【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
本発明は、血液や血漿中から悪性物質や悪性細
胞を除去する血液浄化吸着材に関し、特に直接灌
流法を適用する全血用血液浄化に適した吸着材に
関する。さらに詳しくは、癌、免疫増殖性症候
群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス、アレルギー、臓器移植時の拒絶反応等の生体
免疫機能に関係した疾患および現象、あるいは腎
炎等の腎臓病、肝炎等の肝臓病などにおいて、血
液、血漿等の体液中に発現し、疾患の原因あるい
は進行と密接な関係をもつていると考えられる悪
性物質や悪性細胞を、体液中より吸着、除去する
吸着材に関する。
従来、体液浄化治療用吸着材には、主に肝臓病
用に人工肝臓として活性炭あるいは活性炭を親水
性高分子でコートしたものが用いられてきた。し
かし、幾多の疾患において、疾患の原因あるいは
進行と密接な関係にある種々の悪性物質や悪性細
胞が知られるようになり、さらには該悪性物質や
悪性細胞を体液中より選択的に除去する要請が高
まつてきたが、活性炭をベースとする吸着材は、
その吸着対象物質が限られ、本要請に答えられな
いのが現状である。
また吸着材による体液浄化治療においては、生体
に対して異物である活性炭等の吸着材と血液等の
体液が接触することにより誘起される血液凝固が
大きな問題であつた。この血液凝固を防止するた
めには、活性炭を親水性高分子でコートするなど
の試みがなされているが、十分な抗血栓性は得ら
れず、抗凝固剤であるヘパリンを血液中に供給し
て血液凝固を防止しているのが現状である。この
場合、多量のヘパリンを使用することから、場合
によつては出血などの副作用が発生するなどの問
題を孕んでいる。
本発明者らは、悪性物質の選択的吸着、除去の
要請に答えるため鋭意研究の結果、担体に被吸着
物質と科学的な選択的相互作用をなす特別な物質
を化学結合により保持させてなる種々の吸着材を
見い出し、先に特許出願した（特願昭56−7152、
特願昭56−76776、特願昭56−159444、特願昭56
−18923）。本発明は、先の発明に関して、上記の
血液凝固の問題点につき鋭意研究を行つた結果、
到達したものである。
すなわち、本発明者らは、上記の如き従来技術
に基づく吸着材と血液との接触による血液凝固の
問題点に鑑み、体液中の悪性物質や悪性細胞を選
択的に吸着し、かつ接触しても血液を凝固させる
ことのない吸着材について鋭意研究を進めた結
果、負電荷を有する不溶性担体に、被吸着物質と
結合可能な官能部位を含有する有機化合物（以
下、有機リガンドと称す）を結合させてなる吸着
材が、上記の問題点を解決することを見い出し、
本発明を完成するに到つた。
本発明で言う負電荷を有する不溶性担体とは、
担体自身が血液、体液等の中性電解液中で負電荷
を示すものである。本発明において、負電荷を有
する不溶性担体の負電荷密度は、同一不溶性担体
上の陽電荷の官能部位数を相殺した後の残余負電
荷数が、吸着材の表面積当り少なくとも
0.02μmol／m2であることが血小板との相互作用
を削減する効果を期待できる。さらに、よりすぐ
れた抗血栓を示し、かつ内因系凝固活性化を低レ
ベルに抑制できる負電荷密度の好ましい範囲は、
0.2μmol／m2から2500μmol／m2であり、さらに好
ましい範囲は、0.5μmol／m2から500μmol／m2で
ある。
以上の負電荷を有する不溶性担体を具体的に例
示すると、負電荷官能基としては、スルホン酸
基、カルボン酸基、リン酸エステル基等が好まし
く用いられ、それを有する担体には、天然高分子
由来のものにあつては、アミノヘキシルサクシニ
ル化セルロース、スルホエチル−セルロース、リ
ン酸エステルセルロース、カルボキシヘキシル−
アガロース等があり、一方、合成高分子では、カ
ルボキシメチル−ポリアクリルアミド系担体や、
スチレンジビニルベンゼンのような高分子基体
に、スルホン酸基やカルボキシル基のような陽イ
オン交換基を結合させたイオン交換樹脂等を例示
できる。本発明においては、吸着材の表面当りの
負電荷密度が少なくとも0.02μmol／m2有ればよ
く、以上に例示したものに限定されるものではな
い。
本発明で用いられる負電荷を有する不溶性担体
は、親水性担体、疏水性担体いずれも使用できる
が、疏水性担体を用いる場合には、時に担体への
アルブミンの非特異的吸着が生じるため、親水性
担体の方が好ましい結果を与える。
また、負電荷を有する不溶性担体のより好まし
い材質は、非選択的な吸着が少なく、さらに内因
系凝固因子に対して比較的不活性であり、官能基
の導入の容易なこと等の見地より、有機高分子よ
りなるものである。すなわち、有機高分子よりな
る親水性担体が好ましく用いられる。
負電荷を有する不溶性担体の形状は、粒子状、
繊維状、中空糸状、膜状等のいずれの公知の形状
も用いうるが、有機リガンドの保持量、吸着材と
しての取扱い性よりみて、粒子状、繊維状のもの
が好ましく、特に粒子状のものが好ましい結果を
与える。
球状または粒子状担体の平均粒径は25〜2500μ
ｍのものを利用できるが、その非表面積（吸着材
としての吸着能力）と体液の流通面より、50〜
1500μｍのものが特に好ましい。
粒子状担体としては、悪性物質が可溶性体液成
分である場合には多孔性粒子、特に多孔性重合体
を用いることが好ましい。本発明で用いられる多
孔性重合体粒子は、その表面に負電荷を有する官
能基を多く持ち、かつ、排除限界分子量（タンパ
ク質）としては、本発明の目的吸着物質の分子量
が２万より免疫複合体特にIgM免疫複合体の場合
には1000万に達するので、２〜1000万が好まし
い。本発明の目的に最も汎用的な排除限界分子量
は10〜500万である。
繊維状担体を用いる場合には、その繊維径が
0.02デニールないし10デニール、より好ましくは
0.1デニールないし５デニールの範囲にあるもの
がよい。繊維径が大きすぎる場合には、グロブリ
ン系化合物の吸着量および吸着速度が低下する
し、小さすぎる場合には、凝固系の活性化、血球
粘着、目づまりをおこしやすい。
本発明における負電荷を有する不溶性担体の比
表面積は５m2／ｇ以上が好ましく。55m2／ｇ以上
がより望ましい。比表面積の測定法はいろいろあ
るが、本発明では、最も一般的な窒素ガスによる
BET法で求めた。また比表面積測定に用いるサ
ンプルは十分乾燥しておかなければならないが、
乾燥しにくい担体にあつては、水にぬれた担体を
アセトンと平衡にした後、60℃以下で減圧乾燥し
て測定用サンプルとした。
本発明の担体に保持させる有機リガンドは、目
的に応じて自由に選べるが、その中の一部を例示
する。
全身性エリテマトーデス治療用としては、抗核
抗体、抗DNA抗体の吸着除去用に、アデニン、
グアニン、シトシン、ウラシル、チミン等のモ
ノ、ジ、トリヌクレオチドのホモポリマー、また
はコポリマー、天然に存在するDNA、RNA等の
核酸を用いることができる。また血中に存在する
DNA、RNA、ENAの吸着除去用に、抗一本鎖
DNA抗体、抗二本鎖DNA抗体、抗RNA抗体、
抗ENA抗体等の抗核酸抗体、メチル化アルブミ
ンアクチノマイシンＤ等の塩基性化合物を用いる
ことができる。さらに血中の免疫複合体の吸着除
去用には、Clq等の補体成分、プロテインＡ等の
特異タンパク質、抗ヘビ−チエイン不変部第２相
抗体、リウマチ因子等の免疫複合体に対する抗体
を用いることができる。
慢性関節リウマチ、悪性関節リウマチ治療用と
しては、尿素、塩酸グアニジン、メチカプトエタ
ノール、界面活性剤、有機溶剤等の化学的変性
（凝集）方法、熱、超音波、ガスバブリング等の
物理的変性（凝集）方法により変性された変性γ
−グロブリン、変性イムノグロブリン、凝集γ−
グロブリン、凝集イムノグロブリン、イムノグロ
ブリンのFc部、イムノグロブリンのヘビ−チエ
イン不変部第２相およびそれらの前記変性方法に
より変性体等のリウマチ因子に対する抗原様物
質、および抗リウマチ因子抗体を用いることがで
きる。またリウマチの免疫複合体除去用には、
Clq等の補体成分、プロテインＡ等の特異タンパ
ク質、抗ヘビ−チエイン不変部第２相抗体、リウ
マチ因子等の免疫複合体に対する抗体を用いるこ
とができる。
橋本病治療用には、サイログロブリン、甲状腺
のミクロソーム分画成分を用いることができる。
重症筋無力症治療用には、神経筋のアセチルコリ
ンレセプタ−分画成分を用いることができる。
糸球体腎炎治療用には、糸球体基底膜成分、特
発性血小板減少性紫斑病治療用には、血小板膜成
分、血小板顆粒分画成分、クツシング症候群治療
用にはトランスコーチゾン、抗コーチゾン抗体を
用いることができる。
肝炎の予防、治療用には、Ａ型肝炎ウイルス、
Ｂ型肝炎ウイルス等のウイルス表面抗原に対する
抗体を用いることができる。
高血圧治療用には、抗アンジオテンシン抗
体、高脂血症治療用にはヘパリン、抗リボプロテ
イン抗体を用いることができる。
リンパ球異常に基づく免疫疾患治療用には、抗
Ｂセル抗体、抗サブレツサーＴ抗体、抗ヘルパ−
Ｔ抗体等の抗リンパ球抗体や、抗単球抗体、抗ナ
チユラルキラー細胞抗体、抗顆粒球抗体を用いる
ことができる。
赤血球や血小板の膜疾患には。抗赤血球抗体や
抗血小板抗体を用いることができる。
乳ガン等のガン治療用には、プロテインＡ、抗
イムノグロブリン抗体や免疫抑制因子に対する抗
体を用いることができる。
本発明に用いることができるリガンドは、以上
の例示に限定されるものではなく、コングニチニ
ン、コンカナバリンＡ、フイトヘマアグルチニン
等のレクチン、核酸、アミノ酸、脂質、糖脂質、
プロタミン、ヘパリン、抗原、抗体、酵素、基
質、補酵素、糖タンパク質等の被吸収物質と結合
可能な公知の物質を用いることができる。
また、本発明の担体に２種以上のリガンドを保
持させて用いることもできる。さらにはリガンド
を保持した担体を２種以上併用して用いることも
できる。
本発明において、有機リガンドを不溶性担体の
表面に固定する方法は、共有結合、イオン結合、
物理吸着、包埋あるいは担体表面への沈澱不溶化
等あらゆる公知の方法を用いることができるが、
これらの化合物の溶出性から考えると、共有結合
により、固定、不溶化して用いることが好まし
い。そのため通常固定化酵素、アフイニテイクロ
マトグラフイで用いられる公知の不溶性担体の活
性化方法およびリガンドとの結合方法を用いるこ
とができる。また、必要に応じて不溶性担体とリ
ガンドの間に任意の長さの分子（スペーサー）を
導入して使用することもできる。
共有結合を形成しうる官能基としては、例え
ば、水酸基、アミノ基、カルボキシル基、エボキ
シ基、クロロホルミル基、アジド基、ホルミル
基、プロモアセチル基、イソシアネート基、シア
ノ基、酸クロリド基、酸無水物基、ジアゾコウム
基などが挙げられるが、これらの官能基の反応性
は低く、直接リガンドと共有結合を形成させるこ
とが困難な場合は、公知の活性化法で反応性の高
い官能基に変換した後、リガンドと共有結合を形
成させてもよい。例えば、担体の水酸基はハロゲ
ン化シアン法、エピクロルヒドリン法、ビスエポ
キシド法、ハロゲン化トリアジン法、ブロモアセ
チルブロミド法、エチルクロロホルマート法、カ
ルボニルジイミダゾール法等により活性化でき
る。これらの官能基は有機リガンドのアミノ基、
水酸基、カルボキシル基、チオール基等の求核反
応基と反応し共有結合を形成できる。
以上の要素よりなる本発明における吸着材の製
造法は、その構成要素の結合順序を規定したもの
ではない。具体的には、負電荷を持たない担体
に、被吸着物質に対して不活性な負電荷を持つ官
能基を導入することで得られた担体も、本発明の
一態様を示すものである、さらに負電荷を持つ官
能基と有機リガンドの結合順序も、製造上の難易
に応じ選択できるものである。また、有機リガン
ドの導入法においても、有機リガンドをモノマに
結合して重合を行う方法や、高分子物質の後架橋
による不溶性担体化の際、同時反応を行い、目的
を達成することができる。
すなわち、本発明は、吸着材中の負電荷と有機
リガンドが存在すればよく、その製造方法に左右
されるものではない。
本発明の吸着材は、体液の導出入口を備えた容
器内に充填保持して使用することができる。
図面は本発明の吸着材を使用した吸着装置の一
例を示すものであり、円筒２の一端開口部に、内
側にフイルター３を張つたパツキング４を介して
体液導入口５を有するキヤツプ６をネジ嵌合し、
円筒２の他端開口部に内側にフイルター３′を張
つたパツキング４′を介して体液導出口７を有す
るキヤツプ８をネジ嵌合して容器を形成し、フイ
ルター３および３′の間〓に吸着材を充填保持さ
せて吸着材層９を形成してなるものである。
吸着材層９には、本発明の該吸着材を単独で充
填してもよく、他の吸着材と混合もしくは積層し
てもよい。他の吸着材としては、例えば、幅広い
吸着能を有する活性炭等を用いることができる。
これにより吸着材の相乗効果によるより広範な臨
床効果が期待できる。吸着材層９の容積は、体外
循環に用いる場合、50〜400ml程度が適当である。
本発明の装置を体外循環で用いる場合には、大
略次の二通りの方法がある。一つには、体内から
取り出した血液を直接該装置に通過させ、浄化す
る方法であり、他の一つは体内から取り出した血
液を遠心分離機もしくは膜型血漿分離器を使用し
て血液中の特定の成分を分離した後、その成分中
に含まれる悪性物質や悪性細胞を除去する方法で
ある。このとき、体液の通液方法としては、臨床
上の必要に応じ、あるいは設備の装置状況の応じ
て、連続的に通液してもよいし、また断続的に通
液使用してもよい。
本発明の吸着材は、以上に述べてきたように、
自己血液、自己血漿等の体液を浄化、再生する一
般的な用法に適用可能であり、癌、免疫増殖性症
候群、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデ
ス等の膠原病、重症筋無力症等の自己免疫疾患、
気管支喘息のようなアレルギー性疾患、臓器移植
時の拒絶反応等の生体免疫機能に関係した疾患お
よび現象、乾癬、白癬等の皮膚疾患、あるいは腎
炎等の腎臓病、肝炎等の肝臓病や血液病などの体
外循環治療に、吸着材の基本的特性である吸着能
力を犠牲にすることなく、高い能力を維持したま
ま優れた抗血栓を示すので、直接体外循環による
全血の血液浄化が実施できる血液浄化吸着体であ
る。
以下実施例により、本発明の実施の態様をより
詳細に説明する。
実施例 １
酢酸ビニル100ｇ、トリアリルイソシアヌレー
ト41ｇ、酢酸エチル100ｇ、ポリ酢酸ビニル（重
合度500）７ｇおよび２，2′−アゾビスイソブチ
ロニトリル3.6ｇよりなる均一混合液と、ポリビ
ニルアルコール１重量％、リン酸二水素ナトリウ
ム二水和物0.05重量％およびリン酸水素二ナトリ
ウム十二水和物1.5重量％を溶解した水0.4とを
フラスコに入れ、65℃で18時間、さらに75℃で５
時間加熱攪拌して懸濁重合を行い、粒状共重合体
を得た。この重合体をカセイソーダで加水分解
し、ポリビニルアルコール架橋重合体が得られ
た。この重合体の平均粒径は350μｍであつた。
この重合体を担体として用い、以下の方法で吸着
材を作成した。すなわち、乾燥した担体15ｇをジ
メチルスルホキシド180mlおよびエピクロルヒド
リン120mlからなる溶液中に懸濁し、30％水酸化
ナトリウム水溶液15mlを加え、30℃に75時間攪拌
させて、エポキシ活性化担体を得た。
該ゲルのエポキシ基結合量は、１mlのゲルにつ
き35μmolであつた。該エポキシ結合ゲルを用い、
アデニンを結合させて吸着材を作成した。アデニ
ンを0.025mol／になるようにPH9.8の炭酸バツ
フアーに溶かした溶液を調製し、該エポキシ結合
ゲル20mlに40mlの割合で加え、50℃で20時間反応
させた。過剰の活性基は0.1mol／のグリシン
でブロツキングした。アデニンの固定量は、反応
液中に残存するアデニンの260nmの吸収から算出
した。該吸着材のアデニン結合量は31μmol／ml
であつた。吸着材は十分に水洗した後、生理食塩
水で洗浄、脱水し、評価試験対象例に供した。
さらに、この吸着材を10mlとり、凍結乾燥後、
常法により、クロルスルホン酸による吸着体水酸
基への硫酸エステル化を行う。これを充分食塩水
にて中和した吸着体は、残留水酸基当量の定量
と、N2吸着量より、比表面積80m2／ｇ、硫酸エ
ステル基の密度が3.0μeq／m2のものが得られた。
また、吸着体の排除限界分子量は100万であつた。
このようにして得られた吸着体を実施例１とし
て吸着実験と抗血液凝固性を評価した。
吸着実験は、全身性エリテマトーデス患者血漿
３容と吸着材１容を混合し、37℃、２時間インキ
ユベーシヨンにより行つた。
抗DNA抗体価は、ホルマリン固定鶏血球に、
DNAを感作したものと、処理または未処理の患
者血漿の段階希釈液との混和によつて生じる凝集
反応（室温）の有無により、陽性か陰性かを判断
し、陽性を示す最高希釈倍数をもつて抗体価を求
めた。測定には「DNAテスト」〔富士臓器製薬(株)
製〕のキツトを用いた。
抗核抗体価は、細胞を塗抹したスライドガラス
に段階希釈した検体（一次抗体）を滴下し、抗原
−抗体反応を行い、ベルオキシダーゼ標識抗ヒト
免疫グロブリン抗体（二次抗体）を滴下し、酵素
の呈色反応を光学顕微鏡で観察した。測定には、
「エンザイムANAテスト」〔(株)医学生物学研究所
製〕のキツトを用いた。陽性を示す最高希釈倍数
をもつて抗体価を表示した。
The present invention relates to a blood purification adsorbent for removing malignant substances and malignant cells from blood and plasma, and particularly to an adsorbent suitable for whole blood blood purification using a direct perfusion method. More specifically, diseases and phenomena related to the body's immune system, such as cancer, immunoproliferative syndrome, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, allergies, rejection reactions during organ transplants, kidney diseases such as nephritis, and liver diseases such as hepatitis. The present invention relates to an adsorbent that adsorbs and removes malignant substances and malignant cells from body fluids that are expressed in blood, plasma, and other body fluids during diseases, and are thought to be closely related to the cause or progression of diseases. Conventionally, activated carbon or activated carbon coated with a hydrophilic polymer has been used as an adsorbent for body fluid purification treatment, mainly as an artificial liver for liver diseases. However, in many diseases, various malignant substances and malignant cells have become known to be closely related to the cause or progression of the disease, and there is a growing need to selectively remove such malignant substances and malignant cells from body fluids. has been increasing, but adsorbents based on activated carbon are
At present, this request cannot be met because the substances that can be adsorbed are limited. Furthermore, in body fluid purification treatments using adsorbents, blood coagulation induced by contact between adsorbents such as activated carbon, which are foreign substances to living organisms, and body fluids such as blood has been a major problem. In order to prevent this blood coagulation, attempts have been made to coat activated carbon with hydrophilic polymers, but sufficient antithrombotic properties have not been achieved, and the anticoagulant heparin is supplied into the blood. Currently, blood clotting is prevented by In this case, since a large amount of heparin is used, there are problems such as side effects such as bleeding in some cases. As a result of intensive research in response to the demands for selective adsorption and removal of malignant substances, the present inventors have developed a structure in which a carrier retains a special substance that chemically and selectively interacts with the adsorbed substance through chemical bonds. He discovered various adsorbents and filed a patent application (patent application 1987-7152,
Patent application 1987-76776, Patent application 1982-159444, Patent application 1982
−18923). The present invention was developed as a result of intensive research into the above-mentioned blood coagulation problems regarding the previous invention.
It has been reached. That is, in view of the problem of blood coagulation due to contact between the adsorbent and blood based on the prior art as described above, the present inventors have developed a method for selectively adsorbing malignant substances and malignant cells in body fluids and by contacting them. As a result of intensive research into adsorbent materials that do not coagulate blood, we have discovered that an organic compound containing a functional site capable of binding to the adsorbed substance (hereinafter referred to as an organic ligand) is bound to an insoluble carrier with a negative charge. We discovered that an adsorbent made of
The present invention has now been completed. In the present invention, the insoluble carrier having a negative charge is
The carrier itself exhibits a negative charge in a neutral electrolyte such as blood or body fluid. In the present invention, the negative charge density of the negatively charged insoluble carrier is such that the number of residual negative charges after offsetting the number of positively charged functional sites on the same insoluble carrier is at least per surface area of the adsorbent.
A concentration of 0.02 μmol/m 2 can be expected to have the effect of reducing interaction with platelets. Furthermore, a preferable range of negative charge density that can exhibit better antithrombotic effects and suppress endogenous coagulation activation to a low level is as follows:
The range is from 0.2 μmol/m 2 to 2500 μmol/m 2 , and a more preferred range is from 0.5 μmol/m 2 to 500 μmol/m 2 . To give specific examples of the above-mentioned negatively charged insoluble carriers, as the negatively charged functional groups, sulfonic acid groups, carboxylic acid groups, phosphoric ester groups, etc. are preferably used. Regarding those derived from aminohexyl succinylated cellulose, sulfoethyl cellulose, phosphate ester cellulose, carboxyhexyl cellulose
There are agarose, etc., while synthetic polymers include carboxymethyl-polyacrylamide carriers,
Examples include ion exchange resins in which cation exchange groups such as sulfonic acid groups and carboxyl groups are bonded to a polymer base such as styrene divinylbenzene. In the present invention, it is sufficient that the negative charge density per surface of the adsorbent is at least 0.02 μmol/m 2 , and is not limited to those exemplified above. The insoluble carrier having a negative charge used in the present invention can be either a hydrophilic carrier or a hydrophobic carrier, but when a hydrophobic carrier is used, non-specific adsorption of albumin to the carrier sometimes occurs. Sexual carriers give more favorable results. In addition, more preferable materials for the negatively charged insoluble carrier are: It is made of organic polymer. That is, a hydrophilic carrier made of an organic polymer is preferably used. The shape of the negatively charged insoluble carrier is particulate,
Any known shape such as fibrous, hollow fiber, or membrane-like may be used, but from the viewpoint of the amount of organic ligand retained and ease of handling as an adsorbent, particulate or fibrous forms are preferable, and particulate forms are particularly preferred. gives the desired result. The average particle size of spherical or particulate carrier is 25-2500μ
m can be used, but due to its non-surface area (adsorption ability as an adsorbent) and circulation of body fluids,
Particularly preferred is one with a diameter of 1500 μm. As the particulate carrier, when the malignant substance is a soluble body fluid component, it is preferable to use porous particles, particularly porous polymers. The porous polymer particles used in the present invention have a large number of negatively charged functional groups on their surfaces, and have an exclusion limit molecular weight (protein) of 20,000 to 20,000 for immune complexes. In particular, in the case of IgM immune complexes, the number reaches 10 million, so 2 to 10 million is preferable. The most common exclusion limit molecular weight for purposes of this invention is 100,000 to 5,000,000. When using a fibrous carrier, the fiber diameter is
0.02 denier to 10 denier, more preferably
It is preferable to use one in the range of 0.1 denier to 5 denier. If the fiber diameter is too large, the adsorption amount and rate of globulin compounds will be reduced, and if it is too small, activation of the coagulation system, blood cell adhesion, and clogging are likely to occur. The specific surface area of the negatively charged insoluble carrier in the present invention is preferably 5 m 2 /g or more. 55m 2 /g or more is more desirable. There are various methods for measuring the specific surface area, but in this invention, the most common method is to use nitrogen gas.
Obtained using the BET method. In addition, the sample used for specific surface area measurement must be sufficiently dry.
For carriers that are difficult to dry, the water-wet carrier was equilibrated with acetone and then dried under reduced pressure at 60°C or lower to prepare a sample for measurement. The organic ligand to be supported on the carrier of the present invention can be freely selected depending on the purpose, and some of them are exemplified below. For the treatment of systemic lupus erythematosus, adenine,
Homopolymers or copolymers of mono-, di-, and trinucleotides such as guanine, cytosine, uracil, and thymine, and naturally occurring nucleic acids such as DNA and RNA can be used. also present in the blood
Anti-single-stranded for adsorption removal of DNA, RNA, and ENA.
DNA antibody, anti-double-stranded DNA antibody, anti-RNA antibody,
Anti-nucleic acid antibodies such as anti-ENA antibodies and basic compounds such as methylated albumin actinomycin D can be used. Furthermore, for the adsorption and removal of immune complexes in the blood, antibodies against immune complexes such as complement components such as Clq, specific proteins such as protein A, anti-snake chain constant phase 2 antibodies, and rheumatoid factor are used. be able to. For the treatment of rheumatoid arthritis and malignant rheumatoid arthritis, chemical denaturation (aggregation) methods such as urea, guanidine hydrochloride, methicaptoethanol, surfactants, and organic solvents, physical denaturation (coagulation) methods such as heat, ultrasound, and gas bubbling are used. Denatured γ modified by agglutination) method
-Globulin, modified immunoglobulin, aggregated γ-
Globulin, aggregated immunoglobulin, the Fc region of immunoglobulin, the second phase of the snake chain invariant region of immunoglobulin, and antigen-like substances against rheumatoid factor such as denatured forms thereof by the above-mentioned denaturation method, and anti-rheumatoid factor antibodies can be used. can. In addition, for the removal of rheumatoid immune complexes,
Antibodies against immune complexes such as complement components such as Clq, specific proteins such as protein A, anti-snake chain constant region phase 2 antibodies, and rheumatoid factor can be used. Thyroglobulin, a microsomal fraction of the thyroid gland, can be used to treat Hashimoto's disease.
For the treatment of myasthenia gravis, neuromuscular acetylcholine receptor fraction components can be used. Glomerular basement membrane components are used to treat glomerulonephritis, platelet membrane components and platelet granule fraction components are used to treat idiopathic thrombocytopenic purpura, and transcortisone and anticortisone antibodies are used to treat Cushing syndrome. be able to. For the prevention and treatment of hepatitis, hepatitis A virus,
Antibodies against viral surface antigens such as hepatitis B virus can be used. Anti-angiotensin antibodies can be used to treat hypertension, and heparin and anti-riboprotein antibodies can be used to treat hyperlipidemia. Anti-B cell antibodies, anti-sublesser T antibodies, and anti-helper antibodies are used to treat immune diseases based on lymphocyte abnormalities.
Anti-lymphocyte antibodies such as T antibodies, anti-monocyte antibodies, anti-natural killer cell antibodies, and anti-granulocyte antibodies can be used. For membrane diseases of red blood cells and platelets. Anti-erythrocyte antibodies and anti-platelet antibodies can be used. For cancer treatment such as breast cancer, protein A, anti-immunoglobulin antibodies, and antibodies against immunosuppressive factors can be used. Ligands that can be used in the present invention are not limited to the above examples, but include lectins such as congnitinin, concanavalin A, and phytohemaagglutinin, nucleic acids, amino acids, lipids, glycolipids,
Known substances capable of binding to absorbed substances such as protamine, heparin, antigens, antibodies, enzymes, substrates, coenzymes, and glycoproteins can be used. Furthermore, the carrier of the present invention can also be used with two or more types of ligands retained therein. Furthermore, two or more types of carriers holding ligands can be used in combination. In the present invention, methods for immobilizing organic ligands on the surface of an insoluble carrier include covalent bonding, ionic bonding,
Any known method can be used, such as physical adsorption, embedding, or precipitation insolubilization on the surface of the carrier.
Considering the elution properties of these compounds, it is preferable to use them after being immobilized and insolubilized by covalent bonding. Therefore, it is possible to use commonly known methods for activating immobilized enzymes, insoluble carriers used in affinity chromatography, and methods for binding to ligands. Furthermore, if necessary, a molecule (spacer) of arbitrary length can be introduced between the insoluble carrier and the ligand. Examples of functional groups that can form a covalent bond include hydroxyl group, amino group, carboxyl group, epoxy group, chloroformyl group, azide group, formyl group, promoacetyl group, isocyanate group, cyano group, acid chloride group, and acid anhydride group. These functional groups have low reactivity, and if it is difficult to directly form a covalent bond with a ligand, they can be converted to a highly reactive functional group using a known activation method. After that, a covalent bond may be formed with the ligand. For example, the hydroxyl group of the carrier can be activated by a cyanogen halide method, an epichlorohydrin method, a bisepoxide method, a halogenated triazine method, a bromoacetyl bromide method, an ethyl chloroformate method, a carbonyldiimidazole method, or the like. These functional groups are amino groups of organic ligands,
It can react with nucleophilic reactive groups such as hydroxyl groups, carboxyl groups, and thiol groups to form covalent bonds. The method for producing an adsorbent according to the present invention, which is comprised of the above-mentioned elements, does not specify the order in which the constituent elements are combined. Specifically, a carrier obtained by introducing a negatively charged functional group that is inert to an adsorbed substance into a carrier that does not have a negative charge also represents an embodiment of the present invention. Furthermore, the bonding order of the negatively charged functional group and the organic ligand can also be selected depending on the difficulty in production. Furthermore, in the method of introducing an organic ligand, the purpose can be achieved by a method in which the organic ligand is bonded to a monomer and polymerized, or a simultaneous reaction is performed during the formation of an insoluble carrier by post-crosslinking of a polymeric substance. That is, the present invention is not dependent on the manufacturing method, as long as the negative charge and organic ligand are present in the adsorbent. The adsorbent of the present invention can be used by being filled and held in a container equipped with an inlet and outlet for body fluids. The drawing shows an example of an adsorption device using the adsorbent of the present invention, in which a cap 6 having a body fluid inlet 5 is screwed into an opening at one end of a cylinder 2 through a packing 4 with a filter 3 stretched inside. mated,
A cap 8 having a body fluid outlet 7 is screwed into the opening at the other end of the cylinder 2 through a packing 4' with a filter 3' stretched inside, to form a container, and a cap 8 is inserted between the filters 3 and 3'. The adsorbent layer 9 is formed by filling and holding an adsorbent. The adsorbent layer 9 may be filled with the adsorbent of the present invention alone, or may be mixed or laminated with other adsorbents. As other adsorbents, for example, activated carbon having a wide range of adsorption capacities can be used.
As a result, a wider range of clinical effects can be expected due to the synergistic effect of the adsorbent. The appropriate volume of the adsorbent layer 9 is about 50 to 400 ml when used for extracorporeal circulation. When the device of the present invention is used for extracorporeal circulation, there are roughly two methods as follows. One method is to directly pass blood taken from the body through the device for purification, and the other is to use a centrifuge or membrane plasma separator to purify blood taken from the body. This is a method in which specific components are separated and then malignant substances and malignant cells contained in those components are removed. At this time, the method of passing body fluids may be continuous or intermittent depending on clinical needs or equipment conditions of the equipment. As described above, the adsorbent of the present invention has the following features:
It can be used for general purposes to purify and regenerate body fluids such as autologous blood and autologous plasma, and is applicable to cancer, immunoproliferative syndrome, rheumatoid arthritis, collagen diseases such as systemic lupus erythematosus, and autoimmunity such as myasthenia gravis. disease,
Allergic diseases such as bronchial asthma, diseases and phenomena related to the body's immune system such as organ transplant rejection, skin diseases such as psoriasis and ringworm, kidney diseases such as nephritis, liver diseases such as hepatitis, and blood diseases. It shows excellent antithrombotic properties while maintaining high performance without sacrificing the adsorption ability, which is the basic property of adsorbents, for extracorporeal circulation treatment such as blood purification of whole blood through direct extracorporeal circulation. It is a blood purification adsorbent. Embodiments of the present invention will be explained in more detail with reference to Examples below. Example 1 A homogeneous liquid mixture consisting of 100 g of vinyl acetate, 41 g of triallyl isocyanurate, 100 g of ethyl acetate, 7 g of polyvinyl acetate (degree of polymerization 500) and 3.6 g of 2,2'-azobisisobutyronitrile, and 1 g of polyvinyl alcohol % by weight, 0.05% by weight of sodium dihydrogen phosphate dihydrate and 0.4% by weight of water containing 1.5% by weight of disodium hydrogen phosphate dodecahydrate were placed in a flask and heated at 65°C for 18 hours and then at 75°C. 5
Suspension polymerization was carried out by heating and stirring for a period of time to obtain a granular copolymer. This polymer was hydrolyzed with caustic soda to obtain a polyvinyl alcohol crosslinked polymer. The average particle size of this polymer was 350 μm.
Using this polymer as a carrier, an adsorbent was prepared in the following manner. That is, 15 g of the dried carrier was suspended in a solution consisting of 180 ml of dimethyl sulfoxide and 120 ml of epichlorohydrin, 15 ml of a 30% aqueous sodium hydroxide solution was added, and the mixture was stirred at 30° C. for 75 hours to obtain an epoxy activated carrier. The amount of epoxy group bonded in the gel was 35 μmol per 1 ml of gel. Using the epoxy binding gel,
An adsorbent was created by binding adenine. A solution of adenine dissolved in a carbonate buffer of pH 9.8 at a concentration of 0.025 mol was prepared, and 40 ml of the solution was added to 20 ml of the epoxy bonded gel, followed by reaction at 50° C. for 20 hours. Excess active groups were blocked with 0.1 mol/glycine. The amount of adenine immobilized was calculated from the absorption of adenine remaining in the reaction solution at 260 nm. The amount of adenine binding in this adsorbent is 31μmol/ml
It was hot. After thoroughly washing the adsorbent with water, it was washed with physiological saline, dehydrated, and used as an evaluation test subject. Furthermore, take 10ml of this adsorbent, freeze-dry it, and then
The hydroxyl group of the adsorbent is esterified with sulfuric acid using chlorosulfonic acid using a conventional method. The adsorbent that was sufficiently neutralized with saline solution had a specific surface area of 80 m 2 /g and a density of sulfate ester groups of 3.0 μeq/m 2 based on the determination of the residual hydroxyl equivalent and the amount of N 2 adsorption. Ta.
Furthermore, the exclusion limit molecular weight of the adsorbent was 1 million. The thus obtained adsorbent was used as Example 1 and its adsorption experiments and anti-blood coagulation properties were evaluated. The adsorption experiment was conducted by mixing 3 volumes of systemic lupus erythematosus patient plasma and 1 volume of adsorbent, and incubating the mixture at 37°C for 2 hours. Anti-DNA antibody titer was measured using formalin-fixed chicken blood cells.
Positive or negative results are determined based on the presence or absence of an agglutination reaction (at room temperature) that occurs when the sensitized DNA is mixed with a serially diluted solution of treated or untreated patient plasma, and the highest dilution factor that indicates positivity is determined. Then, the antibody titer was determined. For measurement, use "DNA test" [Fuji Organ Pharmaceutical Co., Ltd.]
A kit manufactured by J.D. Co., Ltd. was used. Antinuclear antibody titer is determined by dropping a serially diluted sample (primary antibody) onto a slide glass smeared with cells, performing an antigen-antibody reaction, dropping a peroxidase-labeled anti-human immunoglobulin antibody (secondary antibody), The color reaction was observed using an optical microscope. For measurement,
A kit of "Enzyme ANA Test" [manufactured by Medical and Biological Research Institute, Inc.] was used. The antibody titer was expressed using the highest dilution factor indicating positivity.
【表】
また、この吸着材の抗血液凝固性を評価するた
め、ヒトヘパリン化新鮮血液３容と吸着材１容と
を混合し、２時間振盪したが、フイブリンの析出
は認められなかつた。比較のため硫酸エステル化
反応を施していない対象例の吸着材を用いて、上
記と同じ血液との接触実験を行つたところ、フイ
ブリンの析出が認められた。
以上のように本発明のアデニンをリガンドとす
る負電荷を有する吸着剤は、抗血栓性に優れ、か
つ抗DNA抗体、抗核抗体の吸着除去に有効であ
つた。
実施例 ２
メタクリル酸メチル100ｇ、トリアリルイソシ
アネート41ｇ、酢酸ブチル100ｇ、ｎ−ヘブタノ
ール100ｇ、ポリ酢酸ビニル（重合度500）５ｇお
よび２，2′−アゾビスイソブチロニトリル３ｇよ
りなる均一混合液と、ポリビニルアルコール１重
量％、リン酸二水素ナトリウム二水和物0.05重量
％およびリン酸水素二ナトリウム十二水和物1.5
重量％を溶解した水400mlとをフラスコに入れ、
実施例１と同様に反応を行い、粒状共重合体を得
た。さらに、この重合体をカセーソーダで加水分
解し、ポリメタクリル酸架橋重合体が得られた。
この重合体の平均粒径は330μｍであつた。この
重合体を担体として用い、常法によるカルボン酸
基へのプロテインＡのペプチド結合反応を行つ
た。すなわち、担体10ｇを水溶性カルボジイミド
６ｇ、プロテインA5ｇをPH4.5の150ml水溶液中
で、室温72時間の反応を行つた。得られたプロテ
インＡラニンをリガンドとする吸着体は、リガン
ド保持量1.4meq／ｇ・gelで、比表面積100m2／
ｇ、カルボン酸基密度は12μeq／m2であつた。ま
た、蛋白排除限界分子量は85万であつた。
この吸着材を４mlカラム（Ｌ／Ｄ＝５）に充填
して、ヒト血漿を0.2ml／mm、ヒト全血（ヘパリ
ン添加1200U／100ml血液）を0.5ml／mmでシング
ルパス法にて各１時間通液した。いずれも充填体
積の低下、目づまり、流量低下はみられず、カラ
ム前の圧力計の変化も10〜20mmHgであつた。
通液前後の血漿タンパクおよび血液血球成分の
変動を調べたところ、血漿ではアルブミンの変動
はわずかであり、C3，C4等の補体の減少も少な
かつたが、プロテインＡとグロブリンの相互作用
によりグロブリンを約30％吸着した。全血ではカ
ラムはうすい赤色をおびるにとどまり、残血は極
めて少なかつた。吸着材の表面の光学顕微鏡観察
を行なつたところ、赤色血栓、白色血栓ともに少
なかつた。またカラム通過血の血球数をカウント
したところ、赤血球、血小板、白血球ともに減少
は比較的少なかつた。[Table] Furthermore, in order to evaluate the anti-blood coagulability of this adsorbent, 3 volumes of fresh human heparinized blood and 1 volume of the adsorbent were mixed and shaken for 2 hours, but no fibrin precipitation was observed. For comparison, the same blood contact experiment as above was conducted using the adsorbent of the target example which had not been subjected to the sulfuric acid esterification reaction, and fibrin precipitation was observed. As described above, the negatively charged adsorbent having adenine as a ligand of the present invention had excellent antithrombotic properties and was effective in adsorbing and removing anti-DNA antibodies and anti-nuclear antibodies. Example 2 A homogeneous liquid mixture consisting of 100 g of methyl methacrylate, 41 g of triallyl isocyanate, 100 g of butyl acetate, 100 g of n-hebutanol, 5 g of polyvinyl acetate (degree of polymerization 500), and 3 g of 2,2'-azobisisobutyronitrile. , 1% by weight of polyvinyl alcohol, 0.05% by weight of sodium dihydrogen phosphate dihydrate and 1.5% by weight of disodium hydrogen phosphate dodecahydrate.
Put 400ml of water in which % by weight was dissolved into a flask,
A reaction was carried out in the same manner as in Example 1 to obtain a granular copolymer. Furthermore, this polymer was hydrolyzed with caustic soda to obtain a polymethacrylic acid crosslinked polymer.
The average particle size of this polymer was 330 μm. Using this polymer as a carrier, a peptide bonding reaction of protein A to a carboxylic acid group was carried out by a conventional method. That is, 10 g of carrier, 6 g of water-soluble carbodiimide, and 5 g of protein A were reacted in 150 ml of an aqueous solution of pH 4.5 at room temperature for 72 hours. The obtained adsorbent with protein A lanin as a ligand has a ligand retention capacity of 1.4 meq/g・gel and a specific surface area of 100 m 2 /
g, and the carboxylic acid group density was 12 μeq/m 2 . In addition, the protein exclusion limit molecular weight was 850,000. This adsorbent was packed into a 4 ml column (L/D = 5), and human plasma was added at 0.2 ml/mm and human whole blood (heparin added 1200 U/100 ml blood) was added at 0.5 ml/mm using a single pass method. The solution was passed for an hour. In all cases, no decrease in packing volume, clogging, or decrease in flow rate was observed, and the change in the pressure gauge in front of the column was 10 to 20 mmHg. When we examined changes in plasma proteins and blood cell components before and after fluid passage, we found that in plasma, there was only a slight change in albumin and a small decrease in complements such as C 3 and C 4 , but the interaction between protein A and globulin was small. Approximately 30% of globulin was absorbed by the action. With whole blood, the column was only pale red, and there was very little residual blood. When the surface of the adsorbent was observed using an optical microscope, it was found that there were few red thrombi and white thrombi. Furthermore, when the number of blood cells in the blood passing through the column was counted, there was a relatively small decrease in red blood cells, platelets, and white blood cells.
【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]
図面は本発明の吸着材を容器に充填した吸着装
置の一例を示す模式図である。
The drawing is a schematic diagram showing an example of an adsorption device in which a container is filled with the adsorbent of the present invention.