JPH0428690B2 - - Google Patents

Description

請求の範囲 １ 唯一有効な止血剤が第ａ因子である無菌組
成物よりなることを特徴とする血液凝固因子の欠
乏した患者または血液凝固因子の阻害因子を有す
る患者を処置するための止血用医薬組成物。

２ 前記無菌組成物は第ａ因子活性および第
Xa因子活性を有しない第１項の止血用医薬組成
物。

３ 安定剤を含んでいる第１項の止血用医薬組成
物。

４ 水を含んでいる第１項の止血用医薬組成物。

５ 第ａ因子の濃度が約0.1ないし10.0μg／ml
である第４項の止血用医薬組成物。

６ 穿刺可能な弾性キヤツプを有する閉鎖無菌容
器中に乾燥状態で前記無菌組成物が収容されてい
る第１項の止血用医薬組成物。

７ 前記乾燥状態の無菌組成物は水中に１mlあた
り約0.1ないし10.0μgの第ａ因子濃度に復元さ
れる第６項の止血用医薬組成物。

本発明の背景 本発明は血液凝固因子、特に第因子（抗血友
病因子、AHF）を有さない、あるいはその阻害
因子を有する患者の治療用組成物に関する。

血液凝固は非常に複雑なプロセスである。最後
にはフイブリン凝塊を生じる各種の血液成分の相
互作用は、所謂カスケードであり、各段階は前後
の段階に依存し規制されている。一般にこの凝固
カスケードに関与する血液成分は酵素原か、また
は酵素変調因子である。該酵素原は酵素的に不活
性な蛋白で、一般に凝固カスケードの初期段階で
生成される他の蛋白分解酵素である「活性化因
子」の作用によつて蛋白分解酵素に変換される。
このような変換を受けた凝固因子を以後活性因子
と定義して下位クラス記号“ａ”によつて表わ
し、一方酵素原は凝固因子前駆体という。

酵素変調因子は主にカルシウムイオンまたは非
酵素蛋白のような助因子であり、多くは酵素が少
しでも触媒活性を発揮しようとするならば必須で
ある。このような変調因子は酵素基質と区別され
るべきである。基室は酵素によつて共有結合的に
変化される化合物であるが、変調因子または助因
子は構造的変化を受けることなしに単に酵素に結
合する。

酵素原は血液凝固カスケードにおける重要な成
分である。これらは凝固カスケードの必要に応じ
る貯蔵所に相当し、必要な場合、酵素的に機能的
な形に活性化される。活性化の程度および酵素の
活性は変調因子によつて制御されている。

第因子はこれら酵素原の１つである。第因
子は血液凝固の外因性経路に関与しており、組織
因子の存在下に第Ｘ因子を第Xa因子に変換する。
第Xa因子は、それから順次、助因子である第Ｖ
因子、カルシウムイオンおよびリン脂質の存在下
にプロトロンビンをトロンビンに変換する。第
ａ因子は更に内因性凝固過程にも関与しているら
しいことが最近証明されている。

ウシの第因子が単離され、その特徴が明らか
にされている（Kisiel and Davie，
“Biochemistry”14（22）：4928−4934〔1975〕）。
この著者らによつて精製されたこの第因子は、
ゲル電気泳動によつて調べると均質であり、プロ
トロンビンは0.001Ortho単位／ml未満であり、
0.5mg蛋白／ml濃度で調べると第およびＸ因子
は検出出来なかつた。第因子活性は蛋白濃度で
は相当に失われるため、ウシの血清アルブミン１
mg／mlを安定化剤として第因子希釈液中に加え
た。

ウシの第因子は、約50.000ダルトンの単鎖状
糖蛋白である。これは、カルシウムイオンおよび
リン脂質の存在下に第Xa因子により、または助
因子なしにトロンビンあるいは第ａ因子によ
り、ジスルフイド結合で連結された２鎖状蛋白に
変換される。１段階凝固試験法で測定すると第
因子活性は約10ないし100倍増大するが、これは
２鎖状形に変換するからである。

ヒトの第因子もまた精製され、その特徴が明
らかにされている（Broze and Majerus“J.Biol.
Chem”1242−1247〔1980〕）。この方法によれば、
Kisiel and Davieによつて得られたウシの生成
物と同じく凝固試験法により活性が検出されず、
また検出可能な第Ｘ、または因子を含有しな
い第因子を得ることができる。最終標品は第
因子2.3単位／μg蛋白を含有していた。ヒトの第
因子はウシの蛋白の55−85％に相応し、ウシの
第因子と共通の他の多くの特徴を示す。ウシの
第ａ因子と同様、これは活性化の段階、おそら
く蛋白分解的分裂を経て２鎖状形に変換する。２
鎖状形への活性化による活性の増大は20−25倍で
ある。この２鎖状形は以後第ａ因子と同義であ
る。

第ａ因子は以前には、出願人の知る限りでは
凝固阻害因子を有する患者または凝固欠乏患者の
治療に使用されたことはない。しかしながら、第
ａ因子は活性プロトロンビン複合体（PCC）、
即ち、第因子の阻害因子を有する患者の治療に
使用される活性および非活性凝固酵素の複合体混
合物に存在することが知られている。

活性プロトロンビン複合体中の治療上有効な物
質は、ａ，Xa，XIa，Ｘａ，ａ，Xa二量
体、Xa−プロトロンビンの中間二成分複合体、
“大量”の第因子、第因子の“変換型”、第
因子阻害因子バイパス活性因子（FEIBA）、血小
板第Ｘ因子活性因子、および、わずかだが、トロ
ンビンといつた因子の１つもしくはそれ以上であ
ると推測されている。しかし、当業者のかかえて
いる最優先課題は、活性PCCの生体内での作用
機構が十分に理解されておらず、それ故当業者は
これら組成物中の有効な生体内止血因子を単に推
測し得るにすぎない、ということである。

活性PCCの治療的使用は、有効な止血因子を
精製することによつて改善し得よう。このことに
より外因性蛋白の患者への投与は少なくてすむよ
うになろう。更に、蛋白分画の経済性も精製によ
つて得られた不要な残渣を他の治療用生産物の製
造に回すことによつて助長されることになろう。

従つて、本発明の目的は、単離可能で、血液凝
固欠損の治療に単独で使用し得る活性PCC中の
止血因子を同定することである。

他の目的は、播種性血管内凝固のような有害な
血栓症を発生する可能性の低いそのような止血因
子を同定することである。

別の目的は、患者が凝固因子阻害因子を発生す
るのを刺激しないように使用し得るそのような因
子を同定することである。

本発明のこれらおよびその他の目的は、本明細
書を全体として考慮することにより明白であろ
う。

本発明の要旨 出願人は精製した第ａ因子がそれ自体止血因
子であることを見い出した。これは止血を達成す
るのに治療上有効なその他の活性または非活性因
子を何ら投与する必要はない。このことは、第
ａおよびXa因子に関して特に驚くべきことであ
つた。何故なら、当業者はこれら因子がおそらく
活性PCCの止血作用の候補であるとしばしば推
測していたからである。第ａ因子の有効性もま
た驚くべきことであつた。というのは、実験動物
には第因子が欠乏しておらず、それ故出血を調
整するのに必要と思われる第ａ因子をおそらく
すべて産生できたからであろう。

従つて、ここに報告した方法は、凝固因子欠乏
または凝固因子阻害因子による凝固因子欠損患者
に、唯一の効果的な活性止血因子が第ａ因子で
ある組成物の有効止血量を投与することに成る。

本発明の方法に使用される第ａ因子は、単独
ではここに報告したイヌ実験モデルで、生体内で
臨床的止血作用を充分には発揮しないと思われる
活性血液凝固因子を多量には含んでいない。従つ
て、本発明の組成物は第ａ因子以外の活性血液
凝固因子を含んでいるものと考えられる。しか
し、そのような夾雑因子の活性は非常に低く思わ
れるので、夾雑組成物の第ａ因子活性が阻害さ
れ、または物理的に夾雑物から分離され、そして
第ａ因子が夾雑組成物中に存在した場合とほぼ
同一条件、例えば注入速度および濃度、のもとに
夾雑物が投与されると、臨床的に認め得る止血効
果は観察されないであろう。その変わり、夾雑組
成物は、例えば電気泳動法により第ａ因子を含
まないように精製することができ、その残渣は非
活性部分トロンボプラスチン時間あるいは他の一
般的内因性凝固活性試験法で凝固活性を調べるこ
とができる。仮に第ａ因子の分離前後に
Nemerson法により測定した凝固活性が単純な第
ａ因子を用いた対照の３倍以上減少すれば、そ
の時この組成物は本発明に使用し得るに十分低い
レベルの夾雑凝固プロテアーゼを含有するものと
見なされる。

止血作用あるいは止血量は、下記実施例１に述
べるように、統計学的に有意な数のＡ型血友病イ
ヌが試験標品注入後約30分以内に出血の停止を示
し、どの出血の停止も注入後３時間にわたりヘマ
トクリツトの有意な低下を伴わないことで定義さ
れる。

そのような組成物は、通常第Xa因子を１単
位／ml以上およびトロンビンを約0.001単位／ml
以上含有しない。第ａ因子を直接測定せしめ得
る第因子前駆体活性から総第因子活性を減ず
ることにより得られる差は約15単位／ml以下であ
り、通常約５単位／ml未満である。これら活性因
子の単位活性は出願中の米国特許出願S.N.116，
187.現行米国特許4286056に示されている方法に
より測定した；第Ｘ因子はそこに述べられている
色素法により測定した。

どのような夾雑活性凝固因子も治療組成物から
物理的に分離する必要はない。というのはそれら
因子は、例えばアンチトロンビンおよび低レベ
ルのヘパリン（第ａ因子1μgあたりヘパリン１
〜３単位程度）を含めることにより、その場で不
活性化または阻害されるからである。しかし、残
りの非活性凝固因子から第因子を分離して活性
化するか、または活性化の後に第ａ因子を精製
することにより、第ａ因子を精製する方が好ま
しい。この二者にあつては、活性化の前に第因
子を精製する方が好ましい。第およびＸ因子な
どの分離された凝固因子は、それらを活性化しよ
うと思えば出来る余地がまだ残つているならば、
もつと有用である。更に、その活性化は容易に制
御可能であり、取り扱うべき出発原料の量は、第
因子が活性化以前に精製されるならばかなり減
じられる。

上記考察は治療組成物中の活性凝固因子の存在
を論じている。活性凝固因子の場合と違つて、そ
のような因子の非活性前駆体形は、治療的に有効
な用量での第ａ因子の投与が治療上許容出来な
い量の蛋白を注入することになる程度の第ａ因
子の希釈をもたらす量まで組成物中に存在する可
能性がある。これは全く高濃度であり、実際のと
ころ典型的血漿分画産物の場合に限られたことで
はない。非活性の第，，およびＸ因子の量
は、典型的にはそれぞれ約１−10、30−250、０
−30および１−30単位／mlである。むしろ、組成
物はほとんど第および因子を含有しないが、
上記濃度で第および／または第Ｘ因子を含有し
ている。単位活性は上記引用の米国特許出願中に
述べた方法によつて測定した。

活性または非活性凝固因子以外の血漿蛋白が本
発明に使用される組成物中に存在する可能性があ
る。更に、外因性蛋白の夾雑はなるべく回避され
ているが、重要ではない。事実、精製第ａ因子
中にある程度の蛋白が残り安定化剤として作用す
ることが望ましい。例えば、アルブミンは第ａ
因子活性を安定化することが知られている。一般
に、約１mg／ml以上の蛋白濃度であれば第ａ因
子を安定化するのに充分であるが、この量は重要
ではない。

他の生理学的に許容出来る安定化剤は、本発明
に従い使用される第ａ因子含有組成物中に存在
するであろう。例えば、非還元糖類、低分子量デ
キストランのような多糖類、ソルビトールまたは
グリセロールのようなポリアルコール類、グリシ
ンを含むアミノ酸類、および酸性亜硫酸塩または
アスコルビン酸塩のような抗酸化剤である。これ
ら安定化剤は一般に約0.1〜３％重量／容量の濃
度で存在する。

第ａ因子は、種々の凝固因子阻害因子を有す
る患者および凝固因子欠乏患者、特に第，お
よびXI因子欠乏またはその阻害因子を有する患
者の治療に有用である。第または因子の阻害
因子を有する患者ははこれまでにも観察されてい
る。阻害因子はその阻害された因子に対する抗体
と思われる物質である。これら物質は、たぶん免
疫結合または立体障害により凝固因子と相互作用
を生じ、凝固機構へのそれら因子の関与を妨げる
のである。阻害因子は特に急眉の問題である。と
いうのは阻害因子力価は一般に凝固因子の用量が
さらに増大するのに応じて増加し、結局は高用量
での治療的アプローチを凌く傾向を示すからであ
る。本発明は第因子阻害因子を有する患者の治
療に特に適用性を有する。

欠乏症候群は、その因子自体が欠けているか、
存在しても効果のない濃度であるか、または凝固
部分と抗原類似性を有するが凝固系ではほぼ非機
能的である蛋白である場合に存在する。欠乏は多
くの原因に基づくが、主には先天性かまたは凝固
因子産生器官の破壊による。最も重大な凝固因子
欠乏は第，およびXI因子の欠乏であり、ア
ルコール性肝硬変やウイルス性肝炎のような慢性
肝疾患に付随する凝固機構の欠損である。

第ａ因子は予防的によりもむしろ出血性事件
の診断に基づき投与した方がよく、一回注射より
むしろ、滅菌水溶液として持続注入により投与す
べきである。注入溶液中の第ａ因子の活性およ
び第ａ因子活性の投与量は、臨床医が直面して
いる治療環境、例えば出血の重症度および部位並
びに患者の全身状態に依存している。

注入溶液中の第ａ因子の活性は広範囲にわた
つてもよく、重要ではない。しかし、この溶液中
の総蛋白濃度は因子を安定化するレベルに維持し
なければならない。一般に、適切な溶液には0.1
〜10.0mg／Kgの第ａ因子が含まれている。ア
ルブミンまたは他の安静化蛋白は約１〜５mg／ml
レベルで注入溶液中に存在すべきである。

第ａ因子は使用する組成物中に存在する二重
鎖の形のままで投与するのが望ましい。他の蛋白
との混合物中の特定の蛋白を測定、分離する方法
は、当業者には周知である。例えば電気泳動法ま
たは免疫検定法である。

前記の方法の簡便な変法は、単に組成物中の第
因子含量を測定して酵素原を活性化する段階に
移り、そして最大の第ａ因子活性（第因子活
性として表わされる）増大を得るため同じ原料か
ら得た精製第因子で以前に測定した活性化条件
を選択することである。第およびａ因子の分
子量はほぼ等しいので、第ａ因子の量は出発因
子である第因子とほぼ同じである。また、活性
化条件は最大であるため、ほぼ全部の第因子が
第ａ因子に転換するものと思われる。

その代わり、投与量は第因子単位で表わす。
しかし、検査材料は、第因子凝固検定法におい
て干渉を起こす第因子や第ａ因子以外の滑性
凝固因子で大幅に汚染されていないことを確認す
る手段をまず最初に講じねばならない。この材料
は第因子を実質的に含まないように精製すべき
である。というのは第及びａ因子は共に、た
とえその活性型が第因子の10〜100倍活性が高
いとしても、同質の活性を示すからである。検定
法はまた凝固検定法であるので、それはまた第
因子と第ａ因子とを区別することは出来ない。
また、この方法はフイブリン塊の形成に基づく方
法であるため、フイブリンを更に生じ得る第Xa
因子またはトロンビンのような活性因子は虚偽の
陽性の結果を来たすことになる。第ａ因子はそ
の酵素原より約10−100倍活性が高いので、活性
組成物中の第因子を除去することは重要なこと
ではない；即ち、第因子の試験に対する影響は
すべて、その試験における第ａ因子の相対的活
性が高いのでほとんど影響を及ぼすことはない。

欠乏状態および阻害因子を有する状態に適した
第ａ因子の投与量は、阻害されたまたは欠乏し
た凝固因子の残りの活性、出血部位およびその程
度、患者の全身状態およびその他多くの因子とい
つた臨床環境に依存している。即ち、投与量は最
適な治療効果を得るには臨床医によつて様々であ
る。このことはもちろん他の治療組成物を処置す
る場合臨床医が直面する日常的問題であり、それ
故当業者の技術の範ちゆうに入るものである。一
般に第ａ因子の投与量は0.1〜2.5μg／Kg体重が
望ましく、最も望ましくは0.1〜1.5μg／Kgであ
る。この用量範囲では約15〜30分以内に止血を来
たすが、未処理対象では一般に出血し続け抑制し
難い。この用量範囲は医師に対する指針としての
み予定されており、あらゆる治療状況に適切なも
のとして解釈されるべきでない。

投与回数はまた臨床医の判断による。第ａ因
子は血流中では限られた生物学的半減期しかな
く、従つて、一般に少量を頻回注入するのが望ま
しい。投与頻度は通常３〜４時間毎である。小さ
な出血部位、例えば小さな血腫を治療する場合に
は投与回数は少なくてよいが、外傷性創傷または
外科−歯科処置のような大きな出血の場合には頻
回注入が要求される。

第ａ因子組成物を製する方法は周知である。
Kisiel et al.の方法、“Biochemistry”16（９）：
4189−4193（1977），またはBroze and Majerus
の方法、“本明細書中に引用”は第ａ因子を製
造するのに使用可能であり、この因子は無菌ロ過
するとここで使用することが出来る。これらの方
法で作られた第ａ因子組成物は余分に活性化プ
ロテアーゼ（第Xaまたはａ因子）を含んでお
り、これらプロテアーゼは第ａ因子から分離す
ることにより、または、例えば過剰量の抗活性化
因子血清を加えての阻害により効力を発揮しない
ようにしなければならない。後者の方法は実行可
能であるが、第ａ因子を精製する方が望まし
く、それにより組成物に異種因子の付加を避ける
ことが出来る。

活性プロテアーゼは、活性化の前または後に不
溶化することにより第ａ因子と分離し得よう。
このプロテアーゼは活性化の前に、酵素不溶化の
先行技術において一般に知られている方法に従
い、カルボジイミドまたは臭化シアノジエンのよ
うな架橋剤を用い、例えばセルロース、架橋化デ
キストランまたはナイロンといつた不溶性の親水
性支持体と架橋させることにより不溶化すること
が望ましい。第ａ因子はそのような不動化され
たプロテアーゼに対し如何なるフイードバツク蛋
白分解滑性をも発揮しない。

その代わり、第ａ因子は一般に知られた蛋白
精製法、例えば、電気泳動法、超遠心分離法、免
疫親和性クロマトグラフイー、イオン交換クロマ
トグラフイー等により活性化プロテアーゼと分離
することが出来る。

第ａ因子は、それから既知の方法、例えば、
細胞微生物を留めるのに十分に小さな孔サイズを
有する膜フイルターを通して組成物の水溶液をロ
過することにより無菌化する。出発原料である血
漿中に存在する可能性のある肝炎ウイルスのよう
な汚染ウイルスは組成物を（凍結乾燥または乾燥
後）水浴中にて約50〜60℃で約３〜75時間加熱す
ることにより破壊することが出来る。

最も便利なのは、第ａ因子の溶液を無菌バイ
アル中に無菌的に充填し、そのまま凍結乾燥し、
その後下針を穿刺するのに適した弾性キヤツプで
そのバイアルを密封することである。そうすれば
その組成物は注射用滅菌水で簡単にもとにもど
る。

前述の著者らの活性化方法は、出願中の米国特
許出願S.N.116，187、現行米国特許4286056に述
べられている一般的方法により更に変えることが
出来る。本方法はその基礎として、活性化を行な
うに先立ちほぼ予定した活性の第ａ因子組成物
を得るのに必要な条件を決定しなければならな
い。該方法は、 (a) 第および因子を含む出発原料を用意し、 (b) 第因子と第因子を十分に分離し、 (c) 前記段階(b)から得た第因子に富む分画を、 （） 第因子活性化の程度を制御するため
に変えることのできる条件を選定し、 （） 活性化終了前に、第因子をあらかじ
め定めた活性化の程度に活性化するのに必要
な該条件の大きさを決定し、 （） 該条件を前記大きさに設定し、 （） 該条件に従い第因子の活性化を行な
い、そして （） あらかじめ定めた活性化の程度で活性
化を終了することによつて活性化する ことより成る。

一般に活性化の一条件だけが変化することを許
され、そしてこれは活性化が進行することを許さ
れる時間であるのが通常である。

選定した条件の大きさは二つの方法のうちの一
方、または両方法の組合せによつて決定される。
二方法のうち最低に好ましい方法においては、該
条件は活性化が開始された後組成物の部分標本を
取り、各部分標本の活性化を終らせ、各部分標本
の活性化程度を決定し、そして分画のあらかじめ
定めた活性化程度を得るのに必要な条件の大きさ
を計算することによつて決定される。

その代わり、条件の大きさは、活性化前に組成
物の部分標本を取り、部分標本間で条件を変え、
部分標本を各部分標本について設定した条件に従
つて活性化し、活性化を終らせ、各部分標本の活
性化程度を決定し、そして組成物のあらかじめ定
めた活性化程度を得るのに必要な条件の大きさを
計算することにより決定することができる。この
具体例は、同時に活性化が進行しているバルクか
ら分取した部分標本の定量中に起り得るような、
あらかじめ定めた活性化レベルを越えることはあ
り得ないという利益を有する。

活性化の程度は、一般に第因子活性増大を追
跡することによつて監視され、希望の増大率、例
えば開始時の活性の15倍にする。Seligsohn et.
al.の方法、“Blood”53（５）：828−837（1979）、
は大量の他の凝固因子を含有する第因子組成物
に使用すべきである。本方法は第ａ因子の絶対
的測定法ではない。その代わり、該方法は第因
子の第ａ因子に対する比率の変化を検定するこ
とができ、それ故、酵素原からの第ａ因子の産
生を監視するのに有用な方法である。

実施例 １ ここでの研究および以後の実施例はＡ型血友病
を有する近交系イヌで行なつた。そのような動物
での止血は、上顎犬歯上部の歯肉に外科的に作成
した５×２×1.5mmの創（テンプレート生検）で
の出血または凝塊形成を観察することにより行な
つた。正常イヌでは、創からの出血は５±２分以
内に終わり、再出血を来すことなく凹形にしつか
りとふさがつた。これに対し血友病イヌは創一面
に異常な凸形の凝塊を形成し、治療しなければ数
日間再出血を来たした。ヘマトクリツトは制御不
能な出血に伴い２−10％ほど低下した。

全注入例で、テンプレート生検標本および輸注
後生検標本を口の後部から採取して中性緩衝ホル
マリンに固定し、分割し、パラフインあるいはメ
タクリル酸プラスチツクに封埋し、そして切片作
成後染色し血小板栓子およびフイブリンを調べ
た。検査した切片には微小血管血栓症は認められ
なかつた。このことは血小板数またはフイブリノ
ーゲンに有意な変化が観察されなかつたという事
実と一致する。

これら実験で使用した第ａ因子はKisiel et
al.の方法、本明細書中に引用、によりウシ血漿
よりむしろヒト血漿から調製した。活性化に使用
した第ａ因子はヒトの第因子に対するウサギ
抗血清の添加により阻害された。このウサギ抗血
清は１mlあたり第因子50μgの抗第因子力価
を有し、ジイソプロピイルホスホロフルオリデー
トにより中和される。活性化の前に精製した第
因子はmg蛋白あたり第因子3250単位を含有して
いた（Nemerson and Clyneの方法、“J.Lab.
Clin.Med.”83；301（1974）、により測定した）、
ベンズアミジンは活性化の前にゲル・クロマトグ
ラフイーにより第因子から除去した。該因子
は、ウサギ脳トロンボプラスチンを用い検定する
と、第ａ因子で活性化した後見かけの第因子
活性を約10倍増大した。このようにして生成され
た第ａ因子は通常２時間以内に使用したが、８
℃で保存すれば72時間以内であれば十分に使用す
ることができた。無菌ロ過を行ない、製薬業では
あたりまえである穿刺可能な弾性キヤツプで密閉
したバイアル中で第ａ因子を凍結乾燥すると、
更に長期の保存が可能であつた。第ａ因子の濃
度は240μg／mlであり、この濃度が実施例を通じ
て使用された。実施例１，２および４−６で使用
した標品は大量の残余第因子を含有しているも
のと思われた。

体重13.6Kgの血友病イヌを選び、生検を第１日
目、そしてさらに第７、８日目に行なつた。１日
目に該イヌには非活性第因子を1.8μg／Kg用量
で注入した。一般に、本実施例および以下の実施
例では、注入は生検後30分以上は行なわなかつ
た。出血はこの注入後は臨床的に明らかでなかつ
たが、ヘモグロビンの連続測定によれば止血は完
全でなかつた。７日目に別の生検を行ない、この
場合第ａ因子60μgを、即ち4.4μg／Kg用量で注
入した。この処置にもかかわらずヘモグロビンレ
ベルは連続的に低下し、臨床的に出血は続いた。
それ故、８日目に新たに生検を行ない、小用量の
第ａ因子、即ち24μg（1.8μg／Kg）を注入した。
この日の一連のヘモクロビン検査および臨床観察
によれば、この用量のａ因子で出血は停止して
いた。これら３日間の観察中血小板数は安定なま
まであつたが、理由はわからないが１日目の血小
板枚数は７日目および８日目の数より高かつた。

実施例 ２ 本試験は体重14.1Kgの血友病イヌで行なつた。
１日目に生検を行ない、イヌは第ａ因子24μg
（1.7μg／Kg）を注射した。この第ａ因子標品は
抗第抗体で処理されておらず、従つて第ａ因
子が存在していた。出血は臨床的にもヘマトクリ
ツト連続測定によつても止まらなかつた。抗体を
残りの標品に加えて注射を午後４時15分に繰り返
した。そうすると、ヘマトクリツトが１日目の午
後に37、２日目の朝に38であつたので、止血が起
こつたものと思われた。２日目に生検を繰り返
し、更に第ａ因子1.7μg／Kgの注入を繰り返し
た。臨床的に出血は10分以内に止まつた。一連の
ヘマトクリツトは31および32であり、出血は臨床
的に散在的であつた。更に第ａ因子1.7μg／Kg
を午後４時に投与した。出血は一晩中ほとんど見
られず、３日目にヘマトクリツトは再び31％とな
つた。新たな生検を３日目に行なうとかなりの出
血を来たした。それで、第ａ因子48μg、即ち
3.4μg／Kgを注入した。ヘマトクリツトは24時間
にわたり低下し、このことは高用量の第ａ因子
が低用量の場合よりも効果的でなかつたことを示
していた。

４日目に凝塊をガーゼで除くと、全生検部位、
特に24時間創は出血を来たした。イヌに第ａ因
子1.7μg／mlと標準ウサギ脳トロンボプラスチン
100μlを注射した。注射の耐性は良好で、創は10
分でふさがり始めた；しかし、観察および連続的
ヘマトクリツト測定を行なうと、出血は続いてい
た。２時45分に、イヌに第ａ因子0.85μg／Kgを
注射した。出血は臨床的には止まつたように見
え、止血は試験を通じて安定なままに思えた。し
かし、この注射は４日目の午後９時、５日めの午
前８時、６日目の午前８時および７日目の午前８
時30分に繰り返されたことを付しておく。

実施例 ３ テンプレート歯肉生検を、局所麻酔下に体重
15.0Kgの血友病イヌで行なつた。１日目の注入は
ヒト第ａ因子0.16μg／Kgで行なつた。有害な反
応はなかつた。事実、ヒト第因子または第ａ
因子を注入しても、試験を通じてあらかじめ投与
しておいても有害反応は認められなかつた。この
場合止血は15分以内に得られるように思われ、し
かし注入３時間または４時間以内に再出血を来た
した。ヘマトクリツトは第１日目のおそくには35
％で、次の日の朝には31％であり、夜通し幾分か
の出血があつたことを示していた。２日目に第
ａ因子1.6μg／Kgを注入した。再び出血は止まつ
たように思え、この際晩のある時間まで再発しな
かつたようであつた。出血の再発はヘマトクリツ
トが24時間で31％から25％に低下したことにより
判明した。３日目、注入を第ａ因子の約
14μg／Kgで行なつた。この場合出血は臨床的に
止まつたようには見えなかつた。この場合ヘマト
クリツトは24時間で25％から15％に低下した。第
Ｘａ因子を第ａ因子と一緒に投与すると完全
には無力化されず、線溶の引き金となるかどうか
は明らかではなかつた。４日目に24時間創をキユ
レツトでかき取ると出血が再び始まつた。ウシ血
清アルブミンをプラシボと投与したが出血は止ま
らなかつた。Proplexプロトロンビンコンプレツ
クス51単位／Kgを注入すると出血は一晩中わずか
だが再発した。しかしヘマトクリツトの24時間低
下は15％から14％に低下したにすぎなかつた。５
日目に、第因子濃縮物48単位／Kgまたは第因
子32単位／Kgを注入した。出血は直ちに止まり、
再発しなかつた。

どの検査日でも、第因子欠乏イヌ基質あるい
は第因子欠乏ヒト基質で検定すると、見かけの
第因子に一貫した変化は認められなかつた。ま
た活性部分トロンボプラスチン時間に一貫した変
化は認められなかつた。しかし、プロトロンビン
時間は変化するとは思えなかつた。第ａ因子
0.16μg／Kgを注入した１日目に、プロトロンビン
時間の短縮は著るしく、15分以内に明らかであつ
た。また１日中止血は維持された。より高用量を
投与した３日目には、プロトロンビン時間は、止
血が達成されなかつたという事実にもかかわら
ず、また１日を通じて短縮した。フイブリノーゲ
ン検定も全標本について行なわれたが、一貫した
変化は認められなかつた。

実施例 ４ 次に試験したイヌの体重は13.6Kgであつた。生
検は試験第１、２、３および４日目に局所麻酔下
に行なつた。第１日目に投与した第ａ因子の投
与量は0.59μg／Kgであつた。臨床的には創は30分
でふさがつたように見えたが、創の上の凝塊は凸
状でもろそうであつた。午後および次の日の午前
中に行なつた一連のヘマトクリツト測定によれ
ば、ヘマトクリツトは38％から36％に低下したに
すぎなかつた。ヘモグロビン測定と同時に一連の
血球測定を行なうと、血液はほとんど失われてい
なかつたことが判明した。また血球計測は血小板
数にも有意な変化がなかつたことを示していた。
それ故、この動物のこの特別な場合、第ａ因子
0.59μg／Kg用量で止血が得られるものと思われ
た。２日目に、非活性第因子0.59μg／Kgを注入
した。この場合、ヘマトクリツトは初値36から、
４時間後33に、６時間後31に、そしてまた翌朝28
に低下した。臨床的にはまた、その期間中出血が
認められた。それ故、これら２日の観察により、
第ａ因子は止血効果を有し、第因子は止血効
果がないものと思われた。３日目に、イヌに再び
第ａ因子0.59μg／Kgを注入した。注入前のヘマ
トクリツトは28％で、注入後２時間および４時間
では29％であつた。しかし、創は出血し続けてい
たので、更に0.59μg／Kgを午後３時に投与した。
これにもかかわらず、ヘマトクリツトは一晩で21
％に低下した。４日目に、非活性第因子
1.18μg／Kgを注入した。ヘマトクリツトは注入前
の21から注入後２時間では19に、注入後５時間で
は16に低下した。その時点で、該動物に、出血を
抑制すると思えた第因子濃縮物の２バイアル
（482単位、35単位／Kg）を注入した。ヘマトクリ
ツトは続く24時間にわたり有意な低下を示さず、
該動物はさらに治療を施すことなく回復した。先
の実験におけるのと同じく、プロトロンビン時間
はわずかに短縮したが、他の測定値は有意な変化
を来たさないように思えた。プロトロンビン時間
短縮は活性または非活性第因子で認められた
が、invitro検定では、第因子はベンズアミジ
ンの非存在下での保存時には第ａ因子を付加し
なくてもゆつくりと活性化するであろうことが示
唆された。

実施例 ５ 本実施例で試験したイヌは体重14.1Kgであつ
た。このイヌは試験の第１、２および４日目に歯
肉生検が行なわれた。開始時のヘマトクリツトは
54％であつた。１日目の注射は非活性第因子
1.42μg／Kgで行なつた。止血は５分以内に起こる
ように思え、観察の最初の30分の間保たれた。し
かし、出血は午後３時に再開し、連続的にヘマト
クリツトを調べると、最初のヘマトクリツト54％
は、４時間で52％に、６時間で47％になつた。24
時間後のヘマトクリツトは41％であり、この用量
の第因子は明らかに出血を止めることはできな
かつた。２日目に、第ａ因子（20μg、1.42μg／
Kg）で注入を行なつた。再び早期の止血が、いつ
もの観察により見られたが、一連のヘマトクリツ
ト測定ではその日のうちに41％から31％に、更に
翌朝までに26％に低下したことが明らかとなつ
た。非活性ヒト第因子を３日目に、１日目の２
倍用量、即ち40μg（2.84μg／Kg）で投与した。臨
床的には出血はゆるやかとなり、ヘマトクリツト
は24時間で26％から22％に低下したにすぎなかつ
た。４日目に新たに生検を行ない、第ａ因子を
投与した（40μg、2.84μg／Kg）。この処置は止血
を来たさず、ヘマトクリツトは更に16％に低下し
た。この際、非活性第因子を使用した場合には
プロトロンビン時間はほとんど変化しなかつた
が、活性第因子を２日目および４日目に使用し
た場合には有意に低下した。

実施例 ６ 体重15.9Kgの血友病イヌを第１、２および３日
目に生検に供した。１日目の注入は第因子
1.26μg／Kgで行なつた。臨床的には出血は間歇的
であり、一連のヘモグロビンおよびヘマトクリツ
ト即手によればほとんど止血を来たすことはなか
つた。２日目に第ａ因子を1.26μg／Kg用量で投
与した。止血はすみやかであつたが、一連のヘモ
グロビンおよびヘマトクリツト測定により24時間
にわたりゆつくりと血液が失われていたことが示
唆された。３日目に、新たに生検を行ない、プラ
セボ注射を行なつた。該イヌは更に出血を来たす
ことはなく、追加注入も行なわなかつた。

以上の実施例から全体として、第ａ因子は凝
固欠損の処置において治療上有用であると結論で
きる。ヘマトクリツトの低下によつて示される血
液流失は、多くの場合、第ａ因子での治療後に
は起こらなかつたが、ヘマトクリツト低下のプロ
ツト曲線の勾配は、注入後の最初の３−６時間の
間は対照動物のそれより有意に小さいことが判明
した。