動物由来のアミラ
ーゼを選択的に失活させ、かつ細菌由来のアミラ
ーゼを失活させないという作用特異性を有し、広
い温度範囲およびPH範囲において作用しかつ安定
であり、そして各種プロテアーゼにより不活性化
されないアミラーゼ阻害物質を提供することにあ
る。本発明のその他の目的は、上記優れたアミラ
ーゼ阻害物質を効果的に製造する方法を提供する
ことにある。 （課題を解決するための手段） 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76は次の性質
を有する。 作用：ヒト膵臓アミラーゼ、、ヒト唾液アミ
ラーゼ、およびブタ膵臓アミラーゼを阻害し；
バチルス属菌由来のα−アミラーゼ、ダイズの
β−アミラーゼ、大麦のβ−アミラーゼ、リゾ
プス属菌由来のグルコアミラーゼ、シユウドモ
ナス属菌由来のイソアミラーゼ、ペプシン、ト
リプシンおよびα−キモトリプシンを阻害しな
い、 安定PH範囲および熱安定性：PH３〜12で30℃
において24時間にわたり安定であり、PH３〜９
で100℃において15分間にわたり安定である、 分子量：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量は約8000である、 等電点：アンフオラインを担体として用いた
等電点は3.8である、 紫外線吸収スペクトル：極大吸収は278nｍ
であり、極小吸収は250nｍである、 次のアミノ酸組成を有する：
（Streptomyces）属菌から得られる新規アミラー
ゼ阻害物質Ｔ−76およびその製造方法に関する。 （従来の技術） アミラーゼ阻害物質に関する研究は古くから行
われており、植物、微生物などに由来するペプチ
ド系およびオリゴ糖系のいくつかのアミラーゼ阻
害物質が知られている。 植物由来のアミラーゼ阻害物質としては、小麦
から得られた耐熱性の塩基性タンパクが特に有名
である。微生物由来のアミラーゼ阻害物質として
は、上田らのペプチド様物質（Agric.Biol.
Chem.、37、2025（1973））、村尾らのHaim
（Agric.Biol.Chem.、44、1679（1980））および
Paim（Agric.Biol.Chem.、47、453（1983））、後藤
らのＸ−２（特公昭第54−11395号公報）、原田ら
のAI−Ｂ（特公昭第59−10193号公報）、宮川らの
Ｉ−1001C（特開昭第61−74587号公報）、フオル
カー エーデイングら（特公昭第62−36040号公
報）どのに記載のペプチド系の阻害物質が知られ
ている。 アミラーゼ阻害物質を投与することにより、例
えば、消化器官、口腔などの体内においてアミラ
ーゼ活性が阻害される。そのため、高脂肪症、糖
尿病などの治療薬として、または虫歯の予防薬と
して効果的に用いられ得る。臨床診断のための各
種分析用試薬としても有用である。例えば、ヒト
血液中または尿中の体液成分は、通常、微生物由
来のアミアーゼを用いて測定されるか、このとき
に、該体液にはじめから含有されているヒト由来
のアミラーゼが働き測定結果に正の誤差を与え
る。そのため、このヒト由来のアミラーゼ目的活
性を阻害してそのような誤差を与えないようにす
るために用いられる。このようなに用いられるア
ミラーゼ阻害物質は、ヒトその他の高等動物由来
のアミラーゼを選択的に失活させ、細菌由来およ
びカビ由来のアミラーゼを失活させない阻害物質
である。 従来知られている阻害物質のうち、ヒトその他
の高等動物由来のアミラーゼを選択的に失活さ
せ、細菌由来およびカビ由来のアミラーゼを失活
させない阻害物質は、村尾ら（前出）、後藤ら
（前出）、宮川ら（前出）およびフオルカー エー
デイングら（前出）のアミラーゼ阻害物質だけで
ある。しかし、村尾ら（前出）および後藤ら（前
出）の阻害物質は微生物による生産性が低く、実
用的ではない。宮川ら（前出）は阻害物質を高率
で生産するストレプトマイセス属菌も見いだし、
アミラーゼ阻害物質Ｉ−1001Cを提供している
が、この阻害物質は、ペプシン、トリプシン、α
−キモトリプシン、サーモライシン、パパインお
よびフイシンのいずれのプロテアーゼによつても
不活化される。これに対して、フオルカー エー
デイングら（前出）のアミラーゼ阻害物質は比較
的プロテアーゼの作用を受けにくいが、やはり
徐々にタンパク分解により不活性化される。 このように、既知のアミラーゼ阻害物質は、そ
の生産性および安定性の点に問題がある。所望の
作用特異性を有し、広い温度範囲およびPH範囲に
おいて作用しかつ安定であり、そして、プロチア
ーゼにより不活化されないため種々の予防薬また
は分析用に用いられ得るアミラーゼ阻害物質、お
よび該阻害物質を効果的に製造する方法の開発が
期待されている。 （発明が解決しようとする課題） 本発明は上記従来の課題を解決するものであり
その目的とするところは、高等動物由来のアミラ
ーゼを選択的に失活させ、かつ細菌由来のアミラ
ーゼを失活させないという作用特異性を有し、広
い温度範囲およびPH範囲において作用しかつ安定
であり、そして各種プロテアーゼにより不活性化
されないアミラーゼ阻害物質を提供することにあ
る。本発明のその他の目的は、上記優れたアミラ
ーゼ阻害物質を効果的に製造する方法を提供する
ことにある。 （課題を解決するための手段） 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76は次の性質
を有する。 作用：ヒト膵臓アミラーゼ、、ヒト唾液アミ
ラーゼ、およびブタ膵臓アミラーゼを阻害し；
バチルス属菌由来のα−アミラーゼ、ダイズの
β−アミラーゼ、大麦のβ−アミラーゼ、リゾ
プス属菌由来のグルコアミラーゼ、シユウドモ
ナス属菌由来のイソアミラーゼ、ペプシン、ト
リプシンおよびα−キモトリプシンを阻害しな
い、 安定PH範囲および熱安定性：PH３〜12で30℃
において24時間にわたり安定であり、PH３〜９
で100℃において15分間にわたり安定である、 分子量：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量は約8000である、 等電点：アンフオラインを担体として用いた
等電点は3.8である、 紫外線吸収スペクトル：極大吸収は278nｍ
であり、極小吸収は250nｍである、 次のアミノ酸組成を有する：
【表】
【表】
本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76の製造方法
は、上記阻害物質を生産しうるストレプトマイセ
ス（Streptomyces）属に属する微生物を培養す
る工程、および得られる培養物から該阻害物質を
採取する工程を包含し、そとにより上記目的が達
成される。 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76は、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属菌、特にスト
レプトマイセス ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）Ｔ−76株（微工
研菌寄第9882号；FERMP−9882）により生産さ
れる。この菌株は、発明者らにより土壌から分離
された新菌株である。 この菌株の菌学的性質を以下に示す。培養温度
は特に記載のない限り30℃である。 １ 形態 胞子形成菌糸の分枝は直状また曲状の単純分
枝であり、10胞子以上連鎖した胞子を形成す
る。胞子表面は滑面であり、胞子の大きさは
（0.6〜0.8）×（0.7〜1.0）μｍであり、鞭毛胞子
および胞子嚢の形成は見られない。 ２ 各種培地での生育状況 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地 発育：不良、無色 気菌糸：豊富、灰色 可溶性色素：認められず (2) グルコース・アスパラギン寒天培地 発育：不良、オレンジイエローから灰色がか
つた黄色 気菌糸：豊富、白から灰色がかつた白色 可溶性色素：認められず (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地 発育：不良、濃いオレンジイエロー 気菌糸：豊富、灰色 可溶性色素：認められず (4) スターチ・無機塩寒天培地 発育：不良、濃いオレンジイエローからブラ
ウン 気菌糸：豊富、明るい灰色 可溶性色素：認められず (5) チロシン寒天培地 発育：不良、ブラウン 気菌糸：厚い、明るい灰色 可溶性色素：認められず (6) 栄養寒天培地 発育：不良、灰色がかつた黄色 気菌糸：豊富、白色 可溶性色素：認められず (7) イースト・麦芽寒天培地 発育：良好、オレンジイエロー 気菌糸：わずか、白色、しわがある 可溶性色素：認められず (8) オートミール寒天培地 発育：良好、オレンジイエローからブラウン 気菌糸：豊富、白色から灰色 可溶性色素：認められず ３ 生理学的性質 (1) 生育温度範囲：16℃〜40℃で生育し、至適
生育温度は30℃付近である。 (2) ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプ
トン・ゼラチン培地および単純ゼラチン培
地） (3) スターチの加水分解：陽性（スターチ寒天
培地） (4) 脱脂牛乳の凝固：陰性 (5) 脱脂牛乳のペプトン化：陽性 (6) メラニン様色素の生成：陰性（ペプトン・
イースト・鉄寒天培地、トリプトン・イース
トブロス寒天培地、およびチロシン寒天培
地） (7) 硝酸塩の還元：陽性 ４ 炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラ
ビノース、およびＤ−マンノースをよく利用
し；Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−
ガラクトース、およびサリシンをわずかに利用
し；ラフイノース、Ｄ−マンニトール、イノシ
トール、およびシユークロースを利用しない。 菌株の同定 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76を生産する
菌株を、上記菌学的諸性質をもとにバージエイズ
マニユアル オブ デイタミネイテイブ バクテ
リオロジー第８版（1974）〔Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology、8th、Edd.
（1974）〕；インターナシヨナル ストレプトマイ
セス プロジエクト〔International
Strepomyces Project（ISP）〕の報告〔インター
ナシヨナル ジヤーナル オブ システマテイツ
ク バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻69−189頁
（1968）、同第18巻279−392頁（1968）、同第19巻
391−512頁（1969）および同第22巻265−394頁
（1972）〕；およびワクスマン（Waksman）著
“アクチノマイセス（The Actinomycetes）”第
２巻に基づいて比較すると、本菌株は、下記の点
を除きストレプトマイセス ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）に一致する：ス
トレプトマイセス ニトロスポレウスは(1)脱脂牛
乳を凝固させること、(2)Ｌ−ラムノースを良好に
同化すること、および(3)Ｄ−フラクトースを同化
しないこと。しかし、その他の点ではストレプト
マイセス ニトロスポレウスに一致することか
ら、本発明の菌株はストレプトマイセス ニトロ
スポレウスに属する新菌株であると考えられる。
本発明者らはこの菌株をストレプトマイセス ニ
トロスポレウスＴ−76株と命名した。 培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく、通常
の培地が用いられる。炭素源としては、デンプ
ン、グリセリン、グルコース、シユークロースな
どが用いられる。窒素源としては、ポリペプト
ン、肉エキス、ダイズタンパク、総合アミノ酸な
どが用いられる。無機塩類としては、食塩
（NaCl）、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウムなどが用いられる。その他、必
要によりビタミン類などの微量栄養素が加えられ
る。例えば、次の組成の培地が好適に用いられ
る。 培地組成
は、上記阻害物質を生産しうるストレプトマイセ
ス（Streptomyces）属に属する微生物を培養す
る工程、および得られる培養物から該阻害物質を
採取する工程を包含し、そとにより上記目的が達
成される。 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76は、ストレ
プトマイセス（Streptomyces）属菌、特にスト
レプトマイセス ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）Ｔ−76株（微工
研菌寄第9882号；FERMP−9882）により生産さ
れる。この菌株は、発明者らにより土壌から分離
された新菌株である。 この菌株の菌学的性質を以下に示す。培養温度
は特に記載のない限り30℃である。 １ 形態 胞子形成菌糸の分枝は直状また曲状の単純分
枝であり、10胞子以上連鎖した胞子を形成す
る。胞子表面は滑面であり、胞子の大きさは
（0.6〜0.8）×（0.7〜1.0）μｍであり、鞭毛胞子
および胞子嚢の形成は見られない。 ２ 各種培地での生育状況 (1) シユークロース・硝酸塩寒天培地 発育：不良、無色 気菌糸：豊富、灰色 可溶性色素：認められず (2) グルコース・アスパラギン寒天培地 発育：不良、オレンジイエローから灰色がか
つた黄色 気菌糸：豊富、白から灰色がかつた白色 可溶性色素：認められず (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地 発育：不良、濃いオレンジイエロー 気菌糸：豊富、灰色 可溶性色素：認められず (4) スターチ・無機塩寒天培地 発育：不良、濃いオレンジイエローからブラ
ウン 気菌糸：豊富、明るい灰色 可溶性色素：認められず (5) チロシン寒天培地 発育：不良、ブラウン 気菌糸：厚い、明るい灰色 可溶性色素：認められず (6) 栄養寒天培地 発育：不良、灰色がかつた黄色 気菌糸：豊富、白色 可溶性色素：認められず (7) イースト・麦芽寒天培地 発育：良好、オレンジイエロー 気菌糸：わずか、白色、しわがある 可溶性色素：認められず (8) オートミール寒天培地 発育：良好、オレンジイエローからブラウン 気菌糸：豊富、白色から灰色 可溶性色素：認められず ３ 生理学的性質 (1) 生育温度範囲：16℃〜40℃で生育し、至適
生育温度は30℃付近である。 (2) ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプ
トン・ゼラチン培地および単純ゼラチン培
地） (3) スターチの加水分解：陽性（スターチ寒天
培地） (4) 脱脂牛乳の凝固：陰性 (5) 脱脂牛乳のペプトン化：陽性 (6) メラニン様色素の生成：陰性（ペプトン・
イースト・鉄寒天培地、トリプトン・イース
トブロス寒天培地、およびチロシン寒天培
地） (7) 硝酸塩の還元：陽性 ４ 炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地） Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラ
ビノース、およびＤ−マンノースをよく利用
し；Ｌ−ラムノース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−
ガラクトース、およびサリシンをわずかに利用
し；ラフイノース、Ｄ−マンニトール、イノシ
トール、およびシユークロースを利用しない。 菌株の同定 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76を生産する
菌株を、上記菌学的諸性質をもとにバージエイズ
マニユアル オブ デイタミネイテイブ バクテ
リオロジー第８版（1974）〔Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology、8th、Edd.
（1974）〕；インターナシヨナル ストレプトマイ
セス プロジエクト〔International
Strepomyces Project（ISP）〕の報告〔インター
ナシヨナル ジヤーナル オブ システマテイツ
ク バクテリオロジー（International Journal
of Systematic Bacteriology）第18巻69−189頁
（1968）、同第18巻279−392頁（1968）、同第19巻
391−512頁（1969）および同第22巻265−394頁
（1972）〕；およびワクスマン（Waksman）著
“アクチノマイセス（The Actinomycetes）”第
２巻に基づいて比較すると、本菌株は、下記の点
を除きストレプトマイセス ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）に一致する：ス
トレプトマイセス ニトロスポレウスは(1)脱脂牛
乳を凝固させること、(2)Ｌ−ラムノースを良好に
同化すること、および(3)Ｄ−フラクトースを同化
しないこと。しかし、その他の点ではストレプト
マイセス ニトロスポレウスに一致することか
ら、本発明の菌株はストレプトマイセス ニトロ
スポレウスに属する新菌株であると考えられる。
本発明者らはこの菌株をストレプトマイセス ニ
トロスポレウスＴ−76株と命名した。 培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく、通常
の培地が用いられる。炭素源としては、デンプ
ン、グリセリン、グルコース、シユークロースな
どが用いられる。窒素源としては、ポリペプト
ン、肉エキス、ダイズタンパク、総合アミノ酸な
どが用いられる。無機塩類としては、食塩
（NaCl）、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウムなどが用いられる。その他、必
要によりビタミン類などの微量栄養素が加えられ
る。例えば、次の組成の培地が好適に用いられ
る。 培地組成
【表】
培養PHは６〜８、好ましくは7.0、培養温度は
25〜35℃、好ましくは28℃であり、約２〜７日
間、好ましくは約４日間好気的に撹拌または振盪
しながら培養を行う。本発明のアミラーゼ阻害物
質は菌体外に分泌され、培地中から回収され得
る。 阻害物質の採取法 上記培養液から本発明のアミラーゼ阻害物質を
採取・精製するには既知の精製法が単独もしくは
併用して利用され得る。例えば、培養液を濾過ま
たは遠心分離にかけて菌体を除去し、瀘液または
上清液を得る。この瀘液または上清液は、必要に
応じて濃縮し、限外濾過または透析を行なう。こ
れをさらに、硫酸アンモニウム（硫安）などによ
り塩析した後に透析し、次いで陰イオン交換セル
ロース、陰イオン交換ゲルなどによるイオン交換
クロマトグラフイー、疎水クロマトグラフイーな
どの各種クロマトグラフイー（例えば、TEAEセ
ルロース、DEAEトヨパール、オクチルセフアロ
ースCL−4Bなど）を単独でもしくは組み合わせ
て用いることによつて精製を行う。精製法の一例
を次に示す。 (1)培養液から菌体を除去した後、硫安（80％飽
和）による塩析を行い、得られた沈澱を溶かし透
析を行う。これを、(2)TEAEセルロースカラムク
ロマトグラフイー（PH6.0、０〜1.25M NaCl濃度
勾配）にかけた後、透析を行う。次いで、(3)オク
チルセフアロースCL−4Bカラムクロマトグラフ
イー（（PH6.0；1.5M NaCl）にかけた後、透析を
行う。(4)透析内液をDEAEトヨパールカラムクロ
マトグラフイー（PH6.2、０〜0.3M NaCl濃度勾
配）にかけ、透析を行う。(5)凍結乾燥を行い、精
製標品を得る。 このような方法で精製したアミラーゼ阻害物質
は、デイスク電気泳動およびSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す。以下
に示すアミラーゼ阻害物質の性質は、このように
して得られた精製標品を用いて調べられた。 アミラーゼ阻害活性測定法 コントロールとなるアミラーゼ活性は次のよう
にして測定される。 約２単位のブタ膵臓アミラーゼを含有する酵素
溶液0.2mlに精製水0.2mlを添加し、37℃で５分間
プレインキユベーシヨンする。次いで、この溶液
に1.5％可溶性デンプン溶液（0.1Mトリス−塩酸
緩衝液溶液；PH7.0）0.8mlを添加し、37℃で10分
間反応させる。この反応液に、0.5N酢酸
（CH3COOH）と0.5N塩酸（HCl）との５：１混
合液２mlを添加して振盪することによりアミラー
ゼ反応を停止させる。この溶液0.1mlを採取し、
0.005％ヨウ素および0.05％ヨウ化カリウムを含
有する溶液５mlを添加して振盪し、室温で20分間
放置する。この溶液の660nｍにおける吸光度を
測定し、この吸光度をＣとする。別にブランクと
して上記アミラーゼ酵素駅の代わりに精製水を用
いた反応系を調製し、同様の操作を行つて得られ
た吸光度をＢとする。このようにして得られた吸
光度ＣおよびＢからアミラーゼ活性Ａが次式(1)を
用いて算出される。このＡの計算値が0.35である
ときをアミラーゼ活性の１単位とする。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ ……（） 従つて、阻害物質が存在しない場合のアミラー
ゼ活性をA0とすると、A0は上記アミラーゼ活性
測定と同様にして測定され、得られた吸光度を
T0とすると、次式（）を用いて算出される。 A0＝（Ｂ−T0）／Ｂ ……（） アミラーゼ阻害物質の阻害活性は次のようにし
て測定される。 上記アミラーゼ活性測定のための反応系中の精
製水0.2mlの代わりに、阻害物質の溶液0.2mlを用
いた反応系を調製し、同様の操作を行う。この操
作によつて得られた吸光度をTiとする。阻害物
質が存在する場合のアミラーゼ活性をAiとする
と、Aiは次式（）を用いて算出される。 Ai＝（Ｂ−Ti）／Ｂ ……（） 阻害物質が存在する時の阻害率（％）Ｉとする
と、Ｉは次式（）を用いて算出される。 Ｉ＝（A0−Ai）×100／A0 ……（） 上記ブタ膵臓アミラーゼ活性の２単位を50％を
阻害するアミラーゼ阻害物質の量を１阻害単位
（1U）とすると、以上の式（）〜（）から、
アミラーゼ阻害物質の阻害活性は次式（）を用
いて算出される。 阻害活性＝（A0／0.7）×（Ｉ／50） ×阻害物質の希釈倍数 ……（） 阻害物質の性質 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76の理化学的
性質を以下に示す。 作用 ブタ膵臓アミラーゼの代わりに種々のアミラ
ーゼ、およびプロテアーゼを用い、アミラーゼ
阻害活性測定法に準じて測定を行つた。反応条
件はそれぞれのアミラーゼおよびプロテアーゼ
の反応に適した条件とした。 その結果、ヒト膵臓アミラーゼ、ヒト唾液ア
ミラーゼ、ブタ膵臓アミラーゼ、ネコ膵臓アミ
ラーゼ、馬膵臓アミラーゼ、ラツト膵臓アミラ
ーゼ、羊膵臓アミラーゼ、山羊膵臓アミラー
ゼ、および鯉膵臓アミラーゼを阻害し、ヘビ膵
臓アミラーゼ、ウサギ膵臓アミラーゼ、犬膵臓
アミラーゼ、モルモツト膵臓アミラーゼ、バチ
ルス属菌由来のα−アミラーゼ、ダイズのβ−
アミラーゼ、大麦のβ−アミラーゼ、リゾプス
属菌由来のグルコアミラーゼ、シユウドモナス
属菌湯由来のイソアミラーゼ、ペプシン、トリ
プシン、およびα−キモトリプシンを阻害しな
いことがわかつた。 このことから、本発明の阻害物質Ｔ−76はヒ
ト、ブタなどの多くの高等動物由来のアミラー
ゼを選択的に阻害し、植物由来、細菌由来およ
びカビ由来のアミラーゼを阻害しない阻害物質
であり、さらにプロテアーゼにも作用しないこ
とが明らかである。 安定PH範囲および熱安定性 本阻害物質Ｔ−76をPH１〜13の範囲の13種の
PHの緩衝液にそれぞれ溶解し、30℃で24時間保
持した後、PHを1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.0）を用いて中性域に調整し、残存阻害活性
を上記測定法に従つて測定した。その結果を第
１図に示す。別に、各PHにおいて100℃で15分
間保持した後、同様にPHを中性域に調整し、残
存阻害活性を測定した。その結果を第１図に破
線で示す。使用した緩衝液は、PH１〜３では50
ｍＭ塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液（図中○印）、
PH４〜６では50ｍＭ酢酸緩衝液（図中●印）、
PH７〜８では50ｍＭトリス−酢酸緩衝液（図中
×印）、PH９〜11では50ｍＭグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（図中△印）、PH12では50ｍ
Ｍ水酸化ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム
緩衝液（図中▲印）、PH13では250ｍＭ水酸化ナ
トリウム溶液（図中□印）である。第１図か
ら、安定PH範囲は30℃でPH３〜12（100％活性が
残存）、そして100℃ではPH３〜９（ほぼ90％以
上の活性が残存であることがわかる。このよう
に、本阻害物質Ｔ−76は広いPH範囲において加
熱条件下においても安定であり、特にPH３〜９
において極めて安定である。 分子量 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によると単一のバンド
が得られる。SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約8000である。 等電点 担体としてアンフオラインを用いて測定した
等電点は3.8である。 紫外線吸収スペクトル 極大吸収は273nｍであり、極小吸収は250n
ｍである。この紫外線吸収スペクトルのチヤー
トを第２図に示す。 呈色反応 銅フオーリン法で青色を呈する。 阻害剤 本阻害物質Ｔ−76 100単位を含有する溶液
（PH7.0）に下記に示す化合物を存在させ、30℃
で60分間処理した後、アミラーゼ阻害活性測定
法に準じて残存阻害活性の測定を行なつた。 その結果、本阻害物質Ｔ−76は、エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム（10ｍＭ）、ｐ−ク
ロロマーキユリーベンゾエート（５ｍＭ）、モ
ノヨード酢酸（10ｍＭ）、ｏ−フエナンスロリ
ン（10ｍＭ）、または８−キノリノール（１ｍ
Ｍ）により活性が失われず、ドデシル硫酸ナト
リウム〔１％、（100℃、10分間処理）〕または
塩酸グアニジン（4M）で活性が70％以上残存
することがわかつた。このように、本阻害物質
Ｔ−76は種々の阻害剤に対して安定である。 失活の条件 本阻害物質Ｔ−76を、37℃にて1N塩酸で15
分間処理すると、その活性残存率は50％であ
り、100℃にて1N塩酸またはPH10以上の条件下
で15分間処理すると完全に失活する。１％２−
メルカプトエタノール存在下で100℃において
15分間処理すると完全に失活する。 フロテアーゼの作用 本阻害物質Ｔ−76 130単位を含有する溶液に
下記の各種プロテアーゼをそれぞれ20PU添加
し、各プロテアーゼの至適PH（ペプシンはPH
2.0、トリプシンおよびα−キモトリプシンは
PH8.5）にて37℃で210分間作用させた。これを
100℃で５分間の処理をすることによつてプロ
テアーゼを失活させ、PHを1Mトリス−塩酸緩
衝液（PH7.0）を用いて中性付近に調整し、ア
ミラーゼ阻害活性測定法に準じてアミラーゼ活
性阻害の測定を行つた。上記のプロテアーゼ処
理を行わなかつた阻害物質Ｔ−76について同様
に測定し、これをスタンダードとした。 これにより、本阻害物質Ｔ−76は、ペプシ
ン、トリプシン、およびα−キモトリプシンの
いずれのプロテアーゼを単独で作用させても失
活せず、かつこれらのプロテアーゼを連続的
（ペプシンに次いでトリプシン；ペプシンに次
いでα−キモトリプシン；およびペプシンに次
いでトリプシンおよびα−キモトリプシンの順
序）に作用さてても失活しないことがわかつ
た。このように、本阻害物質Ｔ−76は種々のプ
ロテアーゼに対して安定である。 アミノ酸組成 アミラーゼ阻害物質Ｔ−76のアミノ酸組成
を、Spackmanら（Anal.Chem.、30、1190
（1958））の方法に従つて、Hitachi835型高速
アミノ酸分析計（日立社）により測定した。高
速アミノ酸分析計のための試料の前処理は次の
ようにして行つた：阻害物質Ｔ−76を、再蒸留
した5.7N HClと共にアンプルに入れて真空封
管し、110℃で24、48、および72時間加熱する
ことにより加水分解する。シスチン、メチオニ
ンおよびトリプトフアンはこの方法では測定さ
れないので、別の方法を採用した。すなわち、
メチオニン、シスチン（およびシステイン）は
Schramの方法（Biochem.J.、57 33（1954）
並びにMooreの方法（J.Biol.Chem.、238、235
（1963））に準じて過ギ酸酸化後、加水分解を行
い、メチオニンスルホン酸、システイン酸とし
て定量した。また、システインはEllmanの比
色法（Arch.Biochem.Biophy.、82 70（1959））
に従い定量した。そして、トリプトフアンにつ
いてはEdelhochらの方法（Biochemistry、６、
1948（1967））により測定した。 結果を次の表に示す。
25〜35℃、好ましくは28℃であり、約２〜７日
間、好ましくは約４日間好気的に撹拌または振盪
しながら培養を行う。本発明のアミラーゼ阻害物
質は菌体外に分泌され、培地中から回収され得
る。 阻害物質の採取法 上記培養液から本発明のアミラーゼ阻害物質を
採取・精製するには既知の精製法が単独もしくは
併用して利用され得る。例えば、培養液を濾過ま
たは遠心分離にかけて菌体を除去し、瀘液または
上清液を得る。この瀘液または上清液は、必要に
応じて濃縮し、限外濾過または透析を行なう。こ
れをさらに、硫酸アンモニウム（硫安）などによ
り塩析した後に透析し、次いで陰イオン交換セル
ロース、陰イオン交換ゲルなどによるイオン交換
クロマトグラフイー、疎水クロマトグラフイーな
どの各種クロマトグラフイー（例えば、TEAEセ
ルロース、DEAEトヨパール、オクチルセフアロ
ースCL−4Bなど）を単独でもしくは組み合わせ
て用いることによつて精製を行う。精製法の一例
を次に示す。 (1)培養液から菌体を除去した後、硫安（80％飽
和）による塩析を行い、得られた沈澱を溶かし透
析を行う。これを、(2)TEAEセルロースカラムク
ロマトグラフイー（PH6.0、０〜1.25M NaCl濃度
勾配）にかけた後、透析を行う。次いで、(3)オク
チルセフアロースCL−4Bカラムクロマトグラフ
イー（（PH6.0；1.5M NaCl）にかけた後、透析を
行う。(4)透析内液をDEAEトヨパールカラムクロ
マトグラフイー（PH6.2、０〜0.3M NaCl濃度勾
配）にかけ、透析を行う。(5)凍結乾燥を行い、精
製標品を得る。 このような方法で精製したアミラーゼ阻害物質
は、デイスク電気泳動およびSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で単一のバンドを示す。以下
に示すアミラーゼ阻害物質の性質は、このように
して得られた精製標品を用いて調べられた。 アミラーゼ阻害活性測定法 コントロールとなるアミラーゼ活性は次のよう
にして測定される。 約２単位のブタ膵臓アミラーゼを含有する酵素
溶液0.2mlに精製水0.2mlを添加し、37℃で５分間
プレインキユベーシヨンする。次いで、この溶液
に1.5％可溶性デンプン溶液（0.1Mトリス−塩酸
緩衝液溶液；PH7.0）0.8mlを添加し、37℃で10分
間反応させる。この反応液に、0.5N酢酸
（CH3COOH）と0.5N塩酸（HCl）との５：１混
合液２mlを添加して振盪することによりアミラー
ゼ反応を停止させる。この溶液0.1mlを採取し、
0.005％ヨウ素および0.05％ヨウ化カリウムを含
有する溶液５mlを添加して振盪し、室温で20分間
放置する。この溶液の660nｍにおける吸光度を
測定し、この吸光度をＣとする。別にブランクと
して上記アミラーゼ酵素駅の代わりに精製水を用
いた反応系を調製し、同様の操作を行つて得られ
た吸光度をＢとする。このようにして得られた吸
光度ＣおよびＢからアミラーゼ活性Ａが次式(1)を
用いて算出される。このＡの計算値が0.35である
ときをアミラーゼ活性の１単位とする。 Ａ＝（Ｂ−Ｃ）／Ｂ ……（） 従つて、阻害物質が存在しない場合のアミラー
ゼ活性をA0とすると、A0は上記アミラーゼ活性
測定と同様にして測定され、得られた吸光度を
T0とすると、次式（）を用いて算出される。 A0＝（Ｂ−T0）／Ｂ ……（） アミラーゼ阻害物質の阻害活性は次のようにし
て測定される。 上記アミラーゼ活性測定のための反応系中の精
製水0.2mlの代わりに、阻害物質の溶液0.2mlを用
いた反応系を調製し、同様の操作を行う。この操
作によつて得られた吸光度をTiとする。阻害物
質が存在する場合のアミラーゼ活性をAiとする
と、Aiは次式（）を用いて算出される。 Ai＝（Ｂ−Ti）／Ｂ ……（） 阻害物質が存在する時の阻害率（％）Ｉとする
と、Ｉは次式（）を用いて算出される。 Ｉ＝（A0−Ai）×100／A0 ……（） 上記ブタ膵臓アミラーゼ活性の２単位を50％を
阻害するアミラーゼ阻害物質の量を１阻害単位
（1U）とすると、以上の式（）〜（）から、
アミラーゼ阻害物質の阻害活性は次式（）を用
いて算出される。 阻害活性＝（A0／0.7）×（Ｉ／50） ×阻害物質の希釈倍数 ……（） 阻害物質の性質 本発明のアミラーゼ阻害物質Ｔ−76の理化学的
性質を以下に示す。 作用 ブタ膵臓アミラーゼの代わりに種々のアミラ
ーゼ、およびプロテアーゼを用い、アミラーゼ
阻害活性測定法に準じて測定を行つた。反応条
件はそれぞれのアミラーゼおよびプロテアーゼ
の反応に適した条件とした。 その結果、ヒト膵臓アミラーゼ、ヒト唾液ア
ミラーゼ、ブタ膵臓アミラーゼ、ネコ膵臓アミ
ラーゼ、馬膵臓アミラーゼ、ラツト膵臓アミラ
ーゼ、羊膵臓アミラーゼ、山羊膵臓アミラー
ゼ、および鯉膵臓アミラーゼを阻害し、ヘビ膵
臓アミラーゼ、ウサギ膵臓アミラーゼ、犬膵臓
アミラーゼ、モルモツト膵臓アミラーゼ、バチ
ルス属菌由来のα−アミラーゼ、ダイズのβ−
アミラーゼ、大麦のβ−アミラーゼ、リゾプス
属菌由来のグルコアミラーゼ、シユウドモナス
属菌湯由来のイソアミラーゼ、ペプシン、トリ
プシン、およびα−キモトリプシンを阻害しな
いことがわかつた。 このことから、本発明の阻害物質Ｔ−76はヒ
ト、ブタなどの多くの高等動物由来のアミラー
ゼを選択的に阻害し、植物由来、細菌由来およ
びカビ由来のアミラーゼを阻害しない阻害物質
であり、さらにプロテアーゼにも作用しないこ
とが明らかである。 安定PH範囲および熱安定性 本阻害物質Ｔ−76をPH１〜13の範囲の13種の
PHの緩衝液にそれぞれ溶解し、30℃で24時間保
持した後、PHを1Mトリス−塩酸緩衝液（PH
7.0）を用いて中性域に調整し、残存阻害活性
を上記測定法に従つて測定した。その結果を第
１図に示す。別に、各PHにおいて100℃で15分
間保持した後、同様にPHを中性域に調整し、残
存阻害活性を測定した。その結果を第１図に破
線で示す。使用した緩衝液は、PH１〜３では50
ｍＭ塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液（図中○印）、
PH４〜６では50ｍＭ酢酸緩衝液（図中●印）、
PH７〜８では50ｍＭトリス−酢酸緩衝液（図中
×印）、PH９〜11では50ｍＭグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（図中△印）、PH12では50ｍ
Ｍ水酸化ナトリウム−リン酸水素二ナトリウム
緩衝液（図中▲印）、PH13では250ｍＭ水酸化ナ
トリウム溶液（図中□印）である。第１図か
ら、安定PH範囲は30℃でPH３〜12（100％活性が
残存）、そして100℃ではPH３〜９（ほぼ90％以
上の活性が残存であることがわかる。このよう
に、本阻害物質Ｔ−76は広いPH範囲において加
熱条件下においても安定であり、特にPH３〜９
において極めて安定である。 分子量 ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動によると単一のバンド
が得られる。SDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約8000である。 等電点 担体としてアンフオラインを用いて測定した
等電点は3.8である。 紫外線吸収スペクトル 極大吸収は273nｍであり、極小吸収は250n
ｍである。この紫外線吸収スペクトルのチヤー
トを第２図に示す。 呈色反応 銅フオーリン法で青色を呈する。 阻害剤 本阻害物質Ｔ−76 100単位を含有する溶液
（PH7.0）に下記に示す化合物を存在させ、30℃
で60分間処理した後、アミラーゼ阻害活性測定
法に準じて残存阻害活性の測定を行なつた。 その結果、本阻害物質Ｔ−76は、エチレンジ
アミン四酢酸二ナトリウム（10ｍＭ）、ｐ−ク
ロロマーキユリーベンゾエート（５ｍＭ）、モ
ノヨード酢酸（10ｍＭ）、ｏ−フエナンスロリ
ン（10ｍＭ）、または８−キノリノール（１ｍ
Ｍ）により活性が失われず、ドデシル硫酸ナト
リウム〔１％、（100℃、10分間処理）〕または
塩酸グアニジン（4M）で活性が70％以上残存
することがわかつた。このように、本阻害物質
Ｔ−76は種々の阻害剤に対して安定である。 失活の条件 本阻害物質Ｔ−76を、37℃にて1N塩酸で15
分間処理すると、その活性残存率は50％であ
り、100℃にて1N塩酸またはPH10以上の条件下
で15分間処理すると完全に失活する。１％２−
メルカプトエタノール存在下で100℃において
15分間処理すると完全に失活する。 フロテアーゼの作用 本阻害物質Ｔ−76 130単位を含有する溶液に
下記の各種プロテアーゼをそれぞれ20PU添加
し、各プロテアーゼの至適PH（ペプシンはPH
2.0、トリプシンおよびα−キモトリプシンは
PH8.5）にて37℃で210分間作用させた。これを
100℃で５分間の処理をすることによつてプロ
テアーゼを失活させ、PHを1Mトリス−塩酸緩
衝液（PH7.0）を用いて中性付近に調整し、ア
ミラーゼ阻害活性測定法に準じてアミラーゼ活
性阻害の測定を行つた。上記のプロテアーゼ処
理を行わなかつた阻害物質Ｔ−76について同様
に測定し、これをスタンダードとした。 これにより、本阻害物質Ｔ−76は、ペプシ
ン、トリプシン、およびα−キモトリプシンの
いずれのプロテアーゼを単独で作用させても失
活せず、かつこれらのプロテアーゼを連続的
（ペプシンに次いでトリプシン；ペプシンに次
いでα−キモトリプシン；およびペプシンに次
いでトリプシンおよびα−キモトリプシンの順
序）に作用さてても失活しないことがわかつ
た。このように、本阻害物質Ｔ−76は種々のプ
ロテアーゼに対して安定である。 アミノ酸組成 アミラーゼ阻害物質Ｔ−76のアミノ酸組成
を、Spackmanら（Anal.Chem.、30、1190
（1958））の方法に従つて、Hitachi835型高速
アミノ酸分析計（日立社）により測定した。高
速アミノ酸分析計のための試料の前処理は次の
ようにして行つた：阻害物質Ｔ−76を、再蒸留
した5.7N HClと共にアンプルに入れて真空封
管し、110℃で24、48、および72時間加熱する
ことにより加水分解する。シスチン、メチオニ
ンおよびトリプトフアンはこの方法では測定さ
れないので、別の方法を採用した。すなわち、
メチオニン、シスチン（およびシステイン）は
Schramの方法（Biochem.J.、57 33（1954）
並びにMooreの方法（J.Biol.Chem.、238、235
（1963））に準じて過ギ酸酸化後、加水分解を行
い、メチオニンスルホン酸、システイン酸とし
て定量した。また、システインはEllmanの比
色法（Arch.Biochem.Biophy.、82 70（1959））
に従い定量した。そして、トリプトフアンにつ
いてはEdelhochらの方法（Biochemistry、６、
1948（1967））により測定した。 結果を次の表に示す。
【表】
（実施例）
以下に本発明を実施例につき説明する。
実施例 １
３％コーンスターチ、1.0％肉エキス、1.0％ポ
リペプトン、0.2％酵母エキス、0.5％リン酸二カ
リウムおよび0.05％硫酸マグネシウムを含有する
培地（PH7.0）100mlを500ml容の坂口フラスコに
入れ、ストレプトマイセス ニトロスポレウスＴ
−76株を接種し、28℃で４日間振盪培養した。こ
の培養液を濾過して得た濾過中のアミラーゼ阻害
活性は、約2000U／mlであつた。このようにして
得られる培養瀘液を集めて2000mlとし、次いでこ
の瀘液の硫安分画を行つた。まず培養瀘液に硫安
粉末を80％飽和となるまで添加し、析出した沈澱
を遠心分離によつて回収した。沈澱を0.01Mリン
酸緩衝液（PH6.0）に対して一晩透析し、脱塩を
行つた。得られた透析内液を、0.01Mリン酸緩衝
液（PH6.0）で平衡化したTEAEセルロースカラ
ム（2.8×34cm：Serva社）にかけてアミラーゼ阻
害物質を吸着させた。次いでリン酸緩衝液中の食
塩（NaCl）濃度を０〜1.25Mの直線的に増加さ
せることによつてグラジエント溶出を行つた。ア
ミラーゼ阻害活性を示す画分（NaCl濃度0.9〜
1.2M）を回収し、1.5M NaClを含有する0.02M
リン酸緩衝液（PH6.0）に対して一晩透析した。
この透析内液を、1.5M NaClを含有する0.02Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化したオクチルセフ
アロースCL−4Bカラム（2.8×34cm；Pharmacia
社）にかけ、同緩衝液で展開することにより着色
物質と阻害物質とを分離した。（着色物質と阻害
物質いずれも本樹脂には非吸着であるが、阻害物
質の方が親和性が高い。従つて阻害物質の方が着
色物質よりおくれて溶出される。）大部分の着色
物質が除かれた活性画分を回収し、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.2）に対して一晩透析した。この透
析内液を、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.2）で平衡
化したDEAEトヨパールカラム（50ml；東洋曹達
工業(株)）に添加し、上記と同様にして阻害物質を
吸着させ、非吸着物質の洗浄除去をした。次いで
リン酸緩衝液中のNaCl濃度を０〜0.3Mに直線的
に増加させることによつて溶出を行つた。溶出に
より得られる画分と吸光度との関係、および得ら
れる画分とアミラーゼ阻害活性との関係を第３図
に示す。第３図において、●印はOD280nｍにお
ける吸光度（タンパクによる吸収）を示し、○印
はアミラーゼ阻害活性（×10-4U／ml）を示す。
アミラーゼ阻害活性はタンパク画分と同一の画分
に一つのピークとして現れた。この活性画分
NaCl濃度0.2〜0.24M）を回収し、水に対して十
分に透析した。この透析内液を凍結乾燥し、アミ
ラーゼ阻害物質Ｔ−76の精製標品33mgを得た。こ
の精製標品のアミラーゼ阻害活性は26000U／mg
であつた。この精製標品は、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動およびデイスク電気泳動を行
うと単一バンドとなり、電気泳動的に単一の物質
であることが示された。 （発明の効果） 本発明によれば、このように、新規のアミラー
ゼ阻害物質Ｔ−76が提供される。この阻害物質Ｔ
−76はストレプトマイセス属菌から効果的に生産
される。この阻害物質Ｔ−76は、高等動物由来の
アミラーゼを選択的に阻害し、消化液に含有され
るペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼによ
り失活されず、広い温度範囲およびPH範囲にわた
つて安定である。そのため、消化器官、口腔など
の体内においてアミラーゼ活性を阻害するために
投与される治療薬または予防薬などとして極めて
効果的に利用され得る。微生物由来のアミラーゼ
には作用しないので、該微生物由来のアミラーゼ
を用いて高等動物の生体成分を測定する際の誤差
原因となる該動物由来アミラーゼの特異的阻害剤
としても有用である。
リペプトン、0.2％酵母エキス、0.5％リン酸二カ
リウムおよび0.05％硫酸マグネシウムを含有する
培地（PH7.0）100mlを500ml容の坂口フラスコに
入れ、ストレプトマイセス ニトロスポレウスＴ
−76株を接種し、28℃で４日間振盪培養した。こ
の培養液を濾過して得た濾過中のアミラーゼ阻害
活性は、約2000U／mlであつた。このようにして
得られる培養瀘液を集めて2000mlとし、次いでこ
の瀘液の硫安分画を行つた。まず培養瀘液に硫安
粉末を80％飽和となるまで添加し、析出した沈澱
を遠心分離によつて回収した。沈澱を0.01Mリン
酸緩衝液（PH6.0）に対して一晩透析し、脱塩を
行つた。得られた透析内液を、0.01Mリン酸緩衝
液（PH6.0）で平衡化したTEAEセルロースカラ
ム（2.8×34cm：Serva社）にかけてアミラーゼ阻
害物質を吸着させた。次いでリン酸緩衝液中の食
塩（NaCl）濃度を０〜1.25Mの直線的に増加さ
せることによつてグラジエント溶出を行つた。ア
ミラーゼ阻害活性を示す画分（NaCl濃度0.9〜
1.2M）を回収し、1.5M NaClを含有する0.02M
リン酸緩衝液（PH6.0）に対して一晩透析した。
この透析内液を、1.5M NaClを含有する0.02Mリ
ン酸緩衝液（PH6.0）で平衡化したオクチルセフ
アロースCL−4Bカラム（2.8×34cm；Pharmacia
社）にかけ、同緩衝液で展開することにより着色
物質と阻害物質とを分離した。（着色物質と阻害
物質いずれも本樹脂には非吸着であるが、阻害物
質の方が親和性が高い。従つて阻害物質の方が着
色物質よりおくれて溶出される。）大部分の着色
物質が除かれた活性画分を回収し、0.01Mリン酸
緩衝液（PH6.2）に対して一晩透析した。この透
析内液を、0.01Mリン酸緩衝液（PH6.2）で平衡
化したDEAEトヨパールカラム（50ml；東洋曹達
工業(株)）に添加し、上記と同様にして阻害物質を
吸着させ、非吸着物質の洗浄除去をした。次いで
リン酸緩衝液中のNaCl濃度を０〜0.3Mに直線的
に増加させることによつて溶出を行つた。溶出に
より得られる画分と吸光度との関係、および得ら
れる画分とアミラーゼ阻害活性との関係を第３図
に示す。第３図において、●印はOD280nｍにお
ける吸光度（タンパクによる吸収）を示し、○印
はアミラーゼ阻害活性（×10-4U／ml）を示す。
アミラーゼ阻害活性はタンパク画分と同一の画分
に一つのピークとして現れた。この活性画分
NaCl濃度0.2〜0.24M）を回収し、水に対して十
分に透析した。この透析内液を凍結乾燥し、アミ
ラーゼ阻害物質Ｔ−76の精製標品33mgを得た。こ
の精製標品のアミラーゼ阻害活性は26000U／mg
であつた。この精製標品は、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動およびデイスク電気泳動を行
うと単一バンドとなり、電気泳動的に単一の物質
であることが示された。 （発明の効果） 本発明によれば、このように、新規のアミラー
ゼ阻害物質Ｔ−76が提供される。この阻害物質Ｔ
−76はストレプトマイセス属菌から効果的に生産
される。この阻害物質Ｔ−76は、高等動物由来の
アミラーゼを選択的に阻害し、消化液に含有され
るペプシン、トリプシンなどのプロテアーゼによ
り失活されず、広い温度範囲およびPH範囲にわた
つて安定である。そのため、消化器官、口腔など
の体内においてアミラーゼ活性を阻害するために
投与される治療薬または予防薬などとして極めて
効果的に利用され得る。微生物由来のアミラーゼ
には作用しないので、該微生物由来のアミラーゼ
を用いて高等動物の生体成分を測定する際の誤差
原因となる該動物由来アミラーゼの特異的阻害剤
としても有用である。
第１図は本阻害物質Ｔ−76の30℃および100℃
における安定PH範囲を示すグラフ、第２図は本阻
害物質Ｔ−76の紫外線吸収スペクトルを示すチヤ
ート、第３図は本阻害物質Ｔ−76のDEAE−トヨ
パールカラムクロマトグラフイーの溶出曲線を示
すグラフである。
における安定PH範囲を示すグラフ、第２図は本阻
害物質Ｔ−76の紫外線吸収スペクトルを示すチヤ
ート、第３図は本阻害物質Ｔ−76のDEAE−トヨ
パールカラムクロマトグラフイーの溶出曲線を示
すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の性質を有するアミラーゼ阻害物質Ｔ−
76： 作用：ヒト膵臓アミラーゼ、ヒト唾液アミラ
ーゼ、およびブタ膵臓アミラーゼを阻害し；バ
チルス属菌由来のα−アミラーゼ、ダイズのβ
−アミラーゼ、大麦のβ−アミラーゼ、リゾプ
ス属菌由来のグルコアミラーゼ、シユウドモナ
ス属菌由来のイソアミラーゼ、ペプシン、トリ
プシンおよびα−キモトリプシンを阻害しな
い、 安定PH範囲および熱安定性：PH３〜12で30℃
において24時間にわたり安定であり、PH３〜９
で100℃において15分間にわたり安定である、 分子量：SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による分子量は約8000である、 等電点：アンフオラインを担体として用いた
等電点は3.8である、 紫外線吸収スペクトル：極大吸収は278nｍ
であり、極小吸収は250nｍである、および 次のアミノ酸組成を有する： 【表】 【表】 ＊ ジスルフイド結合の２
個分に相当(シスチンが
２個存在)。
２ ストレプトマイセス（Streptomyces）属菌
から得られる特許請求の範囲第１項に記載のアミ
ラーゼ阻害物質Ｔ−76。 ３ ストレプトマイセス ニトロスポレウス
（Streptomyces nitrosporeus）Ｔ−76株から得
られる、特許請求の範囲第２項に記載のアミラー
ゼ阻害物質Ｔ−76。 ４ 特許請求の範囲第１項に記載のアミラーゼ阻
害物質Ｔ−76を製造する方法であつて、 該阻害物質を生産しうるストレプトマイセス
（Streptomyces）属に属する微生物を培養する工
程、および 得られる培養物から該阻害物質を採取する工
程、 を包含するアミラーゼ阻害物質Ｔ−76の製造方
法。 ５ 前記ストレプトマイセス（Streptomyces）
属に属する微生物が、ストレプトマイセス ニト
ロスポレウス（Streptomyces nitrosporeus）で
ある特許請求の範囲第４項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63054436A JPH01228470A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | アミラーゼ阻害物質ｔ−７６およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63054436A JPH01228470A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | アミラーゼ阻害物質ｔ−７６およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01228470A JPH01228470A (ja) | 1989-09-12 |
| JPH042600B2 true JPH042600B2 (ja) | 1992-01-20 |
Family
ID=12970658
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63054436A Granted JPH01228470A (ja) | 1988-03-08 | 1988-03-08 | アミラーゼ阻害物質ｔ−７６およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01228470A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7123334B2 (en) | 2000-12-08 | 2006-10-17 | Sony Corporation | Liquid crystal display device and liquid crystal projector device |
-
1988
- 1988-03-08 JP JP63054436A patent/JPH01228470A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01228470A (ja) | 1989-09-12 |
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