JPH0429350B2 - - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、ミミズ例えばルムプリカス・ルベラ
ス（Lumbricus rubellus）から抽出される新規
なタンパク分解酵素に関するものである。さらに
詳しくいえば、本発明は、ミミズの抽出物を精製
することにより得られ、繊維素溶解活性（以下線
溶活性と略す）を示すことで特徴づけられる４種
の白色無定形粉末の新規なプロテアーゼ、すなわ
ちプロテアーゼＦ−−１−HM−27、Ｆ−Ｉ−
１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−
−HM−64に関するものである。 本発明の酵素は、例えばミミズに水性溶媒を加
えて適当な時間、適当な温度に保持して抽出を行
い、抽出液をそのまま又は適当な時間、適当な温
度に保持したのち濃縮又は乾燥したのち吸着剤、
極性有機溶媒、塩析、限外濾過、イオン交換クロ
マトグラフイー又は疎水的クロマトグラフイーの
いずれか又はそれらの組合せで処理することによ
り得ることができる。すなわち、これらの６種の
新規な酵素はミミズ由来のプロテアーゼであり、
いずれも線溶活性を有する。これらの酵素は、そ
れぞれ分離に際し第２１図及び第２２図に示すよ
うに別々のフラクシヨン中に分配されており、そ
のフラクシヨンによつて区別されている。 Al活性と基質特異性： 本発明の酵素例えばプロテアーゼＦ−−１−
HM−27は以下に示す理化学的性質を測定するこ
とにより、同定される。 Ａ）活性と基質特異性 Ｆ−−１−HM−27は、フイブリン塊に対し
てフイブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン
活性化活性を有し、カゼイン、ｐ−トシル−Ｌ−
アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下TAMe
と称する。）、Ｎ−ａ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンメ
チルエステル塩酸塩（以下TLMeと称する。）、Ｌ
−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−
ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（通常、テストチーム
Ｓ−2444発色基質といい第一化学薬品工業社製品
である。以下単にＳ−2444と称する。）及びＨ−
Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニ
トロアニリドジ塩酸塩（通常、テストチームＳ−
2251発色基質といい第一化学薬品工業社製品であ
る。以下単にＳ−2251と称する。）に作用する。
しかし、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエ
ステル（以下BAMeと称する。）及びＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−チロシンエチルエステル（以下BTEe
と称する。）にはほとんど作用しなかつた。 このフイブリン分解活性は、アストラツプ
（T.Astrup）の方法〔Arch.Biophy.，40、346
（1952）〕と類似の方法で測定した。すなわち、凝
固可能性タンパクが0.15％になるようにフイブリ
ノーゲンを0.01M塩化ナトリウムを含む0.17Mホ
ウ酸緩衝液（PH7.8）に溶解後10mlを直径80mmの
殺菌シヤーレに流し込み、トロンビン溶液
（20μ／ml）を0.5ml加え混和し、蓋をして室温に
て１時間放置する（標準フイブリン平板）。適当
に希釈した被検酵素液（粉末酵素の場合は１mg／
mlの溶液を調製したのち、適当に希釈した酵素水
溶液）0.03mlを標準フイブリン平板上に垂直に滴
下し、濾紙を蓋の間に挟み、10分間放置後37℃の
恒温器に入れて18時間反応させる。このフイブリ
ン塊のフイブリン分解活性（線溶活性）は、標準
フイブリン平板上にできた溶解部分の長径と短径
とを測り、その積（mm2）と希釈倍数を乗じて表示
した（水溶液の場合はmm2／ml、粉末の場合はmm2／
mgで活性単位を表示した）。 また、プラスミノーゲン活性化活性は、プラス
ミノーゲン（シグマ社製）5μ／mlのもの10μ、
被検酵素水溶液20μ、0.01M塩化ナトリウムを
含む0.17Mホウ酸緩衝液（PH7.8）30μを混和し
37℃、10分間放置したのち、この反応液の0.03ml
をプラスミノーゲンフリーのフイブリン（マイル
ズ社製品）平板に垂直に滴下し、37℃、18時間反
応させ、溶解部分の面積を測定した値（mm2でもつ
て表示する）を（Ｘ）とし、同じように反応系中
のプラスミノーゲンの代わりに0.17Mホウ酸緩衝
液10μを用いたもので同じように測定して得ら
れた値を（Ｙ）とし、プラスミノーゲン活性化活
性（Ｘ）−（Ｙ）で表示した。 次に、カゼインの加水分解活性は、クニツツ
（M.Kunitz）の方法〔J.Gen.physiol.，30 291
（1947）〕と類似の方法で測定した。すなわち1.5
％ミルクカゼイン（メルク社製）のリン酸緩衝液
（0.1M、PH8.0）溶液１mlに被検酵素水溶液１ml
を加え、37℃で30分間反応させ、0.4Mトリクロ
ル酢酸水溶液2.0mlを加えて反応を停止させたの
ち、15分間インキユベートし、4000rpm、15分間
で遠心分離し、その上清液をとり波長280nmにお
ける吸光度を測定した。カゼイン溶液、トリクロ
ル酢酸水溶液、被検酵素水溶液の順に加えて同様
に操作したものを対照とし、活性単位をクニツツ
単位で表わした。 次に、TAMeの加水分解活性は、「メソツド・
イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）」第19巻、第41ページ（1970）に
記載の方法により測定した。すなわち0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.0）50mlに19.7mgのTAMeを
溶解させ、このTAMe溶液3.0mlと被検酵素水溶
液0.15mlを25℃で反応させ、１分間経過後の波長
247nmにおける吸光度を測定した。なお同測定系
において酵素水溶液の代わりに精製水を用いたも
のを対照とした。活性単位は１分間に1μモルの
TAMeを加水分解するときの酵素量を１単位と
した。 さらに、TLMeの加水分解活性は、前記
TAMeの代わりにTLMeを用い、測定波長
250nmを使用する以外はすべてTAMeの活性測
定法と同じ操作法により測定した。そして活性単
位は１分間に1.0のΔA250nmを生ずるときの酵素
量を１単位とした。 さらに、BTEeの加水分解活性は「メソツド・
イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）」第19巻、第31ページ（1970）に
記載の方法により測定した。すなわちメタノール
30mlにBTEe15.7mgを溶解させ、これに精製水を
加えて50mlとし、さらに0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）46.7mlを加えて調製したBTEe溶液3.0ml
と酵素水溶液0.15mlを25℃で反応させ、１分間経
過後の波長256nmの吸光度を測定した。なお同測
定系において酵素水溶液の代わりに精製水を用い
たものを対照とした。活性単位は１分間に1μモ
ルのBTEeを加水分解するときの酵素量を１単位
とした。 また、BTEeの加水分解活性は、BTEe19.7mg
を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）50mlに溶解し
た溶液を用い、測定波長255nmを使用する以外
は、前記BTEeの活性測定法と同じ操作法により
測定した。活性単位は１分間に1.0のΔA255nmを
生ずるときの酵素量を１単位とした。 Ｓ−2444の加水分解活性は、「ザ ジヤーナル
オブ バイオロジカルケミストリー（The
Journal of Biological Chemistry）」第265巻、
第2005ページ（1980）に記載の方法により測定し
た。 Ｓ−2444を0.1M食塩を含む0.05Mトリス塩酸
緩衝液（PH7.4）に0.5mMの濃度になるように溶
解し、この基質溶液１mlに酵素水溶液10μを混
合し、25℃で反応させ１分間経過後の波長405nm
の吸光度の増加を測定した。酵素単位は、１分間
に1μモルのＳ−2444を加水分解するときの酵素
量１を単位とした。 次に、Ｓ−2251の加水分解活性は、前記のＳ−
2444の代わりにＳ−2251を用い、基質濃度を
0.1mMとする以外は、すべてＳ−2444の活性測
定法と同じ操作法により測定した。活性単位は１
分間に1μモルのＳ−2251を加水分解するときの
酵素量を１単位とした。 第１表は本発明の酵素プロテアーゼＦ−−１
−HM−27を用い種々の基質に対して得られた結
果を要約して示したものである。
ス（Lumbricus rubellus）から抽出される新規
なタンパク分解酵素に関するものである。さらに
詳しくいえば、本発明は、ミミズの抽出物を精製
することにより得られ、繊維素溶解活性（以下線
溶活性と略す）を示すことで特徴づけられる４種
の白色無定形粉末の新規なプロテアーゼ、すなわ
ちプロテアーゼＦ−−１−HM−27、Ｆ−Ｉ−
１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−
−HM−64に関するものである。 本発明の酵素は、例えばミミズに水性溶媒を加
えて適当な時間、適当な温度に保持して抽出を行
い、抽出液をそのまま又は適当な時間、適当な温
度に保持したのち濃縮又は乾燥したのち吸着剤、
極性有機溶媒、塩析、限外濾過、イオン交換クロ
マトグラフイー又は疎水的クロマトグラフイーの
いずれか又はそれらの組合せで処理することによ
り得ることができる。すなわち、これらの６種の
新規な酵素はミミズ由来のプロテアーゼであり、
いずれも線溶活性を有する。これらの酵素は、そ
れぞれ分離に際し第２１図及び第２２図に示すよ
うに別々のフラクシヨン中に分配されており、そ
のフラクシヨンによつて区別されている。 Al活性と基質特異性： 本発明の酵素例えばプロテアーゼＦ−−１−
HM−27は以下に示す理化学的性質を測定するこ
とにより、同定される。 Ａ）活性と基質特異性 Ｆ−−１−HM−27は、フイブリン塊に対し
てフイブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン
活性化活性を有し、カゼイン、ｐ−トシル−Ｌ−
アルギニンメチルエステル塩酸塩（以下TAMe
と称する。）、Ｎ−ａ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンメ
チルエステル塩酸塩（以下TLMeと称する。）、Ｌ
−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−
ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（通常、テストチーム
Ｓ−2444発色基質といい第一化学薬品工業社製品
である。以下単にＳ−2444と称する。）及びＨ−
Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニ
トロアニリドジ塩酸塩（通常、テストチームＳ−
2251発色基質といい第一化学薬品工業社製品であ
る。以下単にＳ−2251と称する。）に作用する。
しかし、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエ
ステル（以下BAMeと称する。）及びＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−チロシンエチルエステル（以下BTEe
と称する。）にはほとんど作用しなかつた。 このフイブリン分解活性は、アストラツプ
（T.Astrup）の方法〔Arch.Biophy.，40、346
（1952）〕と類似の方法で測定した。すなわち、凝
固可能性タンパクが0.15％になるようにフイブリ
ノーゲンを0.01M塩化ナトリウムを含む0.17Mホ
ウ酸緩衝液（PH7.8）に溶解後10mlを直径80mmの
殺菌シヤーレに流し込み、トロンビン溶液
（20μ／ml）を0.5ml加え混和し、蓋をして室温に
て１時間放置する（標準フイブリン平板）。適当
に希釈した被検酵素液（粉末酵素の場合は１mg／
mlの溶液を調製したのち、適当に希釈した酵素水
溶液）0.03mlを標準フイブリン平板上に垂直に滴
下し、濾紙を蓋の間に挟み、10分間放置後37℃の
恒温器に入れて18時間反応させる。このフイブリ
ン塊のフイブリン分解活性（線溶活性）は、標準
フイブリン平板上にできた溶解部分の長径と短径
とを測り、その積（mm2）と希釈倍数を乗じて表示
した（水溶液の場合はmm2／ml、粉末の場合はmm2／
mgで活性単位を表示した）。 また、プラスミノーゲン活性化活性は、プラス
ミノーゲン（シグマ社製）5μ／mlのもの10μ、
被検酵素水溶液20μ、0.01M塩化ナトリウムを
含む0.17Mホウ酸緩衝液（PH7.8）30μを混和し
37℃、10分間放置したのち、この反応液の0.03ml
をプラスミノーゲンフリーのフイブリン（マイル
ズ社製品）平板に垂直に滴下し、37℃、18時間反
応させ、溶解部分の面積を測定した値（mm2でもつ
て表示する）を（Ｘ）とし、同じように反応系中
のプラスミノーゲンの代わりに0.17Mホウ酸緩衝
液10μを用いたもので同じように測定して得ら
れた値を（Ｙ）とし、プラスミノーゲン活性化活
性（Ｘ）−（Ｙ）で表示した。 次に、カゼインの加水分解活性は、クニツツ
（M.Kunitz）の方法〔J.Gen.physiol.，30 291
（1947）〕と類似の方法で測定した。すなわち1.5
％ミルクカゼイン（メルク社製）のリン酸緩衝液
（0.1M、PH8.0）溶液１mlに被検酵素水溶液１ml
を加え、37℃で30分間反応させ、0.4Mトリクロ
ル酢酸水溶液2.0mlを加えて反応を停止させたの
ち、15分間インキユベートし、4000rpm、15分間
で遠心分離し、その上清液をとり波長280nmにお
ける吸光度を測定した。カゼイン溶液、トリクロ
ル酢酸水溶液、被検酵素水溶液の順に加えて同様
に操作したものを対照とし、活性単位をクニツツ
単位で表わした。 次に、TAMeの加水分解活性は、「メソツド・
イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）」第19巻、第41ページ（1970）に
記載の方法により測定した。すなわち0.1Mトリ
ス塩酸緩衝液（PH8.0）50mlに19.7mgのTAMeを
溶解させ、このTAMe溶液3.0mlと被検酵素水溶
液0.15mlを25℃で反応させ、１分間経過後の波長
247nmにおける吸光度を測定した。なお同測定系
において酵素水溶液の代わりに精製水を用いたも
のを対照とした。活性単位は１分間に1μモルの
TAMeを加水分解するときの酵素量を１単位と
した。 さらに、TLMeの加水分解活性は、前記
TAMeの代わりにTLMeを用い、測定波長
250nmを使用する以外はすべてTAMeの活性測
定法と同じ操作法により測定した。そして活性単
位は１分間に1.0のΔA250nmを生ずるときの酵素
量を１単位とした。 さらに、BTEeの加水分解活性は「メソツド・
イン・エンザイモロジー（Methods in
Enzymology）」第19巻、第31ページ（1970）に
記載の方法により測定した。すなわちメタノール
30mlにBTEe15.7mgを溶解させ、これに精製水を
加えて50mlとし、さらに0.1Mトリス塩酸緩衝液
（PH8.0）46.7mlを加えて調製したBTEe溶液3.0ml
と酵素水溶液0.15mlを25℃で反応させ、１分間経
過後の波長256nmの吸光度を測定した。なお同測
定系において酵素水溶液の代わりに精製水を用い
たものを対照とした。活性単位は１分間に1μモ
ルのBTEeを加水分解するときの酵素量を１単位
とした。 また、BTEeの加水分解活性は、BTEe19.7mg
を0.1Mトリス塩酸緩衝液（PH8.0）50mlに溶解し
た溶液を用い、測定波長255nmを使用する以外
は、前記BTEeの活性測定法と同じ操作法により
測定した。活性単位は１分間に1.0のΔA255nmを
生ずるときの酵素量を１単位とした。 Ｓ−2444の加水分解活性は、「ザ ジヤーナル
オブ バイオロジカルケミストリー（The
Journal of Biological Chemistry）」第265巻、
第2005ページ（1980）に記載の方法により測定し
た。 Ｓ−2444を0.1M食塩を含む0.05Mトリス塩酸
緩衝液（PH7.4）に0.5mMの濃度になるように溶
解し、この基質溶液１mlに酵素水溶液10μを混
合し、25℃で反応させ１分間経過後の波長405nm
の吸光度の増加を測定した。酵素単位は、１分間
に1μモルのＳ−2444を加水分解するときの酵素
量１を単位とした。 次に、Ｓ−2251の加水分解活性は、前記のＳ−
2444の代わりにＳ−2251を用い、基質濃度を
0.1mMとする以外は、すべてＳ−2444の活性測
定法と同じ操作法により測定した。活性単位は１
分間に1μモルのＳ−2251を加水分解するときの
酵素量を１単位とした。 第１表は本発明の酵素プロテアーゼＦ−−１
−HM−27を用い種々の基質に対して得られた結
果を要約して示したものである。
【表】
ただし表中のN.D.はNot Detectedの略でほと
んど検出されないことを意味する（以下、同じ意
味である。） Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲： フイブリン塊を基質として使用したプロテアー
ゼＦ−−１−HM−27のフイブリン分解作用の
至適PHは第１図に示したように約８付近であつ
た。また、フイブリン塊を基質としてのPH安定範
囲は第２図に示したようにPH５〜12でほぼ安定で
あつた。PH安定性は37℃で60分間放置した後のプ
ロテアーゼＦ−−１−HM−27の残存活性を測
定することによつて決定した。 Ｃ） 作用適温の範囲： PH7.8のフイブリン塊を用い、種々の温度で２
時間反応させたときのプロテアーゼＦ−−１−
HM−27のフイブリン分解作用の変化を第３図に
示した。作用適温は30〜60℃の範囲内であり、最
適温度約50℃付近であつた。 Ｄ） 種々の温度による失活の条件： プロテアーゼＦ−−１−HM−27をPH7.8、
各種の温度で60分間保温した後のフイブリン塊の
フイブリン分解作用の残存活性を第４図に示し
た。これよりプロテアーゼＦ−−１−HM−27
は70℃で60分間保温することによつて完全に失活
することが分る。 Ｅ） 分子量： 32400±2000（SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によつて測定した。）： 牛血清アルブミン（分子量：67000）、オブアル
ブミン（分子量：43000）及びキモトリプシノー
ゲンＡ（分子量：25000）をプロテアーゼＦ−−
１−HM−27の分子量決定の標準物質として使用
した。 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 吸収極大280nm付近に、吸収極小は250nm付近
に存在する。 Ｇ） 等電点： pI＝3.6±0.1 Ｈ） 阻害剤の影響： プロテアーゼＦ−−１−HM−27のフイブリ
ン塊のフイブリン分解活性に対する種々の酵素阻
害剤の影響を検討した。すなわち各種の阻害剤水
溶液（４mg／ml）20μをプロテアーゼＦ−−
１−HM−27水溶液（2.5μg／ml）80mlと混合し、
37℃で10分間保温した後、反応液30μをとりフ
イブリン塊のフイブリン分解活性を測定した。そ
の結果を第２表に示した。
んど検出されないことを意味する（以下、同じ意
味である。） Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲： フイブリン塊を基質として使用したプロテアー
ゼＦ−−１−HM−27のフイブリン分解作用の
至適PHは第１図に示したように約８付近であつ
た。また、フイブリン塊を基質としてのPH安定範
囲は第２図に示したようにPH５〜12でほぼ安定で
あつた。PH安定性は37℃で60分間放置した後のプ
ロテアーゼＦ−−１−HM−27の残存活性を測
定することによつて決定した。 Ｃ） 作用適温の範囲： PH7.8のフイブリン塊を用い、種々の温度で２
時間反応させたときのプロテアーゼＦ−−１−
HM−27のフイブリン分解作用の変化を第３図に
示した。作用適温は30〜60℃の範囲内であり、最
適温度約50℃付近であつた。 Ｄ） 種々の温度による失活の条件： プロテアーゼＦ−−１−HM−27をPH7.8、
各種の温度で60分間保温した後のフイブリン塊の
フイブリン分解作用の残存活性を第４図に示し
た。これよりプロテアーゼＦ−−１−HM−27
は70℃で60分間保温することによつて完全に失活
することが分る。 Ｅ） 分子量： 32400±2000（SDSポリアクリルアミドゲル電気
泳動法によつて測定した。）： 牛血清アルブミン（分子量：67000）、オブアル
ブミン（分子量：43000）及びキモトリプシノー
ゲンＡ（分子量：25000）をプロテアーゼＦ−−
１−HM−27の分子量決定の標準物質として使用
した。 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 吸収極大280nm付近に、吸収極小は250nm付近
に存在する。 Ｇ） 等電点： pI＝3.6±0.1 Ｈ） 阻害剤の影響： プロテアーゼＦ−−１−HM−27のフイブリ
ン塊のフイブリン分解活性に対する種々の酵素阻
害剤の影響を検討した。すなわち各種の阻害剤水
溶液（４mg／ml）20μをプロテアーゼＦ−−
１−HM−27水溶液（2.5μg／ml）80mlと混合し、
37℃で10分間保温した後、反応液30μをとりフ
イブリン塊のフイブリン分解活性を測定した。そ
の結果を第２表に示した。
【表】
この表より明らかなようにプロテアーゼＦ−
−１−HM−27は、セリン試薬のジフルオロホス
フエート、プロテアーゼ阻害剤のリマ豆トリプシ
ンインヒビター、大豆トリプシンインヒビター、
アンチパイン、ロイペプチン及びトランジロール
（商品名バイエル社製品以下同じ）によつて完全
に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及びト
ランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカ
ルボン酸によつてかなり阻害されるが、イプシロ
ン−アミノカプロン酸、キモスタチン及びペプス
タチンによりある程度阻害される結果を示した。 しかしながら、二価陽イオンキレート化剤であ
るエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（以下
EDTAと略称する。）及びSH試薬のＮ−エチル
マレイミドは活性を阻害しなかつた。 Ｉ） アミノ酸組成：
−１−HM−27は、セリン試薬のジフルオロホス
フエート、プロテアーゼ阻害剤のリマ豆トリプシ
ンインヒビター、大豆トリプシンインヒビター、
アンチパイン、ロイペプチン及びトランジロール
（商品名バイエル社製品以下同じ）によつて完全
に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及びト
ランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカ
ルボン酸によつてかなり阻害されるが、イプシロ
ン−アミノカプロン酸、キモスタチン及びペプス
タチンによりある程度阻害される結果を示した。 しかしながら、二価陽イオンキレート化剤であ
るエチレンジアミン四酢酸ジナトリウム（以下
EDTAと略称する。）及びSH試薬のＮ−エチル
マレイミドは活性を阻害しなかつた。 Ｉ） アミノ酸組成：
【表】
プロテアーゼＦ−−１−HM−27の0.2mg相
当を内部標準のノルロイシンとともに0.5mlに希
釈し6N塩酸を加え、110℃で24時間加水分解した
後、アミノ酸自動分析装置で分析した。 Ｊ） 元素分析値： Ｃ 48.61％、Ｈ 6.58％、Ｎ 14.75％、Ｓ
2.03％ 次に、白色無定形粉末で新規なプロテアーゼＦ
−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及び
Ｆ−−HM−64のそれぞれの理化学的性質につ
いては、プロテアーゼＦ−−１−HM−27の項
に記載した測定法と同一の方法により測定した。
以下にこれらの５種のプロテアーゼの理化学的性
質を列記する。 A′） 活性と基質特異性： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
の種々の基質に対する作用活性を第４表に示し
た。
当を内部標準のノルロイシンとともに0.5mlに希
釈し6N塩酸を加え、110℃で24時間加水分解した
後、アミノ酸自動分析装置で分析した。 Ｊ） 元素分析値： Ｃ 48.61％、Ｈ 6.58％、Ｎ 14.75％、Ｓ
2.03％ 次に、白色無定形粉末で新規なプロテアーゼＦ
−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及び
Ｆ−−HM−64のそれぞれの理化学的性質につ
いては、プロテアーゼＦ−−１−HM−27の項
に記載した測定法と同一の方法により測定した。
以下にこれらの５種のプロテアーゼの理化学的性
質を列記する。 A′） 活性と基質特異性： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
の種々の基質に対する作用活性を第４表に示し
た。
【表】
Ｆ−Ｉ−１−HM−54は、フイブリン分解活性
を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し、カ
ゼイン、TAMe及びBTEeに作用する。TLMe及
びＳ−2444にはわずかに作用するが、BAMe及
びＳ−2251にはほとんど作用しない。 Ｆ−Ｉ−１−HM−15は、フイブリン塊に対し
てフイブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン
活性化活性を有し、カゼイン、TAMe及びBTEe
に作用する。TLMe及びＳ−2444にはわずかに作
用するが、BAMe及びＳ−2251にはほとんど作
用しない。 Ｆ−−HM−64は、フイブリン塊に対してフ
イブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性
化活性を有し、カゼインに作用し、TAMeには
やや作用する。TLMe及びＳ−2444にはわずかに
作用し、Ｓ−2251にはごくわずかに作用するが、
BAMe及びBTEeにはほとんど作用しない。 前記に示すとおり、これら３種の新規プロテア
ーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−
15及びＦ−−HM−64の基質特異性は若干その
活性作用を異にする。前記の各３種の新規プロテ
アーゼの各基質に対する加水分解作用活性の強弱
の表現用語は、その酵素単位（μ／mg）が１以上
のとき作用する。同じく0.1以上１未満の範囲の
ときはやや作用する。 同じく0.01以上0.1未満の範囲のときはわずか
に作用する。 同じく0.001以上0.01未満の範囲のときはごく
わずかに作用する。 同じく0.001未満のほとんど検出されないとき
は第１表及び第４表中にN.D.と示し、ほとんど
作用しないと表現して使い分けた。 このような基質特異性の活性表現は第１表にお
いても同じ意味である。 B′） 至適PH及び安定PH範囲： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−HM−15及びＦ−−HM−64の至
適PH及び安定PH範囲は第５図から第１０図までに
それぞれ示した。すなわち、プロテアーゼＦ−Ｉ
−１−HM−54（第５図）及びＦ−Ｉ−２−HM
−15（第６図）の至適PHはそれぞれ８〜10付近に
あり、プロテアーゼＦ−−１−HM−64（第７
図）の至適PHは７〜８付近にあつた。 そして、プロテアーゼＦ−−１−HM−54
（第８図）及びＦ−Ｉ−２−HM−15（第９図）の
PH安定範囲はPH４〜12でほぼ安定であり、プロテ
アーゼＦ−−HM−64（第１０図）のPH安定範
囲はPH５〜12でほぼ安定であつた。 C′） 作用適温の範囲： ３種のプロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ
−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64の作用
適温の範囲は第１１図から第１３図までにそれぞ
れ示した。すなわちプロテアーゼＦ−Ｉ−１−
HM−54（第１１図）、Ｆ−Ｉ−２−HM−15（第
１２図）及びＦ−−HM−64（第１３図）の３
種の酵素は、いずれも作用適温が30〜60℃の範囲
であり、最適温度は約50〜60℃であつた。 D′） 種々の温度による失活の条件： ５種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
のPH7.8における各種温度で60分間保温した後の
フイブリン塊のフイブリン分解作用の残存活性を
第１４図から第１６図までに示した。プロテアー
ゼＦ−Ｉ−１−HM−54（第１４図）、Ｆ−Ｉ−２
−HM−15（第１５図）及びＦ−−HM−64（第
１６図）のいずれも70℃で60分間保温することに
よつて完全に失活することが分る。なお、第１図
及び第５図ないし第７図の白丸はリン酸緩衝液、
黒丸はトリス−グリシン緩衝液を表わし、第２図
及び第８図ないし第１０図の白丸は酢酸緩衝液、
黒丸はリン酸緩衝液、三角はトリス−グリシン緩
衝液を示す。 E′） 分子量： 分子量は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した。結果は次のとおりであつ
た。 Ｆ−Ｉ−１−HM−54 27500±2000 Ｆ−Ｉ−２−HM−15 27000±2000 Ｆ−−HM−64 27800±2000 F′） 紫外線吸収スペクトル： プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−−
２−HM−15及びＦ−−HM−64の吸収極大は
いずれも280nm付近にあり、吸収極小はいずれも
250nm付近にあつた。 G′） 等電点： プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54の等電点は
pI＝4.0±0.1；プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−
15の等電点はpI＝3.9±0.1；プロテアーゼＦ−
−HM−64の等電点はpI＝3.8±0.1；であつた。 H′） 阻害剤の影響： 前記Ｆ−−１−HM−27の場合の測定法にお
いて、Ｆ−−１−HM−27の水溶液（2.5μg／
ml）の代わりにプロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−
54水溶液（12.5μg／ml）；プロテアーゼＦ−Ｉ−
２−HM−15水溶液（12.5μg／ml）；プロテアー
ゼＦ−−HM−64水溶液（25μg／ml）のそれぞ
れの各酵素水溶液80μを用い、そのほかは同じ
ように操作してプロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
に対する各種阻害剤の影響を測定した。 その結果を第５表に示した。これより明らかな
ように、プロテアーゼＦ−−１−HM−54は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート及びＮ−エチルマレイミドによつて完全
に阻害され、ロイペプチン及び大豆トリプシンイ
ンヒビターによつてかなり阻害され、キモスタチ
ン、ｔ−AMCHA及び卵白トリプシンインヒビ
ターによつてある程度阻害されるが、EDTA、
ペプスタチン、アンチパイン、トラジロール及び
イプシロン−アミノカプロン酸には全く阻害され
なかつた。プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15
は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロ
ホスフエート及びＮ−エチルマレイミドによつて
完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及
びロイペプチンによつてかなり阻害され、アンチ
パイン、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタ
チン、イプシロン−アミノカプロン酸、キモスタ
チン、EDTA及びｔ−AMCHAによつてある程
度阻害されるがトラジロールには全く阻害されな
かつた。プロテアーゼＦ−−HM−64は、リマ
豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホスフエ
ート、Ｎ−エチルマレイミド及び大豆トリプシン
インヒビターによつて完全に阻害され、卵白トリ
プシンインヒビター、トラジロール、ペプスタチ
ン、ｔ−AMCHA及びキモスタチンによつてか
なり阻害され、アンチパイン及びイプシロン−ア
ミノカプロン酸によつてある程度阻害されるが、
EDTA及びロイペプチンには全く阻害されなか
つた。 なお、完全に阻害されるとは、第５表中の相対
活性値が０の場合であり、かなり阻害されるとは
相対活性値が50％未満であり、ある程度阻害され
るとは相対活性値が50％以上であり、全く阻害さ
れないとは相対値が100の場合と表現を使い分け
た。この表現は前記第２表の場合も同じ意味であ
る。
を有し、プラスミノーゲン活性化活性を有し、カ
ゼイン、TAMe及びBTEeに作用する。TLMe及
びＳ−2444にはわずかに作用するが、BAMe及
びＳ−2251にはほとんど作用しない。 Ｆ−Ｉ−１−HM−15は、フイブリン塊に対し
てフイブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン
活性化活性を有し、カゼイン、TAMe及びBTEe
に作用する。TLMe及びＳ−2444にはわずかに作
用するが、BAMe及びＳ−2251にはほとんど作
用しない。 Ｆ−−HM−64は、フイブリン塊に対してフ
イブリン分解活性を有し、プラスミノーゲン活性
化活性を有し、カゼインに作用し、TAMeには
やや作用する。TLMe及びＳ−2444にはわずかに
作用し、Ｓ−2251にはごくわずかに作用するが、
BAMe及びBTEeにはほとんど作用しない。 前記に示すとおり、これら３種の新規プロテア
ーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM−
15及びＦ−−HM−64の基質特異性は若干その
活性作用を異にする。前記の各３種の新規プロテ
アーゼの各基質に対する加水分解作用活性の強弱
の表現用語は、その酵素単位（μ／mg）が１以上
のとき作用する。同じく0.1以上１未満の範囲の
ときはやや作用する。 同じく0.01以上0.1未満の範囲のときはわずか
に作用する。 同じく0.001以上0.01未満の範囲のときはごく
わずかに作用する。 同じく0.001未満のほとんど検出されないとき
は第１表及び第４表中にN.D.と示し、ほとんど
作用しないと表現して使い分けた。 このような基質特異性の活性表現は第１表にお
いても同じ意味である。 B′） 至適PH及び安定PH範囲： ３種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−HM−15及びＦ−−HM−64の至
適PH及び安定PH範囲は第５図から第１０図までに
それぞれ示した。すなわち、プロテアーゼＦ−Ｉ
−１−HM−54（第５図）及びＦ−Ｉ−２−HM
−15（第６図）の至適PHはそれぞれ８〜10付近に
あり、プロテアーゼＦ−−１−HM−64（第７
図）の至適PHは７〜８付近にあつた。 そして、プロテアーゼＦ−−１−HM−54
（第８図）及びＦ−Ｉ−２−HM−15（第９図）の
PH安定範囲はPH４〜12でほぼ安定であり、プロテ
アーゼＦ−−HM−64（第１０図）のPH安定範
囲はPH５〜12でほぼ安定であつた。 C′） 作用適温の範囲： ３種のプロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ
−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64の作用
適温の範囲は第１１図から第１３図までにそれぞ
れ示した。すなわちプロテアーゼＦ−Ｉ−１−
HM−54（第１１図）、Ｆ−Ｉ−２−HM−15（第
１２図）及びＦ−−HM−64（第１３図）の３
種の酵素は、いずれも作用適温が30〜60℃の範囲
であり、最適温度は約50〜60℃であつた。 D′） 種々の温度による失活の条件： ５種の新規プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
のPH7.8における各種温度で60分間保温した後の
フイブリン塊のフイブリン分解作用の残存活性を
第１４図から第１６図までに示した。プロテアー
ゼＦ−Ｉ−１−HM−54（第１４図）、Ｆ−Ｉ−２
−HM−15（第１５図）及びＦ−−HM−64（第
１６図）のいずれも70℃で60分間保温することに
よつて完全に失活することが分る。なお、第１図
及び第５図ないし第７図の白丸はリン酸緩衝液、
黒丸はトリス−グリシン緩衝液を表わし、第２図
及び第８図ないし第１０図の白丸は酢酸緩衝液、
黒丸はリン酸緩衝液、三角はトリス−グリシン緩
衝液を示す。 E′） 分子量： 分子量は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により測定した。結果は次のとおりであつ
た。 Ｆ−Ｉ−１−HM−54 27500±2000 Ｆ−Ｉ−２−HM−15 27000±2000 Ｆ−−HM−64 27800±2000 F′） 紫外線吸収スペクトル： プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−−
２−HM−15及びＦ−−HM−64の吸収極大は
いずれも280nm付近にあり、吸収極小はいずれも
250nm付近にあつた。 G′） 等電点： プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54の等電点は
pI＝4.0±0.1；プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−
15の等電点はpI＝3.9±0.1；プロテアーゼＦ−
−HM−64の等電点はpI＝3.8±0.1；であつた。 H′） 阻害剤の影響： 前記Ｆ−−１−HM−27の場合の測定法にお
いて、Ｆ−−１−HM−27の水溶液（2.5μg／
ml）の代わりにプロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−
54水溶液（12.5μg／ml）；プロテアーゼＦ−Ｉ−
２−HM−15水溶液（12.5μg／ml）；プロテアー
ゼＦ−−HM−64水溶液（25μg／ml）のそれぞ
れの各酵素水溶液80μを用い、そのほかは同じ
ように操作してプロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−
54、Ｆ−Ｉ−２−HM−15及びＦ−−HM−64
に対する各種阻害剤の影響を測定した。 その結果を第５表に示した。これより明らかな
ように、プロテアーゼＦ−−１−HM−54は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート及びＮ−エチルマレイミドによつて完全
に阻害され、ロイペプチン及び大豆トリプシンイ
ンヒビターによつてかなり阻害され、キモスタチ
ン、ｔ−AMCHA及び卵白トリプシンインヒビ
ターによつてある程度阻害されるが、EDTA、
ペプスタチン、アンチパイン、トラジロール及び
イプシロン−アミノカプロン酸には全く阻害され
なかつた。プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15
は、リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロ
ホスフエート及びＮ−エチルマレイミドによつて
完全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及
びロイペプチンによつてかなり阻害され、アンチ
パイン、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタ
チン、イプシロン−アミノカプロン酸、キモスタ
チン、EDTA及びｔ−AMCHAによつてある程
度阻害されるがトラジロールには全く阻害されな
かつた。プロテアーゼＦ−−HM−64は、リマ
豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホスフエ
ート、Ｎ−エチルマレイミド及び大豆トリプシン
インヒビターによつて完全に阻害され、卵白トリ
プシンインヒビター、トラジロール、ペプスタチ
ン、ｔ−AMCHA及びキモスタチンによつてか
なり阻害され、アンチパイン及びイプシロン−ア
ミノカプロン酸によつてある程度阻害されるが、
EDTA及びロイペプチンには全く阻害されなか
つた。 なお、完全に阻害されるとは、第５表中の相対
活性値が０の場合であり、かなり阻害されるとは
相対活性値が50％未満であり、ある程度阻害され
るとは相対活性値が50％以上であり、全く阻害さ
れないとは相対値が100の場合と表現を使い分け
た。この表現は前記第２表の場合も同じ意味であ
る。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
J′） 元素分析値：
１） プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54の元素
分析値： Ｃ 48.93％ Ｈ 6.65％ Ｎ 15.95％ Ｓ 1.34％ ２） プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15の元素
分析値： Ｃ 46.15％ Ｈ 6.64％ Ｎ 16.02％ Ｓ 2.05％ ３） プロテアーゼＦ−−HM−64の元素分析
値： Ｃ 48.23％ Ｈ 6.53％ Ｎ 15.93％ Ｓ 1.43％ 本発明の新規なプロテアーゼＦ−−１−HM
−27、Ｆ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM
−15及びＦ−−HM−64の４種の酵素は、前記
したようにいずれも優れたフイブリン塊のフイブ
リン分解活性を有し、またプラスミノーゲン活性
化活性を有することが分つた。すなわち、本発明
の４種の新規プロテアーゼは、本発明者等がはじ
めてミミズから抽出、単離して得た安定な新規酵
素であり、優れた線溶活性を有する効果を通して
次に示す臨床効果が期待される。 一般に酵素により繊維素原から転化された繊維
素は、血栓症及び塞栓症発症の重要な原因の一つ
である。本発明の４種の新規プロテアーゼは、前
記の活性作用により末梢動静脈血栓症、肺塞栓
症、冠動脈閉塞症、心筋硬塞症、脳血管閉塞症、
網膜動静脈血栓症、硝子体出血、前房出血等の予
防ならびに治療効果が期待される。 さらに制癌剤との併用により癌に対する併用効
果も期待できると共に、輸血の際の抗凝固剤とし
て、また血管手術における縫合線の塞栓形成防止
又は血液透析における動静脈シヤントの長期機能
維持にも効果が期待される。 次に本発明の各種新規プロテアーゼの製法、分
離法、精製法は実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ (1) ミミズ凍結乾燥粉末１Kgに10の0.1％安息
香酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウム水
溶液を添加し、30℃で72時間かきまぜて抽出し
たのち、濾過し、残留分を３の0.1％安息香
酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウム水溶
液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを合した清澄抽
出液（フイブリン塊に対するフイブリン分解活
性は10倍希釈で450mm2／ml）13を得た。この
抽出液を限外濃縮して液量を0.71とし、これ
にエタノール0.71を加えて沈殿分別後の濾液
に終濃度でエタノール濃度が80％になるように
エタノールを添加し、得られた沈殿をさらにエ
タノールで洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末42g
を得た（このもののフイブリン塊に対するフイ
ブリン分解活性は1322mm2／mgであつた。）該粉
末を精製水1000mlに溶解し、これにDEAE−セ
ルロフアイン（チツソ株式会社製品）カラムク
ロマトグラフイーにて処理し、第１７図に示す
ように新規なプロテアーゼを含むＦ−Ｉ−１、
Ｆ−Ｉ−２、Ｆ−及びＦ−の４分画を得
た。 (2) それぞれの画分を硫安0.6飽和塩析後、得ら
れた沈殿を少量の10mMリン酸緩衝液（PH8.0）
に溶解し、セフアクリルＳ−200によるゲル濾
過処理、ウルトラフイルトレーシヨンによる脱
塩濃縮処理した後、凍結乾燥することによつて
Ｆ−Ｉ−１分画0.209g、Ｆ−Ｉ−２分画0.42g、
Ｆ−分画0.879g、Ｆ−分画1.070gの精製プ
ロテアーゼを得た。これら各分画のフイブリン
塊に対するフイブリン分解活性はＦ−Ｉ−１が
15200mm2／mg、Ｆ−Ｉ−２が12000mm2／mg、Ｆ−
が9290mm2／mg及びＦ−が17620mm2／mgであ
つた。 実施例 ２ 実施例１−(1)と同一の方法によりＦ−Ｉ−１分
画、Ｆ−Ｉ−２分画、Ｆ−分画及びＦ−分画
を得たのち、Ｆ−Ｉ−１分画及びＦ−Ｉ−２分画
のそれぞれを10mMリン酸緩衝液（PH8.0）で平
衡化したDEAE−セルロフアインカラムに通液
し、活性区分を吸着せしめた後、同緩衝液で食塩
０〜100mMの濃度勾配にて活性区分の溶出を行
い得られた活性区分を集め、さらにセフアデツク
スＧ−75のゲル濾過を行うことによりポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動として単一な精製品のＦ−
Ｉ−１−HM−54は0.07g及びＦ−Ｉ−２−HM
−15は0.06gを得た。Ｆ−分画は硫安0.3飽和濃
度にて平衡化したトヨパールHW−55（東洋ソー
ダ製品）カラムに通し、活性画分を吸着せしめ、
硫安0.3〜0.1飽和の濃度勾配で溶出を行い、活性
区分を集め脱塩し、このものを10mM−リン酸緩
衝液（PH6.0）で平衡化したヘキシル−セフアロ
ースカラムに通液し、活性区分を吸着せしめた
後、同緩衝液で食塩の０〜15mMの濃度勾配にて
活性区分の溶出を行い、活性区分を集め、セフア
デツクスＧ−75でゲル濾過を行いポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一な精製品のＦ−
−HM−64は0.1gを得た。Ｆ−分画は20mMリ
ン酸緩衝液（PH8.0）にて平衡化した卵白トリプ
シンインヒビター（シグマ社製品）セフアロース
アフイニテイ担体カラムに通液し、活性画分を吸
着せしめた後、1M食塩を含む同緩衝液及び0.1M
酢酸緩衝液（PH5.0）で洗浄を行つた後、0.5Mア
ルギニン及び1M食塩を含む酢酸緩衝液（PH5.0）
にて活性画分を溶出しＦ−画分を得た。該Ｆ−
画分をさらに硫安0.3飽和溶液にて平衡化した
トヨパールHW−55カラムに通液し活性画分を吸
着せしめ、硫安0.3飽和〜0.1飽和の濃度勾配で溶
出を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気
泳動において単一な精製品のＦ−−１−HM−
27は0.07g及びその他の画分0.06gを得た（第１８
図）。
分析値： Ｃ 48.93％ Ｈ 6.65％ Ｎ 15.95％ Ｓ 1.34％ ２） プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15の元素
分析値： Ｃ 46.15％ Ｈ 6.64％ Ｎ 16.02％ Ｓ 2.05％ ３） プロテアーゼＦ−−HM−64の元素分析
値： Ｃ 48.23％ Ｈ 6.53％ Ｎ 15.93％ Ｓ 1.43％ 本発明の新規なプロテアーゼＦ−−１−HM
−27、Ｆ−Ｉ−１−HM−54、Ｆ−Ｉ−２−HM
−15及びＦ−−HM−64の４種の酵素は、前記
したようにいずれも優れたフイブリン塊のフイブ
リン分解活性を有し、またプラスミノーゲン活性
化活性を有することが分つた。すなわち、本発明
の４種の新規プロテアーゼは、本発明者等がはじ
めてミミズから抽出、単離して得た安定な新規酵
素であり、優れた線溶活性を有する効果を通して
次に示す臨床効果が期待される。 一般に酵素により繊維素原から転化された繊維
素は、血栓症及び塞栓症発症の重要な原因の一つ
である。本発明の４種の新規プロテアーゼは、前
記の活性作用により末梢動静脈血栓症、肺塞栓
症、冠動脈閉塞症、心筋硬塞症、脳血管閉塞症、
網膜動静脈血栓症、硝子体出血、前房出血等の予
防ならびに治療効果が期待される。 さらに制癌剤との併用により癌に対する併用効
果も期待できると共に、輸血の際の抗凝固剤とし
て、また血管手術における縫合線の塞栓形成防止
又は血液透析における動静脈シヤントの長期機能
維持にも効果が期待される。 次に本発明の各種新規プロテアーゼの製法、分
離法、精製法は実施例にて詳細に説明する。 実施例 １ (1) ミミズ凍結乾燥粉末１Kgに10の0.1％安息
香酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウム水
溶液を添加し、30℃で72時間かきまぜて抽出し
たのち、濾過し、残留分を３の0.1％安息香
酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウム水溶
液で洗浄し、抽出液と洗浄液とを合した清澄抽
出液（フイブリン塊に対するフイブリン分解活
性は10倍希釈で450mm2／ml）13を得た。この
抽出液を限外濃縮して液量を0.71とし、これ
にエタノール0.71を加えて沈殿分別後の濾液
に終濃度でエタノール濃度が80％になるように
エタノールを添加し、得られた沈殿をさらにエ
タノールで洗浄後、真空乾燥し、乾燥粉末42g
を得た（このもののフイブリン塊に対するフイ
ブリン分解活性は1322mm2／mgであつた。）該粉
末を精製水1000mlに溶解し、これにDEAE−セ
ルロフアイン（チツソ株式会社製品）カラムク
ロマトグラフイーにて処理し、第１７図に示す
ように新規なプロテアーゼを含むＦ−Ｉ−１、
Ｆ−Ｉ−２、Ｆ−及びＦ−の４分画を得
た。 (2) それぞれの画分を硫安0.6飽和塩析後、得ら
れた沈殿を少量の10mMリン酸緩衝液（PH8.0）
に溶解し、セフアクリルＳ−200によるゲル濾
過処理、ウルトラフイルトレーシヨンによる脱
塩濃縮処理した後、凍結乾燥することによつて
Ｆ−Ｉ−１分画0.209g、Ｆ−Ｉ−２分画0.42g、
Ｆ−分画0.879g、Ｆ−分画1.070gの精製プ
ロテアーゼを得た。これら各分画のフイブリン
塊に対するフイブリン分解活性はＦ−Ｉ−１が
15200mm2／mg、Ｆ−Ｉ−２が12000mm2／mg、Ｆ−
が9290mm2／mg及びＦ−が17620mm2／mgであ
つた。 実施例 ２ 実施例１−(1)と同一の方法によりＦ−Ｉ−１分
画、Ｆ−Ｉ−２分画、Ｆ−分画及びＦ−分画
を得たのち、Ｆ−Ｉ−１分画及びＦ−Ｉ−２分画
のそれぞれを10mMリン酸緩衝液（PH8.0）で平
衡化したDEAE−セルロフアインカラムに通液
し、活性区分を吸着せしめた後、同緩衝液で食塩
０〜100mMの濃度勾配にて活性区分の溶出を行
い得られた活性区分を集め、さらにセフアデツク
スＧ−75のゲル濾過を行うことによりポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動として単一な精製品のＦ−
Ｉ−１−HM−54は0.07g及びＦ−Ｉ−２−HM
−15は0.06gを得た。Ｆ−分画は硫安0.3飽和濃
度にて平衡化したトヨパールHW−55（東洋ソー
ダ製品）カラムに通し、活性画分を吸着せしめ、
硫安0.3〜0.1飽和の濃度勾配で溶出を行い、活性
区分を集め脱塩し、このものを10mM−リン酸緩
衝液（PH6.0）で平衡化したヘキシル−セフアロ
ースカラムに通液し、活性区分を吸着せしめた
後、同緩衝液で食塩の０〜15mMの濃度勾配にて
活性区分の溶出を行い、活性区分を集め、セフア
デツクスＧ−75でゲル濾過を行いポリアクリルア
ミドゲル電気泳動において単一な精製品のＦ−
−HM−64は0.1gを得た。Ｆ−分画は20mMリ
ン酸緩衝液（PH8.0）にて平衡化した卵白トリプ
シンインヒビター（シグマ社製品）セフアロース
アフイニテイ担体カラムに通液し、活性画分を吸
着せしめた後、1M食塩を含む同緩衝液及び0.1M
酢酸緩衝液（PH5.0）で洗浄を行つた後、0.5Mア
ルギニン及び1M食塩を含む酢酸緩衝液（PH5.0）
にて活性画分を溶出しＦ−画分を得た。該Ｆ−
画分をさらに硫安0.3飽和溶液にて平衡化した
トヨパールHW−55カラムに通液し活性画分を吸
着せしめ、硫安0.3飽和〜0.1飽和の濃度勾配で溶
出を行うことによりポリアクリルアミドゲル電気
泳動において単一な精製品のＦ−−１−HM−
27は0.07g及びその他の画分0.06gを得た（第１８
図）。
第１図ないし第４図は、フイブリン塊に対する
フイブリン分解活性でみたプロテアーゼＦ−−
１−HM−27の至適PH、PH安定性、作用適温及び
温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第５図、第８
図、第１１図及び第１４図は、フイブリン塊に対
するフイブリン分解活性でみた新規プロテアーゼ
Ｆ−Ｉ−１−HM−54の至適PH、PH安定性、作用
適温及び温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第６
図、第９図、第１２図及び第１５図は、フイブリ
ン塊に対するフイブリン分解活性でみた新規プロ
テアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15の至適PH、PH安定
性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示すグラ
フ、第７図、第１０図、第１３図及び第１６図は
フイブリン塊に対するフイブリン分解活性でみた
新規プロテアーゼＦ−−HM−64の至適PH、PH
安定性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示す
グラフ、第１７図はミミズ抽出液をアルコール沈
降処理した後、DEAE−セルロフアインクロマト
グラフイー処理して得られるフイブリン塊に対す
るフイブリン分解活性でみた本発明の新規プロテ
アーゼの分画パターンを表わすグラス、第１８図
は、ミミズ抽出液をアルコール沈降処理した後、
DEAE−セルロフアインクロマトグラフイー処理
して得られるＦ−分画について、さらにトヨパ
ールHW−55カラムクロマトグラフイー処理して
得られるフイブリン塊に対するフイブリン分解活
性、Ｓ−2444分解活性及びＳ−2251分解活性でみ
た本発明の新規プロテアーゼＦ−−１−HM−
27及びそれ以外の分画パターンを表わすグラフで
ある。
フイブリン分解活性でみたプロテアーゼＦ−−
１−HM−27の至適PH、PH安定性、作用適温及び
温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第５図、第８
図、第１１図及び第１４図は、フイブリン塊に対
するフイブリン分解活性でみた新規プロテアーゼ
Ｆ−Ｉ−１−HM−54の至適PH、PH安定性、作用
適温及び温度安定性をそれぞれ示すグラフ、第６
図、第９図、第１２図及び第１５図は、フイブリ
ン塊に対するフイブリン分解活性でみた新規プロ
テアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15の至適PH、PH安定
性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示すグラ
フ、第７図、第１０図、第１３図及び第１６図は
フイブリン塊に対するフイブリン分解活性でみた
新規プロテアーゼＦ−−HM−64の至適PH、PH
安定性、作用適温及び温度安定性をそれぞれ示す
グラフ、第１７図はミミズ抽出液をアルコール沈
降処理した後、DEAE−セルロフアインクロマト
グラフイー処理して得られるフイブリン塊に対す
るフイブリン分解活性でみた本発明の新規プロテ
アーゼの分画パターンを表わすグラス、第１８図
は、ミミズ抽出液をアルコール沈降処理した後、
DEAE−セルロフアインクロマトグラフイー処理
して得られるＦ−分画について、さらにトヨパ
ールHW−55カラムクロマトグラフイー処理して
得られるフイブリン塊に対するフイブリン分解活
性、Ｓ−2444分解活性及びＳ−2251分解活性でみ
た本発明の新規プロテアーゼＦ−−１−HM−
27及びそれ以外の分画パターンを表わすグラフで
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末
状プロテアーゼＦ−−１−HM−27。 Ａ） 活性及び基質特異性： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用、プ
ラスミノーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トシ
ル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩、Ｎ−
ａ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンメチルエステル塩酸
塩、Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギ
ニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩及びＨ−Ｄ−バ
リル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニトロア
ニリド・ジ塩酸塩に対する強い作用を有するが、
Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル及
びＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル
に対する作用を有しない。 Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲 フイブリン塊を基質として使用したときのフイ
ブリン分解作用の至適PH約８付近、PH安定範囲５
〜12。 Ｃ） 作用適温範囲： PH7.8のフイブリン塊に対してのフイブリン分
解反応における作用適温30〜60℃、最適温度約50
℃。 Ｄ） 失活条件： 70℃に60分間保持すると完全に失活する。 Ｅ） 分子量： 32400±2000 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 280nm付近に吸収極大、250nm付近に吸収極小
を示す。 Ｇ） 等電点： pI＝3.6±0.1 Ｈ） 阻害剤の影響： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート、大豆トリプシンインヒビター、アンチ
パイン、ロイペプチン及びトラジロールにより完
全に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及び
トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサン
カルボン酸によりかなり阻害され、ε−アミノカ
プロン酸、キモスタチン及びペプスタチンにより
ある程度阻害されるが、エチレンジアミン四酢酸
ジナトリウム塩及びＮ−エチルマレイミドでは実
質的に阻害されない。 Ｉ） アミノ酸組成： 【表】 Ｊ） 元素分析値： Ｃ 48.61％、Ｈ 6.58％、Ｎ 14.75％、Ｓ
2.03％。 ２ 以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末
状プロテアーゼＦ−Ｉ−１−HM−54。 Ａ） 活性及び基質特異性： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用、プ
ラスミノーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トシ
ル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステルに対
する強い作用を有するが、Ｎ−ａ−ｐ−トシル−
Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩及びＬ−ピログ
ルタミル−Ｌ−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−
ニトロアニリド塩酸塩にはわずかに作用し、Ｎ−
ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル及びＨ
−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−ｐ−
ニトロアニリド・ジ塩酸塩にはほとんど作用しな
い。 Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲 フイブリン塊を基質として使用したときのフイ
ブリン分解作用の至適PH約８〜10、PH安定範囲４
〜12。 Ｃ） 作用適温範囲： PH7.8のフイブリン塊に対してのフイブリン分
解反応における作用適温30〜60℃、最適温度約50
℃〜60℃。 Ｄ） 失活条件： 70℃に60分間保持すると完全に失活する。 Ｅ） 分子量： 27500±2000。 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 280nm付近に吸収極大、250nm付近に吸収極小
を示す。 Ｇ） 等電点： pI＝4.0±0.1。 Ｈ） 阻害剤の影響： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート及びＮ−エチルマレイミドによつて完全
に阻害され、ロイペプチン及び大豆トリプシンイ
ンヒビターによつてかなり阻害され、キモスタチ
ン、トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキ
サンカルボン酸及び卵白トリプシンインヒビター
によつてある程度阻害されるが、エチレンジアミ
ン四酢酸ジナトリウム、ペプスタチン、アンチパ
イン、トランジオール及びε−アミノカプロン酸
では阻害されない。 Ｉ） アミノ酸組成： 【表】 【表】 Ｊ） 元素分析値： Ｃ 48.93％、Ｈ 6.65％、Ｎ 15.95％、Ｓ
1.34％。 ３ 以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末
状プロテアーゼＦ−Ｉ−２−HM−15。 Ａ） 活性及び基質特異性： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用、プ
ラスミノーゲン活性化作用、カゼイン、ｐ−トシ
ル−Ｌ−アルギニンメチルエステル塩酸塩及びＮ
−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステルに対
する強い作用を有するが、Ｎ−ａ−ｐ−トシル−
Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩及びＬ−ピログ
ルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニト
ロアニリド塩酸塩にはわずかに作用し、Ｎ−ベン
ゾイル−Ｌ−アラニンメチルエステル及びＨ−Ｄ
−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン−ｐ−ニト
ロアニリド・ジ塩酸塩にはほとんど作用しない。 Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲： フイブリン塊を基質として使用したフイブリン
分解作用の至適PH約８〜10、PH安定範囲４〜12。 Ｃ） 作用適温範囲： PH7.8のフイブリン塊に対しての作用適温30〜
60℃、最適温度約50〜60℃。 Ｄ） 失活条件： 70℃に60分間保持すると完全に失活する。 Ｅ） 分子量： 27000±2000。 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 280nm付近に吸収極大、250nm付近に吸収極小
を示す。 Ｇ） 等電点： pI＝3.9±0.1。 Ｈ） 阻害剤の影響： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート及びＮ−エチルマレイミドによつて完全
に阻害され、卵白トリプシンインヒビター及びロ
イペプチンによりかなり阻害され、アンチパイ
ン、大豆トリプシンインヒビター、ペプスタチ
ン、ε−アミノカプロン酸、キモスタチン、エチ
レンジアミン四酢酸ジナトリウム及びトランス−
４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸によ
つてある程度阻害されるが、トランジオールでは
阻害されない。 Ｉ） アミノ酸組成： 【表】 れない。
Ｊ） 元素分析値： Ｃ 46.15％、Ｈ 6.64％、Ｎ 16.02％、Ｓ
2.05％。 ４ 以下の理化学的性質を有する白色無定形粉末
状プロテアーゼＦ−−HM−64。 Ａ） 活性及び基質特異性： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用、プ
ラスミノーゲン活性化作用、カゼインに対する強
い作用、ｐ−トシル−Ｌ−アルギニンメチルエス
テル塩酸塩に対する作用を有するが、Ｎ−ａ−ｐ
−トシル−Ｌ−リジンメチルエステル塩酸塩及び
Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニン
−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩にはわずかに作用
し、Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジン
−ｐ−ニトロアニリド・ジ塩酸塩にはごくわずか
に作用し、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アラニンメチル
エステル及びＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチ
ルエステルにはほとんど作用しない。 Ｂ） 至適PH及び安定PH範囲 フイブリン塊を基質として使用したときのフイ
ブリン分解作用の至適PH約７〜８、PH安定範囲５
〜12。 Ｃ） 作用適温範囲： PH7.8のフイブリン塊に対してのフイブリン分
解反応における作用適温30〜60℃、最適温度約50
℃〜60℃。 Ｄ） 失活条件： 70℃に60分間保持すると完全に失活する。 Ｅ） 分子量： 27800±2000。 Ｆ） 紫外線吸収スペクトル： 280nm付近に吸収極大、250nm付近に吸収極小
を示す。 Ｇ） 等電点： pI＝3.8±0.1 Ｈ） 阻害剤の影響： フイブリン塊に対するフイブリン分解作用は、
リマ豆トリプシンインヒビター、ジフルオロホス
フエート、Ｎ−エチルマレイミド及び大豆トリプ
シンインヒビターにより完全に阻害され、卵白ト
リプシンインヒビター、トラジロール、ペプスタ
チン、キモスタチン及びトランス−４−（アミノ
メチル）シクロヘキサンカルボン酸によつてかな
り阻害され、アンチパイン及びε−アミノカプロ
ン酸によりある程度阻害されるが、エチレンジア
ミン四酢酸ジナトリウム及びロイペプチンでは阻
害されない。 Ｉ） アミノ酸組成： 【表】 Ｊ） 元素分析値： Ｃ 48.23％、Ｈ 6.53％、Ｎ 15.93％、Ｓ
1.43％。
Priority Applications (10)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57173669A JPS5963184A (ja) | 1982-10-02 | 1982-10-02 | 新規なプロテア−ゼ |
| AU16293/83A AU1629383A (en) | 1982-10-02 | 1983-06-27 | Earthworm tissue protease thrombolytic agents |
| US06/508,163 US4568545A (en) | 1982-10-02 | 1983-06-27 | Thrombolytic agent |
| CA000431387A CA1198697A (en) | 1982-10-02 | 1983-06-28 | Thrombolytic agent |
| EP83106288A EP0105092A3 (en) | 1982-10-02 | 1983-06-28 | A thrombolytic agent |
| DK300883A DK300883A (da) | 1982-10-02 | 1983-06-29 | Fremgangsmaade til fremstilling af thrombolytiske midler |
| FI832383A FI832383A7 (fi) | 1982-10-02 | 1983-06-29 | Trombosyyttinen aine. |
| KR1019830002990A KR840006438A (ko) | 1982-10-02 | 1983-06-30 | 혈전용해제 |
| ES523754A ES8504246A1 (es) | 1982-10-02 | 1983-06-30 | Un metodo para la preparacion de las proteasas fibrinoliticamente activas |
| NO832399A NO832399L (no) | 1982-10-02 | 1983-06-30 | Trombolytisk middel |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57173669A JPS5963184A (ja) | 1982-10-02 | 1982-10-02 | 新規なプロテア−ゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5963184A JPS5963184A (ja) | 1984-04-10 |
| JPH0429350B2 true JPH0429350B2 (ja) | 1992-05-18 |
Family
ID=15964899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57173669A Granted JPS5963184A (ja) | 1982-10-02 | 1982-10-02 | 新規なプロテア−ゼ |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5963184A (ja) |
| KR (1) | KR840006438A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR890004724A (ko) * | 1987-09-17 | 1989-05-09 | 히사시 미하라 | 신규 프로테아제 제제(製劑) |
| JP2006096673A (ja) * | 2004-09-28 | 2006-04-13 | Mihara Lr Kenkyusho:Kk | ミミズ製品の製造方法 |
-
1982
- 1982-10-02 JP JP57173669A patent/JPS5963184A/ja active Granted
-
1983
- 1983-06-30 KR KR1019830002990A patent/KR840006438A/ko not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR840006438A (ko) | 1984-11-30 |
| JPS5963184A (ja) | 1984-04-10 |
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